林 琳，李明明，肖 兵，穆巴熱科·阿迪力，肖金寶

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科，烏魯木齊 830011;2.新疆烏魯木齊市經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)(頭屯河區(qū))第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，烏魯木齊 830023)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是伴有生育障礙并以肥胖、排卵障礙、月經(jīng)及內(nèi)分泌紊亂為主要臨床表現(xiàn)的一類綜合征，是一種內(nèi)分泌代謝疾病，發(fā)病率占全球育齡期女性的5%～11%[1-3]。根據(jù)調(diào)查，PCOS患者在中國不孕人群中所占比例高達(dá)約70%～76%，是無排卵性不孕癥的主要病因之一[4]。PCOS不僅影響患者的生育能力，其伴隨的脂類代謝異常、2型糖尿病、高雄激素血癥等臨床癥狀威脅著女性生命健康[2-3]。PCOS的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，通常與環(huán)境、遺傳及激素等因素有關(guān)。遺傳學(xué)因素在PCOS的發(fā)生中起著十分重要的作用[2]。因此，研究PCOS的遺傳學(xué)病因有助于進(jìn)一步了解PCOS的發(fā)病機(jī)制。本研究以一級親屬患有代謝性疾病的PCOS患者和健康對照組作為研究對象，用基因單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)芯片技術(shù)檢測基因組SNP位點基因多態(tài)性，旨在高通量水平篩選PCOS易感基因，探討其基因多態(tài)性與PCOS之間的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 研究對象 根據(jù)2018年多囊卵巢綜合征中國治療指南，收集2018年1月至2019年12月就診于新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院的289例PCOS患者,以及年齡、體重相匹配的289例健康婦女為對照。PCOS診斷標(biāo)準(zhǔn):月經(jīng)稀發(fā)、閉經(jīng)或不規(guī)則陰道出血，同時符合以下2項中的1項：(1)高雄激素臨床表現(xiàn)或高雄激素血癥；(2)超聲影像顯示為卵巢多囊樣表現(xiàn)，并排除其他引起高雄激素與排卵異常的疾病。健康對照組納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡、體重相配，月經(jīng)規(guī)律，一級親屬患有代謝性疾病(如高血壓、糖尿病、冠心病等)的健康育齡期女性。選取其中隨訪的病史中一級親屬患有代謝異常性疾病的35例PCOS患者和41例健康人群作為研究對象。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，入選患者均簽署知情同意書。

1.2 一般資料收集 收集PCOS患者及健康對照組的相關(guān)臨床資料，包括年齡、體重、身高、空腹血糖、空腹胰島素、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、卵泡刺激素(FSH)、雄激素(T)、黃體生成素(LH)、抗苗勒氏管激素(AMH)，計算體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)、胰島素抵抗指數(shù)(homeostasismodel assessment insulin resistance index,HOMA-IR)。

1.3 儀器及試劑

1.3.1 實驗儀器 全自動核酸提取儀(康為CWE9600)，NanoDrop 2000紫外分光光度儀(美國NanoDrop公司)，BIO-RAD電泳儀(美國BIO-RAD公司)，Newbio Gi-1凝膠成像儀。

1.3.2 實驗試劑 康為世紀(jì)血片DNA提取試劑盒(康為世紀(jì)，CW2557S)，BeadChip Array Infinium Asian Screening Array-24 V1.0(美國illumina，20022508)。

1.4 實驗方法

1.4.1 基因組DNA提取及質(zhì)檢 使用康為世紀(jì)血片DNA提取試劑盒磁珠法提取基因組DNA，NanoDrop 2000紫外分光光度儀進(jìn)行DNA濃度測定，凝膠電泳法觀察DNA純度和完整性。

1.4.2 芯片檢測 illumina芯片操作流程用BeadChip Array Infinium Asian Screening Array-24 V1.0檢測樣本基因型。

