董娟，夏夢(mèng)，馬龍，孟慧，林玉婷，蔡令波，劉嘉茵

(南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床生殖醫(yī)學(xué)中心，南京醫(yī)科大學(xué)生殖醫(yī)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210029)

在體外受精過(guò)程中，常規(guī)IVF的受精率約為60%～80%，但是在臨床上仍然存在難以預(yù)測(cè)和不明原因的IVF后完全受精失敗(total fertilization failures，TFF) 以及受精率低下現(xiàn)象，其發(fā)生率約為3.5%～20%。特別是完全受精失敗周期，給患者和醫(yī)生帶來(lái)了不小的經(jīng)濟(jì)壓力和精神壓力，其發(fā)生率約4%～16%[1]。對(duì)于受精失敗周期患者，臨床上的處理策略是下個(gè)周期行ICSI授精或本周期行補(bǔ)救性ICSI。補(bǔ)救性ICSI策略可緩解患者因取消周期帶來(lái)的壓力，相對(duì)于取消周期更易被患者接受。早期研究是對(duì)過(guò)夜授精后未排出第二極體的卵母細(xì)胞行ICSI授精，也稱晚補(bǔ)救ICSI(Late-ICSI)。盡管有晚補(bǔ)救成功妊娠的報(bào)道，但是由于卵母細(xì)胞取出后孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)造成ICSI后胚胎發(fā)育潛能低下以及子宮內(nèi)膜的非同步性，晚補(bǔ)救的臨床結(jié)局并不理想，其應(yīng)用存在較大爭(zhēng)議。

之后的許多報(bào)道集中在常規(guī)IVF授精后4～6 h行脫顆粒細(xì)胞，對(duì)受精失敗的卵母細(xì)胞行補(bǔ)救ICSI授精，稱之為短時(shí)授精結(jié)合補(bǔ)救ICSI，也稱早期補(bǔ)救ICSI。早期補(bǔ)救ICSI不僅可以有效避免完全受精失敗或受精率低下，而且減輕了因長(zhǎng)時(shí)間孵育精子和顆粒細(xì)胞代謝產(chǎn)物對(duì)卵母細(xì)胞潛在的不利影響[2-3]。短時(shí)授精中以第二極體排出作為判斷受精的一個(gè)重要標(biāo)志，但對(duì)于第二極體排出晚的卵母細(xì)胞或因胚胎實(shí)驗(yàn)師對(duì)于極體排出與否的判斷經(jīng)驗(yàn)不足，太早行補(bǔ)救ICSI會(huì)增加多原核的比例；而太晚行補(bǔ)救ICSI時(shí)卵母細(xì)胞的老化現(xiàn)象會(huì)導(dǎo)致胚胎發(fā)育潛能低下。因此，補(bǔ)救ICSI的最佳時(shí)間窗可能無(wú)法準(zhǔn)確評(píng)估。本研究采取了回顧性分析的方法，分析了短時(shí)授精發(fā)生完全受精失敗的周期中不同時(shí)間行補(bǔ)救ICSI的臨床結(jié)局，以期獲得一個(gè)較寬的可接受的時(shí)間窗來(lái)指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室臨床工作。

材料與方法

一、研究對(duì)象及分組

本研究數(shù)據(jù)來(lái)源于南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床生殖醫(yī)學(xué)管理系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫(kù)(CCRM)，檢索并回顧性分析2010年1月至2019年4月行常規(guī)IVF發(fā)生完全受精失敗后行補(bǔ)救ICSI的治療周期。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)女方年齡≤38歲；(2)均采取短時(shí)授精，完全受精失敗后行補(bǔ)救ICSI；(3)夫婦雙方染色體正常；(4)男方精液各項(xiàng)指標(biāo)符合常規(guī)IVF標(biāo)準(zhǔn)；(5)第一周期促排卵；(6)行卵裂期新鮮胚胎移植。

最終有607個(gè)周期納入分析。根據(jù)加精后行補(bǔ)救ICSI的時(shí)間不同分為4組：授精后4～5 h(含5 h)(A組，n=55)；授精后5～6 h(含6 h)(B組，n=219)；授精后6～7 h(含7 h)(C組，n=117)；授精后>7 h(D組，n=216)。

