張丹，孫大光，3，張璐，馬旭*，夏紅飛*

(1.國家衛(wèi)生健康委科學技術研究所遺傳優(yōu)生中心，北京 100081；2.北京協(xié)和醫(yī)學院研究生院，北京 100730；3.重慶市人口和計劃生育科學技術研究院，重慶 400020)

低氧誘導因子(hypoxia inducible factor，HIF)是一種轉錄因子，它參與細胞對低氧的適應性生理反應，包括免疫細胞激活、增殖和凋亡等[1-3]。HIF家族在大多數(shù)脊椎動物中有3個不同的成員，即HIF-1、HIF-2和HIF-3，均由α和β兩個亞基組成，屬于基本螺旋-環(huán)-螺旋(basic helix-loop-helix，bHLH)-下游鐘基因-芳香烴受體核轉位子-專一性蛋白結構域(per-arnt-sim，PAS)超家族成員，其中α亞基是調節(jié)HIF活性的功能亞基[4]。與HIF-1和HIF-2[5]相比，對HIF-3的研究較少。最初由Gu等[4]在1998年發(fā)現(xiàn)小鼠低氧誘導因子-3α(hypoxia inducible factor-3α，mHIF-3α)，2001年Hara等[6]發(fā)現(xiàn)了人類HIF-3α。人HIF-3、HIF-1、HIF-2的α亞基中的bHLH及PAS區(qū)高度相似，但HIF-3的α亞基C端缺乏轉錄激活結構；此外，HIF-3α能抑制人腎臟中由HIF介導的低氧誘導基因的表達，它可能是低氧期間基因表達的負調節(jié)器[6]。有研究發(fā)現(xiàn)HIF-3α是一個氧依賴的轉錄激活因子，它的轉錄激活作用是保守的，如人HIF-3α-1和HIF-3α-9能上調相似的基因[7]。HIF-3α是在生理和病理條件下對人類低氧反應進行微調的一個重要因子[8]。低氧能迅速激活HIF-3的表達[9]，同時，低氧也可引起胎盤功能減退或老化，但HIF-3α對胎盤細胞是否有影響目前尚不清楚。在本研究中，我們以HTR8/SVneo細胞系作為研究對象，我們設計HIF-3α的過表達和敲低的實驗，探究HIF-3α對HTR8/SVneo細胞在增殖和凋亡、遷移和浸潤等方面的影響，從而預測它在胎盤中的作用。

材料與方法

一、實驗材料和試劑

1.細胞株：人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞(HTR8/SVneo細胞)由中國科學院動物研究所王雁玲和王紅梅老師贈送。

2.主要試劑與儀器：pcDNA3.1(+)質粒(Thermo Fisher Scientific，美國)；HIF-3α抑制物(scramble siRNA、HIF-3αsiRNA #1、HIF-3αsiRNA #2和HIF-3αsiRNA #3)購自上海吉瑪生物公司；MTT(Sigma-Aldrich，美國)；Cell-Light EdU Apollo643 In Vitro Imaging Kit試劑盒購自廣州銳博生物；Annexin V/PI試劑盒(Invitrogen，美國)；兔抗HIF-3α多克隆抗體(Genetex，美國)；小鼠抗β-ACTIN單克隆抗體(Abcam，美國)，辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase，HRP)標記的羊抗兔和羊抗小鼠IgG二抗購自北京中杉金橋；Synergy2 多功能酶標儀(Biotek，美國)；TE2000-U倒置熒光相差顯微鏡(尼康，日本)；流式細胞儀(Beckman coulter，德國)。

二、實驗方法

1.載體構建：由生工生物工程(上海)股份有限公司合成人HIF-3α的編碼序列(Coding domain sequence，CDS)，并插入真核表達載體pcDNA3.1(+)，即獲得HIF-3α表達載體pcDNA3.1-HIF-3α。