1.4.3 候選易感基因和SNP位點的確定 差異位點進(jìn)行annovar注釋，找出差異位點所在基因和對應(yīng)的rs號。用DAVID(the Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery)在線軟件對差異SNP位點注釋到的基因進(jìn)行KEGG pathway富集分析。根據(jù)富集倍數(shù)，P值及富集到的基因數(shù)，再結(jié)合參考文獻(xiàn)選擇Rap1信號通路，用STRING軟件對富集到Rap1信號通路的基因進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(protein protein interaction network，PPI network)分析，篩選關(guān)鍵節(jié)點基因(至少與4個蛋白有相互作用)，用dbSNP數(shù)據(jù)庫查詢關(guān)鍵節(jié)點基因上的差異SNP位點相關(guān)信息及MAF值，MAF值在0.15～0.4之間的SNP位點為候選易感SNP位點，其中剔除基因分型數(shù)據(jù)缺失的SNP位點和位于基因間區(qū)域的SNP位點。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS20.0軟件，符合正態(tài)分布的資料采用t檢驗，不符合正態(tài)分布的用非參數(shù)秩和檢驗，芯片SNP位點差異篩選用卡方檢驗。用SNPStats在線分析軟件進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗及SNP位點logistic回歸分析。用卡方檢驗分析SNP位點不同等位基因在PCOS組與正常對照組中的分布及優(yōu)勢比估計。

2 結(jié) 果

2.1 PCOS組與對照組的臨床資料 PCOS組的空腹胰島素水平、胰島素抵抗指數(shù)、高密度脂蛋白水平、雄激素水平、黃體生成素水平、抗苗勒氏管激素水平高于對照組(P<0.05)，PCOS組的平均年齡及低密度脂蛋白水平低于對照組(P<0.01)，見表1。

表1 PCOS組與對照組的臨床資料(均值±標(biāo)準(zhǔn)差)

2.2 芯片檢測結(jié)果及PCOS組與健康對照組差異SNP位點的篩選 對76例樣本進(jìn)行SNP芯片檢測，總檢測位點637326個，其中PCOS患者和健康對照組比較，有差異的SNP位點1141個(P≤0.001)，其中有差異的SNP位點最多的染色體為1號染色體(chr1)，總共有114個差異SNP位點，占總差異SNP位點10%，差異SNP位點最少的為21號染色體(chr21)，總共有13個差異SNP位點，占總差異SNP位點的1.14%。差異位點進(jìn)行annovar注釋，總注釋到1195個基因。

2.3 差異SNP位點注釋到的基因KEGG pathway富集分析及PPI分析 DAVID在線軟件對差異SNP位點注釋到的1195個基因進(jìn)行KEGG pathway富集分析，結(jié)果總富集到23個信號通路，富集到的基因數(shù)(Count)前10的(P≤0.05)信號通路分別是癌癥信號通路(Pathways in cancer)，神經(jīng)活性配體-受體交互作用信號通路(Neuroactive ligand-receptor interaction)，cAMP信號通路，鈣離子信號通路，Rap1信號通路等(圖1)。用string在線軟件對Rap1信號通路中的19個基因進(jìn)行PPI分析，篩選出來8個關(guān)鍵節(jié)點基因(至少與4個蛋白有相互作用)，分別是INSR、GNAO1、PIK3CD、FGF13，KDR、VEGFC、PLCB4、ANGPT1等(圖2)。對這8個基因上的差異SNP位點進(jìn)行篩選，最后確定的易感基因GNAO1、PIK3CD、FGF13。易感基因GNAO1上的SNP位點rs2587885；PIK3CD上的SNP位點rs6541017，F(xiàn)GF13上的SNP位點rs527687、rs683357和rs7060413，見表2。

表2 易感基因及差異SNP位點信息

圖1 差異SNP位點注釋到的基因KEGG分析TOP10信號通路縱坐標(biāo)為信號通路名稱，橫坐標(biāo)為富集倍數(shù)(紅色)，基因數(shù)量(count，藍(lán)色)及-log P值(綠色)