二、研究方法

1.控制性促排卵：采用本中心常規(guī)促排卵方案，主要包括長(zhǎng)方案和拮抗劑方案。使用促性腺激素后，超聲監(jiān)測(cè)卵泡發(fā)育情況及激素水平，調(diào)整促性腺激素劑量。當(dāng)卵泡發(fā)育達(dá)到一定大小時(shí)，注射HCG 5 000～10 000 U，36～38 h后經(jīng)陰道超聲引導(dǎo)下行取卵術(shù)。

2.短時(shí)授精結(jié)合補(bǔ)救ICSI：取卵獲得的卵泡液經(jīng)體視顯微鏡檢查收集卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合物，獲得的卵母細(xì)胞至少培養(yǎng)2 h后進(jìn)行IVF授精，精子濃度為3～5×105/ml。精卵共孵育4 h后拆除顆粒細(xì)胞，裸化后的卵母細(xì)胞立即轉(zhuǎn)移至卵裂培養(yǎng)液(Cleavage Medium，COOK，美國(guó))中觀察第二極體排出情況。若觀察到所有MⅡ卵母細(xì)胞有第二極體排出，判斷為受精；若>70% MⅡ卵母細(xì)胞未排出第二極體，判斷為受精率低下；全部MⅡ卵母細(xì)胞均未排出第二極體，則判斷為完全受精失敗。在一定時(shí)間范圍(4～10 h)內(nèi)，對(duì)于受精失敗和受精率低下的卵母細(xì)胞行補(bǔ)救ICSI。ICSI授精后18 h左右觀察受精情況，出現(xiàn)雙原核者為正常受精，授精后第3天進(jìn)行卵裂期胚胎發(fā)育評(píng)估。

3.胚胎評(píng)分和胚胎移植[4]：在400倍倒置顯微鏡下，根據(jù)卵裂球數(shù)目、形態(tài)和碎片情況對(duì)第3天胚胎進(jìn)行評(píng)分，具體分為Ⅰ～Ⅳ級(jí)。Ⅰ級(jí)：胚胎發(fā)育速度正常，卵裂球均勻、數(shù)目均等，細(xì)胞質(zhì)均一、無(wú)空泡，碎片<5%；Ⅱ級(jí)：胚胎發(fā)育速度正常，卵裂球均勻或大致均勻，數(shù)目均等或大致均等，細(xì)胞質(zhì)均一、無(wú)空泡，碎片5%～10%；Ⅲ級(jí)：胚胎發(fā)育速度大致正常，卵裂球不均勻或均勻、數(shù)目不均等或均等，細(xì)胞質(zhì)中有少量空泡，碎片10%～15%；Ⅳ級(jí)：胚胎發(fā)育速度異常，卵裂球不均勻、數(shù)目不均等，細(xì)胞質(zhì)不均一、有大量空泡，碎片15%～50%。評(píng)分為Ⅰ級(jí)和Ⅱ級(jí)的為優(yōu)質(zhì)胚胎，Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)和Ⅲ級(jí)胚胎為可移植胚胎。根據(jù)第3天胚胎評(píng)分和患者雌激素水平及內(nèi)膜厚度，選擇1～2枚胚胎進(jìn)行移植，移植后常規(guī)黃體支持。對(duì)于移植后有剩余胚胎的患者，經(jīng)其知情同意后行囊胚培養(yǎng)或胚胎冷凍。

4.臨床結(jié)局判斷：移植后14 d檢測(cè)血β-HCG水平，若β-HCG值為陽(yáng)性則移植后30 d左右行超聲檢查，超聲下見(jiàn)孕囊及胎心管搏動(dòng)判定為臨床妊娠。妊娠12周內(nèi)發(fā)生胚胎停育或妊娠物排出則診斷為早期流產(chǎn)。妊娠滿28周且至少有1個(gè)存活新生兒分娩判定為活產(chǎn)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、患者一般臨床資料比較

4組患者的平均年齡、不孕年限、體重指數(shù)(BMI)、基礎(chǔ)FSH、抗苗勒管激素(AMH)比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表1)。

表1 患者基本臨床資料比較(-±s)