2.細胞轉染：實驗分為pcDNA3.1組、pcDNA3.1-HIF-3α組、scramble siRNA組和HIF-3αsiRNA組(從HIF-3αsiRNA #1、HIF-3αsiRNA #2和HIF-3αsiRNA #3抑制劑中篩選最佳抑制劑供HIF-3αsiRNA組使用)，其中pcDNA3.1組是pcDNA3.1-HIF-3α組的陰性轉染組，scramble siRNA組是HIF-3αsiRNA組的陰性轉染組。將HTR8/SVneo細胞接種于6孔板，當細胞密度達80%時，各組按照下表1進行轉染，轉染 24 h后，根據(jù)后續(xù)實驗需求將轉染后的細胞分別接種于不同的孔板中。

表1 細胞轉染加樣量情況

3.MTT法檢測細胞活力：細胞轉染24 h后，以每孔5 000個細胞接種于96孔板，再過24 h加入20 μl 5 mg/ml MTT，避光孵育4 h后棄上清，加入200 μl二甲基亞砜，10 min后檢測樣品在A570 nm處的吸光度。為了避免組內誤差設置3個重復孔；為了降低實驗誤差和批間差異，每組實驗至少重復3次。MTT=實驗組A570 nm/對照組A570 nm×100%。

4.EdU法檢測細胞增殖：細胞轉染24 h后，以每孔5×104個細胞接種于24孔板。24 h后根據(jù)EdU試劑盒說明書，用細胞培養(yǎng)基按照1 000∶1的比例稀釋EdU溶液，EdU終濃度為50 μmol/L。細胞培養(yǎng)板每孔加入200 μl EdU培養(yǎng)基，37℃ 孵育2 h，棄培養(yǎng)基，用4%多聚甲醛固定細胞，然后每孔加入200 μl 1×Apollo染色液，室溫孵育30 min，最后每孔加入200 μl 1×Hoechst33342反應液孵育30 min進行DNA染色。顯微鏡下隨機取5個視野，分別計數(shù)視野下EdU標記的紅色熒光細胞數(shù)和Hoechst33342標記的藍色熒光細胞總數(shù)，每組實驗至少重復3次。細胞增殖率=EdU標記的細胞數(shù)/Hoechst33342標記的細胞數(shù)×100%。

5.流式細胞術檢測細胞凋亡：細胞轉染24 h后，以每孔5×104個細胞接種于24孔板。24 h后根據(jù)Annexin V/PI 凋亡檢測試劑盒說明書，用2.5 μl AnnexinV-FITC儲液和5μl 20 μg/ml磷脂酰肌醇(Phosphatidylinositol，PI)混勻后加入每組的細胞懸液中，避光室溫孵育15 min，用流式細胞儀對標本進行定量分析，每管共檢測8 000個細胞。每組設置2個重復，試驗重復3次。Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術依據(jù)不同功能狀態(tài)下細胞對染料的吸收作用不同分別采集到早期凋亡和晚期凋亡細胞的熒光信號，檢測得到的二維散點圖的4個象限分別代表不同狀態(tài)的細胞，左上方區(qū)域的細胞為壞死細胞，右上方區(qū)域的細胞為晚期凋亡細胞，右下方區(qū)域的細胞為早期凋亡細胞，左下方區(qū)域的細胞為活細胞。

6.細胞培養(yǎng)小室(Transwell)法檢測細胞浸潤和遷移能力：在細胞遷移的檢測中，用RPMI-1640培養(yǎng)基重懸并調整細胞濃度為 0.5×109個/L，將100 μl細胞懸液移入小室中，在下室里添加600 μl的培養(yǎng)基(內含2.5%胎牛血清)，18 h后加入結晶紫染色液染色10 min。在細胞浸潤的檢測中，Transwell小室上有稀釋的基質膠(1∶3)，加入含0.5×105個/L的細胞懸液，12 h后用結晶紫進行染色，鏡下觀察細胞。任意取5個視野(目鏡20×)記錄細胞的總數(shù)，每組重復3次。

7.蛋白質印跡法(Western blot)：各組細胞提取蛋白后，取60 μg蛋白在裂解液變性后，經10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳達分離，然后轉膜(硝酸纖維素膜)，室溫下用5%脫脂奶粉孵育1 h，依次與1∶1 000稀釋的一抗(兔抗HIF-3α多克隆抗體和小鼠抗β-ACTIN單克隆抗體)和1∶10 000稀釋的二抗(HRP標記的羊抗兔和羊抗小鼠IgG)均室溫孵育1 h，最后，用ECL發(fā)光液進行顯色、曝光。利用Image J軟件分析目標條帶的灰度值。β-actin為內參，每組實驗至少重復3次。