圖2 RAP1信號通路基因PPI分析

2.4 SNP位點不同等位基因在PCOS組與正常對照組中的分布及優(yōu)勢比估計 分別計算5個SNP位點在76個樣本中的不同基因型頻率，PCOS組和對照組基因型分布Hardy-Weinberg平衡檢驗結(jié)果顯示所有位點均符合Hardy-Weinberg平衡規(guī)律(HWp值>0.05)。見表3。5個SNP位點不同等位基因在對照組與PCOS組中的分布有統(tǒng)計學(xué)差異，rs527687位點A等位基因、rs683357位點G等位基因、rs6541017位點A等位基因、rs2587885位點C等位基因、rs7060413位點G等位基因在PCOS組中的頻率顯著低于對照組，在PCOS組中是保護(hù)因素。見表4。

表3 5個SNP位點基因型分布Hardy-Weinberg平衡檢驗

表4 SNP位點不同等位基因在PCOS組與正常對照組中的分布及優(yōu)勢比估計

2.5 各SNP位點不同基因型與PCOS的發(fā)病風(fēng)險logistic回歸分析 按3種遺傳模型(共顯性模型、顯性模型、隱性模型)進(jìn)行按年齡和BMI值校正后的logistic回歸分析，觀察不同遺傳模型中不同基因型與PCOS發(fā)病風(fēng)險的相關(guān)性，F(xiàn)GF13基因rs527687位點在共顯性模型、顯性模型、隱性模型下不同基因型分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表5。該位點在共顯性模型、顯性模型、隱性模型下均與PCOS發(fā)生有關(guān)。在共顯性模型中相對于AA基因型，CA基因型和CC基因型是PCOS的危險因素。在顯性模型中，C/A-C/C基因型是PCOS的危險因素。在隱性模型中CC基因型是PCOS的危險因素。

表5 各SNP位點logistic回歸分析(按年齡和BMI值校正)

FGF13基因rs683357位點在共顯性模型、顯性模型、隱性模型下不同基因型分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。該位點在共顯性模型、顯性模型下均與PCOS的發(fā)生有關(guān)。在共顯性模型中相對于GG基因型，GA基因型是PCOS的危險因素。在顯性模型中相對于GG基因型，A/G-A/A基因型是PCOS的危險因素。FGF13基因rs7060413位點在共顯性模型、顯性模型、隱性模型下不同基因型分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。該位點在顯性模型中與PCOS的發(fā)病有關(guān)，A/G-A/A基因型是PCOS危險因素。PIK3CD基因rs6541017位點在共顯性模型、顯性模型、隱性模型下不同基因型分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。該位點在在顯性模型中跟PCOS的發(fā)病有關(guān)聯(lián)性，在顯性模型中GA-GG基因型是PCOS危險因素。GNAO1基因rs2587885位點在顯性模型不同基因型分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。該位點在在顯性模型模型中與PCOS的發(fā)生有關(guān)，T/C-T/T基因型是PCOS危險因素。

3 討 論

PCOS的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，通常與環(huán)境、遺傳及激素等因素有關(guān)。PCOS存在家族聚集現(xiàn)象，遺傳學(xué)因素在PCOS的發(fā)生中起著十分重要的作用[2]。因此，研究PCOS的遺傳學(xué)病因有助于進(jìn)一步了解PCOS的發(fā)病機(jī)制。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),一級親屬患有代謝性疾病的健康人群平均年齡較PCOS組高。