二、患者的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較

4組患者間正常受精率、多精受精率和卵裂率比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；優(yōu)質(zhì)胚胎率D組顯著低于其他3組，B組顯著高于C組(P<0.05)，而A組與B、C組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表2)。

表2 患者實(shí)驗(yàn)室結(jié)局比較(%)

三、患者移植周期的臨床結(jié)局比較

D組的臨床妊娠率、胚胎著床率和每移植周期活產(chǎn)率均低于其他3組，且與B、C兩組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；各組間流產(chǎn)率比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表3)。

表3 患者臨床結(jié)局比較(%)

討 論

受精是一個(gè)復(fù)雜而精細(xì)的過(guò)程，在常規(guī)IVF受精中不可避免的會(huì)發(fā)生受精失敗。受精失敗的原因有許多，如透明帶異常、卵母細(xì)胞提前激活、卵母細(xì)胞胞質(zhì)不成熟、精子未能穿透透明帶以及精子缺乏受精激活因子等[5]。補(bǔ)救ICSI的應(yīng)用大大減輕了患者因受精失敗所致周期取消所帶來(lái)的壓力。本研究通過(guò)對(duì)短時(shí)授精結(jié)合授精后不同時(shí)間行早期補(bǔ)救ICSI相關(guān)數(shù)據(jù)的分析，提示我們對(duì)于完全受精失敗周期，在授精后一定時(shí)間范圍內(nèi)(4～10 h)，晚于7 h行補(bǔ)救ICSI的臨床結(jié)局較差，因此建議早期補(bǔ)救ICSI不遲于授精后7 h，進(jìn)一步提出最佳補(bǔ)救ICSI時(shí)間窗是授精后5～6 h的初步結(jié)論。

補(bǔ)救ICSI最初應(yīng)用于二十世紀(jì)九十年代[6]，是針對(duì)過(guò)夜授精后未觀察到原核的卵母細(xì)胞進(jìn)行ICSI補(bǔ)救措施，稱之為L(zhǎng)ate-ICSI。Late-ICSI策略雖然有臨床妊娠報(bào)道，但其臨床結(jié)局較差[7-8]。普遍認(rèn)為卵母細(xì)胞具有一定的授精窗，錯(cuò)過(guò)最佳授精時(shí)機(jī)使得受精率不佳；此外，卵母細(xì)胞取出后孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)老化導(dǎo)致ICSI后的胚胎發(fā)育潛能低下以及與子宮內(nèi)膜的同步性較差。隨后有大量研究集中在IVF授精后4～6 h進(jìn)行顆粒細(xì)胞拆除，通過(guò)判斷第二極體排出與否來(lái)決定是否進(jìn)行早期補(bǔ)救ICSI。Chen等[9]在2003年進(jìn)行了早期補(bǔ)救ICSI的首次報(bào)道，發(fā)現(xiàn)授精后6 h未排出第二極體的卵母細(xì)胞接受補(bǔ)救ICSI得到的臨床結(jié)局優(yōu)于授精后22 h接受補(bǔ)救ICSI，從而提出了早期補(bǔ)救ICSI是避免IVF完全受精失敗的更好策略的建議。

ICSI授精方式在歐洲和美國(guó)的一些地區(qū)被廣泛使用，但是作為一種侵入性操作，其安全性不容忽視。中國(guó)現(xiàn)行法規(guī)限定了ICSI授精方式的使用率，臨床醫(yī)生對(duì)ICSI的指征把控嚴(yán)謹(jǐn)，IVF授精方式的使用率明顯大于ICSI授精方式。為了避免占大多數(shù)的IVF周期中出現(xiàn)受精失敗，早期補(bǔ)救ICSI措施被認(rèn)為是一個(gè)重要的彌補(bǔ)措施，因此在中國(guó)大多數(shù)生殖中心應(yīng)用廣泛和流行。有不少國(guó)內(nèi)的研究證實(shí)了早期補(bǔ)救ICSI可以獲得比較理想的胚胎發(fā)育結(jié)局和妊娠結(jié)局[10-12]。短時(shí)授精結(jié)合早期補(bǔ)救ICSI的關(guān)鍵是胚胎實(shí)驗(yàn)師正確判斷卵母細(xì)胞第二極體排出的情況。有研究認(rèn)為，IVF授精后4 h，具有第二極體的卵母細(xì)胞中有93.3%的卵母細(xì)胞在共孵育14～18 h后顯示正常受精[13]。短時(shí)授精提供了一種評(píng)估早期受精情況的途徑，然而不同卵母細(xì)胞成熟和排出第二極體的時(shí)間間隔并非一致，需要延長(zhǎng)某些患者卵母細(xì)胞的觀察時(shí)間；另一方面，有些患者的卵母細(xì)胞有極體破碎現(xiàn)象，這會(huì)給胚胎師的判斷帶來(lái)一定的影響，因此不得不延長(zhǎng)判斷時(shí)間，甚至延長(zhǎng)至原核出現(xiàn)。前者對(duì)早期補(bǔ)救ICSI的時(shí)間窗提出了一個(gè)范圍，后者說(shuō)明胚胎實(shí)驗(yàn)師的經(jīng)驗(yàn)也是至關(guān)重要的。