三、統(tǒng)計學方法

結 果

一、HIF-3α的過表達和敲低實驗的驗證結果

Western Blot分別檢測轉染pcDNA3.1- HIF-3α質粒和HIF-3αsiRNA的HTR8/SVneo細胞中HIF-3α的表達水平，結果顯示pcDNA3.1- HIF-3α的過表達是有效的(P<0.05)，而且HIF-3αsiRNA的敲低也是高效的(P<0.05)，HIF-3αsiRNA #1、HIF-3αsiRNA #2和HIF-3αsiRNA #3的敲低效率分別是60.0%、66.6%和50.1%(圖1)。后續(xù)實驗選用HIF-3αsiRNA #2作為HIF-3αsiRNA組處理HTR8/SVneo細胞。

A：Western Blot檢測pcDNA3.1- HIF-3α質粒在HTR8/SVneo細胞中的表達；B：Western Blot檢測HIF-3α siRNA在HTR8/SVneo細胞中的表達；C：過表達HIF-3α的Western Blot檢測結果灰度分析，與pcDNA3.1組比較，*P<0.05；D：敲低HIF-3α的Western Blot檢測結果灰度分析，與scramble siRNA組比較，*P<0.05圖1 過表達和敲低HIF-3α結果

二、HIF-3α對HTR8/SVneo細胞活性和細胞增殖的影響

EdU法檢測細胞增殖發(fā)現(xiàn)，與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-HIF-3α處理組細胞的增殖能力顯著增強(P<0.05)；與scramble siRNA組相比，HIF-3αsiRNA處理組細胞增殖顯著降低(P<0.05)(圖2)。MTT法檢測細胞活性發(fā)現(xiàn)，與pcDNA3.1組比較，pcDNA3.1-HIF-3α組細胞活力無顯著差異(P>0.05)；與scramble siRNA組比較，HIF-3αsiRNA組細胞的細胞活力顯著升高(P<0.05)(圖3)。

三、HIF-3α對HTR8/SVneo細胞凋亡的影響

Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)，HIF-3α過表達有降低HTR8/SVneo細胞早期凋亡的趨勢，但無顯著差異(P>0.05)；HIF-3α敲低后細胞凋亡無顯著差異(P>0.05)(圖4)。

A：EdU熒光成像圖(陽性細胞是紅色熒光，DAPI復染細胞核是藍色熒光，Merge是EdU和DAPI的熒光成像合成圖像)(×200)；B：過表達HIF-3α對HTR8/SVneo細胞增殖的影響，與pcDNA3.1組比較，*P<0.05；C：敲低HIF-3α對HTR8/SVneo細胞增殖的影響，與scramble siRNA組比較，*P<0.05圖2 HIF-3α對HTR8/SVneo細胞增殖的影響

A：過表達HIF-3α對HTR8/SVneo細胞活力的影響；B：敲低HIF-3α對HTR8/SVneo細胞活力的影響；與scramble siRNA組比較，*P<0.05圖3 HIF-3α對HTR8/SVneo細胞活力的影響

A：流式細胞術檢測過表達HIF-3α對HTR8/SVneo細胞凋亡的影響；B：流式細胞術檢測敲低HIF-3α對HTR8/SVneo細胞凋亡的影響；C：過表達HIF-3α對HTR8/SVneo細胞早期凋亡和晚期凋亡的影響；D：敲低HIF-3α對HTR8/SVneo細胞早期凋亡和晚期凋亡的影響圖4 HIF-3α對HTR8/SVneo細胞凋亡的影響

四、HIF-3α對HTR8/SVneo細胞遷移和浸潤能力的影響

Transwell小室法檢測發(fā)現(xiàn)，HIF-3α過表達處理后細胞的計數(shù)顯著升高(P<0.05)，即HIF-3α過表達可促進HTR8/SVneo細胞的浸潤和遷移能力；而HIF-3α敲低處理后細胞的計數(shù)顯著降低(P<0.05)，即HIF-3α敲低可降低HTR8/SVneo細胞的浸潤和遷移能力(圖5和圖6)。