選取一級親屬有代謝性疾病的PCOS患者和健康對照組作為研究對象，用美國illumina Infinium Asian Screening Array SNP芯片檢測患者和對照組基因組基因多態(tài)性?？倷z測到的SNP位點637326個，其中PCOS患者和健康組比較有差異的SNP位點1141個，差異SNP位點集中富集到1號染色體上，這表明位于1號染色體上的基因單核苷酸多態(tài)性與PCOS的相關(guān)性可能高于其他染色體基因。隨后篩選PCOS相關(guān)的易感基因和SNP位點，先對差異位點進(jìn)行annovar注釋，總注釋到1195個基因。下一步用DAVID在線軟件對差異SNP位點注釋到的1195個基因進(jìn)行KEGG pathway富集分析，富集到的基因數(shù)(Count)前5的信號通路分別是癌癥信號通路(pathways in cancer)，神經(jīng)活性配體-受體交互作用信號通路(neuroactive ligand-receptor interaction)，cAMP信號通路(cAMP signaling pathway)，鈣離子信號通路(calcium signaling pathway)，Rap1信號通路等。PCOS患者M(jìn)Ⅰ期和MⅡ期卵丘細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究中差異表達(dá)基因KEGG pathway分析結(jié)果顯示，PCOS患者M(jìn)Ⅰ期和MⅡ期卵丘細(xì)胞差異表達(dá)基因也注釋到神經(jīng)活性配體-受體交互作用信號通路和鈣離子信號通路[14-15]。另外一項關(guān)于PCOS的表達(dá)譜數(shù)據(jù)二次分析的研究報道，與對照組比較，在PCOS中差異表達(dá)基因富集到神經(jīng)活性配體-受體交互作用信號通路和cAMP信號通路[16]。通過查詢參考文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)Rap1信號通路中有注釋到跟PCOS相關(guān)的INSR、FGF13[6]、VEGFC[11]等基因。Li等[5]通過PCOS動物模型研究PCOS相關(guān)性miRNA時也發(fā)現(xiàn)PCOS差異表達(dá)miRNA靶基因也注釋到Rap1信號通路。這表明神經(jīng)活性配體-受體交互作用信號通路、cAMP信號通路、鈣離子信號通路、Rap1信號通路基因在表達(dá)水平和單核苷酸多態(tài)性方面都與PCOS有一定的相關(guān)性，有望成為PCOS診治靶點。通過查詢KEGG數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，Rap1信號通路(Entry ID：map04015)與cAMP信號通路和鈣離子信號通路具有相互調(diào)控關(guān)系，cAMP信號通路(Entry ID：map04015)和鈣離子信號通路都參與調(diào)控Rap1信號通路的激活。因此本研究中先選擇偏下游的Rap1信號通路進(jìn)行進(jìn)一步分析。

本研究用string在線軟件對富集到Rap1信號通路的FGFR2、PRKCZ、MAGI3、PARD3、ADCY2、GNAO1、PIK3CD、GRIN2A、FGF13、APBB1IP、KDR、DOCK4、VEGFC、PLCB4、P2RY1、RAPGEF4、ANGPT1、INSR、F2R等基因進(jìn)行PPI分析，篩選出來8個關(guān)鍵節(jié)點基因INSR、GNAO1、PIK3CD、FGF13、KDR、VEGFC、PLCB4、ANGPT1。用dbSNP數(shù)據(jù)庫查詢這8個基因上的差異SNP位點基因組位置、MAF值、突變類型等相關(guān)信息，為排除假陽性,選出頻率較小的等位基因MAF值在0.15～0.4之間的SNP位點為候選易感SNP位點，其中剔除基因分型數(shù)據(jù)缺失的SNP位點和位于基因間區(qū)域的SNP位點。最后確定的易感基因GNAO1、PIK3CD、FGF13，易感基因GNAO1上的SNP位點rs2587885，PIK3CD上的SNP位點rs6541017，F(xiàn)GF13上的SNP位點rs527687、rs683357和rs7060413為易感SNP位點。