Liu等[14]提出在授精后5～10 h范圍內(nèi)，早期補(bǔ)救ICSI的臨床結(jié)局隨著補(bǔ)救ICSI時(shí)間的推遲而降低。本研究在授精后4 h行顆粒細(xì)胞拆除，將全部卵母細(xì)胞未能排出第二極體的周期判斷為完全受精失敗，早期補(bǔ)救ICSI的時(shí)間范圍允許為4～10 h。研究發(fā)現(xiàn)正常受精率、多精受精率、卵裂率均沒(méi)有隨時(shí)間的變化有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但是優(yōu)質(zhì)胚胎率在授精后7 h補(bǔ)救ICSI組與其他組比較顯著降低，而5～6 h補(bǔ)救ICSI組顯示出了最高的優(yōu)質(zhì)胚胎率。授精后7 h補(bǔ)救ICSI組的臨床結(jié)局也較差，和其它時(shí)間組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。值得一提的是，加精后4～5 h補(bǔ)救ICSI組并沒(méi)有顯示比5～6 h和6～7 h補(bǔ)救ICSI組更好的臨床結(jié)局，推測(cè)可能是由于拆除顆粒細(xì)胞對(duì)卵母細(xì)胞的損傷恢復(fù)時(shí)間不夠所致，需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證據(jù)來(lái)支持。

有研究認(rèn)為短時(shí)授精去除顆粒細(xì)胞使更多的精子接觸到透明帶，同時(shí)影響卵胞漿的成熟，多余的精子進(jìn)入透明帶從而導(dǎo)致多精受精的發(fā)生[15]，短時(shí)授精結(jié)合補(bǔ)救ICSI中多原核比例的增加對(duì)臨床結(jié)局有不利的影響[16]。另外，短時(shí)授精時(shí)胚胎實(shí)驗(yàn)師對(duì)判斷第二極體排出與否的經(jīng)驗(yàn)欠缺而過(guò)早的補(bǔ)救ICSI也會(huì)導(dǎo)致多精受精的發(fā)生或增加。也有研究認(rèn)為雖然補(bǔ)救ICSI的多精受精比例升高[17-18]，但是正常受精率、臨床妊娠率并未受到顯著影響[18]。在本研究中，補(bǔ)救ICSI進(jìn)行時(shí)間的早晚對(duì)多精受精并無(wú)顯著影響，這與之前的報(bào)道結(jié)果類似[19-20]。

本研究以活產(chǎn)率作為最終觀察指標(biāo)，分析了4個(gè)不同補(bǔ)救ICSI時(shí)間組，以期大致明確早期補(bǔ)救ICSI的最佳時(shí)間窗。結(jié)果提示，在授精后5～6 h行早補(bǔ)救ICSI可以獲得更好的每移植周期活產(chǎn)率，而每移植周期活產(chǎn)率在大于7 h行補(bǔ)救ICSI時(shí)顯著降低。胚胎實(shí)驗(yàn)師應(yīng)準(zhǔn)確判斷第二極體排出情況，盡量避免太遲(授精后7 h以上)進(jìn)行補(bǔ)救ICSI操作，以期獲得較為理想的活產(chǎn)率。本研究為回顧性研究，研究結(jié)論還需要更多的前瞻性研究來(lái)進(jìn)一步證實(shí)。