A：Transwell法檢測HIF-3α對HTR8/SVneo細胞遷移影響的染色圖(×200)；B：HIF-3α過表達的Transwell結果柱形圖分析，與pcDNA3.1組比較，*P<0.05；C：敲低HIF-3α的Transwell結果柱形圖分析，與scramble siRNA組比較，*P<0.05圖5 HIF-3α對HTR8/SVneo細胞遷移的影響

A：Transwell法檢測HIF-3α對HTR8/SVneo細胞浸潤影響的染色圖(×200)；B：HIF-3α過表達的Transwell結果柱形圖分析，與pcDNA3.1組比較，*P<0.05；C：敲低HIF-3α的Transwell結果柱形圖分析，與scramble siRNA組比較，*P<0.05圖6 HIF-3α對HTR8/SVneo細胞浸潤的影響

討 論

氧是哺乳動物新陳代謝和生理功能中必不可少的條件之一，它在細胞能量產生和許多酶的輔助因子/底物中扮演著重要角色。機體在有氧條件下，HIFα與希佩爾-林道蛋白(von hippel-lindau，VHL)蛋白相互作用并結合，從而激活泛素連接酶系統(tǒng)，導致HIFα的蛋白酶體降解。低氧時，HIFα表達穩(wěn)定并與HIFβ相結合形成二聚體，然后轉移到細胞核，與低氧應答元件(HREs)結合，參與調控低氧基因表達[9]。HIF可以激活控制細胞氧穩(wěn)態(tài)的基因，包括與氧消耗、紅細胞生成、血管生成和線粒體代謝有關的基因。低氧細胞通過轉錄和轉錄后機制應對低氧環(huán)境的影響，這主要受HIF調控[10]。低氧會使HIF-3αmRNA表達水平升高[11]。已有研究發(fā)現(xiàn)大鼠在低氧環(huán)境下，在肺和其他器官中HIF-3αmRNA表達水平顯著增加[12-14]。低氧條件下斑馬魚中HIF-3αmRNA和蛋白質表達水平也會升高[15]。本實驗中，我們通過HIF-3α在HTR8/SVneo細胞中過表達和敲低的實驗可知，它的表達水平對HTR8/SVneo細胞的增殖、活力、遷移和浸潤功能均有影響。并且HIF-3α的過表達對HTR8/SVneo細胞的遷移和浸潤能力、細胞增殖都有顯著的促進作用(P<0.05)。而細胞的增殖、遷移、浸潤等功能在胚胎組織器官發(fā)育中發(fā)揮著重要的作用，我們認為HIF-3α可能參與胎盤在胚胎發(fā)育中的調控過程。HIF-3α基因的表達是通過HIF-1α和HIF-2α誘導的[16-17]。因此，HIF-3α基因產物可能在低氧誘導基因表達的負反饋調節(jié)中發(fā)揮關鍵作用[18]。目前對HIF-3α的作用尚未完全了解，長期以來人們一直認為它與HIF-1α和HIF-2α的表達負相關，并直接或間接調節(jié)低氧誘導的病理過程[19]。我們發(fā)現(xiàn)HIF-3α敲低對HTR8/SVneo細胞的遷移和浸潤能力、細胞增殖有很顯著的抑制作用(P<0.05)，但對細胞活力有顯著的促進作用(P<0.05)，對HTR8/SVneo細胞早期凋亡的影響無顯著差異(P>0.05)。總之，HIF-3α過表達或敲低都對HTR8/SVneo細胞的增殖、遷移和浸潤能力有顯著影響(P<0.05)，說明HIF-3α是調節(jié)HTR8/SVneo細胞增殖、遷移和浸潤能力的重要因子。

HIF-3是一種氧依賴性轉錄因子，它可以通過調控其下游的基因[20]激活應對缺氧的獨特轉錄反應[7]。已有的研究證明HIF-3α除了低氧環(huán)境的應激調控外、在糖代謝中也發(fā)揮作用[21]。我們推測它參與胎盤某些重要功能(如內分泌功能與浸潤功能等)的過程，那么也可能在妊娠中多種疾病的發(fā)生過程有著重要的調控作用。