成纖維細(xì)胞生長因子13(fibroblast growth factors 13，F(xiàn)GF13)屬于纖維細(xì)胞生長因子(FGF)家族,該家族由18種分泌蛋白和4種細(xì)胞內(nèi)蛋白(FGF11-14)組成,參與調(diào)節(jié)卵巢功能和卵泡發(fā)育。如FGF2促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖并影響卵巢甾體生成。此外，F(xiàn)GF18參與卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡。FGF13在小鼠卵巢的表達(dá)早在1997年就有報道，在牛竇卵泡的黃體、膜和顆粒細(xì)胞中也檢測到FGF13的mRNA表達(dá)。此外，在牛卵巢腔卵泡發(fā)育過程中，卵巢膜細(xì)胞中FGF13 mRNA表達(dá)上調(diào)。Liu等[6]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF13可能參與了PCOS的病理生理過程。但是目前沒有FGF13基因多態(tài)性與PCOS的相關(guān)性研究。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)GF13基因SNP位點rs527687、rs683357和rs7060413基因多態(tài)性與PCOS相關(guān)。

磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3激酶催化亞基delta(PIK3CD)屬于磷酸肌醇3激酶(PI3Ks)家族基因，磷脂酰肌醇3-激酶(PI3Ks)蛋白家族參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)等多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)。PCOS是一種復(fù)雜的內(nèi)分泌疾病，其與內(nèi)分泌紊亂、雄激素過多、不孕、IR、肥胖和糖代謝紊亂有關(guān)。隨著對PCOS的研究越來越多，學(xué)者們開始關(guān)注PCOS與PI3K-Akt信號通路的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)PI3K-Akt信號通路與胰島素抵抗、雄激素分泌、肥胖、卵泡發(fā)育等都相關(guān)[10]。張慧英等[9]研究表明，PCOS患者子宮內(nèi)膜中PI3K/Akt通路過度激活，可能與PCOS患者子宮內(nèi)膜增生和癌變有關(guān)。胰島素抵抗和肥胖可能是PCOS子宮內(nèi)膜PI3K/Akt通路過度激活的高危因素。Zhao等[8]研究發(fā)現(xiàn),荷芪散通過PI3K/Akt通路達(dá)到治療PCOS的作用。這表明PI3K/Akt通路在PCOS發(fā)生發(fā)展中起重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，PIK3CD基因多態(tài)性位點rs6541017在隱性遺傳模型中G/A-G/G基因型相對于AA基因型，是PCOS的危險因素，可能與PCOS的發(fā)病風(fēng)險有關(guān)。

GNAO1基因編碼的蛋白代表氧化石墨烯異三聚體g蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物的亞基。該基因的缺陷是早期發(fā)作癲癇性腦病的原因之一。雖然目前尚無文獻(xiàn)報道GNAO1基因與PCOS有關(guān)，但是通過signor2.0數(shù)據(jù)庫查詢得知，GNAO1上調(diào)TAOK1表達(dá)水平，而TAOK1通過PI3K-Akt信號通路和MAPK信號通路調(diào)控細(xì)胞凋亡和炎癥因子釋放[12]。相關(guān)研究報道，在運(yùn)動障礙疾病中GNAO1通過參與PI3K信號通路的激活而發(fā)揮作用[13]。這表明，GNAO1可能是PCOS易感基因之一。本研究結(jié)果顯示，GNAO1多態(tài)性位點rs2587885在顯性模型中T/C-T/T基因型在PCOS中是危險因素，與PCOS發(fā)病風(fēng)險有關(guān)。

綜上所述，單核苷酸多態(tài)性與一級親屬有代謝性疾病的PCOS具有相關(guān)性的基因主要富集到神經(jīng)活性配體-受體交互作用信號通路、cAMP信號通路、鈣離子信號通路、Rap1信號通路，其中Rap1信號通路中的GNAO1、PIK3CD、FGF13基因可能是一級親屬有代謝性疾病的PCOS患者易感基因，rs2587885，rs6541017，rs527687、rs683357和rs7060413為一級親屬有代謝性疾病的PCOS患者易感SNP位點。本研究在基因單核苷酸多態(tài)性水平進(jìn)一步明確PCOS相關(guān)的信號通路，易感基因和易感SNP位點，但其具體作用機(jī)制需進(jìn)一步深入研究。