熊波 張志剛 嵇振嶺 胡琬君

腹壁疝是由各種原因?qū)е碌母贡诮钅せ蚣∪獗∪趸蛉笔В诟箖?nèi)壓的作用下導(dǎo)致內(nèi)臟向外膨出，形成腹外疝。臨床采用外科手術(shù)進(jìn)行治療?；诩袤w補(bǔ)片的無(wú)張力修補(bǔ)術(shù)應(yīng)用越趨廣泛[1-2]，疝修補(bǔ)假體材料主要是聚丙烯材料[3-4]，但其較強(qiáng)的組織刺激和異物反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致臟器粘連，致使聚丙烯補(bǔ)片無(wú)法直接用于腹膜內(nèi)疝的修補(bǔ)。西羅莫司(Sirolimus,SRL)是一種大環(huán)內(nèi)脂類免疫抑制藥物，具有免疫抑制、抗炎、抗纖維化、抗增殖和抗血管生成作用[5]，廣泛應(yīng)用于器官移植和自身免疫性疾病[6]。水凝膠以其優(yōu)良的生物相容性，在藥物釋控等方面得到了廣泛應(yīng)用[7]，但水凝膠的高度親水表面使得其在液體環(huán)境中很難定置于組織表面。本研究利用醛基與氨基的反應(yīng)制備一種具有組織黏附性能的可注射水凝膠，將氧化羧甲基纖維素(oxidized carboxymethyl cellulose,OCMC)與羧甲基殼聚糖(carboxymethyl chitosan,CMCS)注射混合，將免疫抑制劑SRL包封進(jìn)凝膠前體溶液中，短時(shí)間內(nèi)原位形成負(fù)載SRL的可注射凝膠，采用在腹腔鏡經(jīng)腹腹腔內(nèi)補(bǔ)片植入術(shù)(intraperitoneal onlay mesh,IPOM)對(duì)實(shí)驗(yàn)豬進(jìn)行腹膜下補(bǔ)片植入，比較凝膠與普通PP補(bǔ)片整合形成SRL/gel/PP補(bǔ)片及SRL/gel/PP補(bǔ)片與腹壁組織整合。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料：普通級(jí)健康實(shí)驗(yàn)仔豬9只[SCXK(蘇) 2016-0009]，性別隨機(jī)，體重20～25 kg，由江蘇亞?wèn)|實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究院有限公司提供。實(shí)驗(yàn)豬隨機(jī)分為PP組、SRL/gel/PP組和PROCEED組，3只/組。實(shí)驗(yàn)經(jīng)東南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)和使用委員會(huì)批準(zhǔn)。動(dòng)物均得到福利對(duì)待。實(shí)驗(yàn)材料：聚丙烯補(bǔ)片(Bard，US，由東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院提供)；羧甲基纖維素(carboxymethyl cellulose,CMC)，高碘酸鈉和SRL，購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；羧甲基殼聚糖(carboxymethyl chitosan,CMCS)，購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司。

二、方法

1.OCMC的制備與表征：取2 g羧甲基纖維素鈉溶解于100 ml水，取1.76 g高碘酸鈉溶于10 ml水加入上述溶液，避光攪拌6小時(shí)，加入1 ml乙二醇，攪拌1小時(shí)，終止反應(yīng)，得到氧化羧甲基纖維素初產(chǎn)物。將初產(chǎn)物注入透析袋(MWCO=3 500 Da)，透析3天，冷凍干燥，得OCMC。利用傅里葉變換紅外光譜儀測(cè)試CMC和OCMC紅外光譜，確定產(chǎn)物的特征化學(xué)基團(tuán)。

a:PP組;b:SRL/gel/PP組;c:PROCEED?組

2.SRL/gel的形成：分別配制5%OCMC和3%CMCS/SRL溶液，按體積比1∶1混合，以倒置法測(cè)定凝膠形成時(shí)間。

3.SRL/gel/PP復(fù)合補(bǔ)片的體外制備：分別配制5%OCMC和3%CMCS/SRL溶液，按體積比1∶1混合，注射到聚丙烯補(bǔ)片表面，得到水凝膠復(fù)合補(bǔ)片。

4.手術(shù)實(shí)施：實(shí)驗(yàn)豬禁飲禁食24小時(shí)。3%戊巴比妥鈉注射液腹腔注射聯(lián)合肌肉注射陸眠寧0.5 ml。氣管插管，皮球輔助呼吸，耳緣靜脈滴注氯化鈉注射液，以指脈壓血氧檢測(cè)儀監(jiān)測(cè)生命體征。腹腔鏡的手術(shù)實(shí)施采用“三孔法”進(jìn)行，在腹部倒數(shù)第三乳頭處切口，約1 cm，插氣腹針，打開(kāi)CO2與氣腹機(jī)，建氣腹，氣腹機(jī)壓力12 mmHg，建立腹腔鏡、氣腹通路。另2個(gè)套管插入腹腔，建立手術(shù)通路。用可吸收縫線將PP補(bǔ)片固定于腹壁。將7.5 mlOCMC和7.5 ml CMCS/SRL前體溶液通過(guò)雙筒注射器混合并注射涂覆于補(bǔ)片表面，構(gòu)建組合式載藥凝膠補(bǔ)片，為SRL/gel/PP組。用同樣的方式將普通PP補(bǔ)片和PROCEED?補(bǔ)片進(jìn)行腹膜下定置，為對(duì)照組。見(jiàn)圖1。

5.不同防粘連材料體內(nèi)粘連程度的評(píng)價(jià)：標(biāo)準(zhǔn)飼喂1年，麻醉，切開(kāi)皮膚與肌肉層，插入氣腹針，建立腹腔鏡、氣腹通路，觀察補(bǔ)片植入部位。按文獻(xiàn)方法評(píng)價(jià)采用雙盲的方式對(duì)豬的腹腔粘連[8]。將修補(bǔ)處的腹壁組織、粘連部分連同補(bǔ)片一并取下，多聚甲醛固定，行病理學(xué)檢查。

6.組織病理學(xué)檢查：HE染色組織學(xué)觀察腹腔內(nèi)補(bǔ)片表面粘連情況，補(bǔ)片周圍的炎癥反應(yīng)程度；Masson染色分析膠原分布；免疫組化評(píng)估補(bǔ)片單絲周圍組織腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor alpha,TNF-α) 和白細(xì)胞介素(interleukin-6,IL-6)表達(dá)情況。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用PASW Statistics 18.0進(jìn)行單因素方差分析，黏附分?jǐn)?shù)采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1.凝膠的理化性質(zhì)：紅外分析表明氧化后的CMC在1 735 cm-1處出現(xiàn)明顯的吸收峰，歸屬-CHO的羰基伸縮振動(dòng)，經(jīng)過(guò)高碘酸鈉的氧化將多糖主鏈上的鄰位羥基斷裂形成兩個(gè)醛基。1 598 cm-1處的羧基特征峰在CMC氧化前后依然存在，未受影響。通過(guò)1H-NMR分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)氧化后的CMC在5.0 ppm處有細(xì)微變化，主要是由醛基的形成導(dǎo)致的。通過(guò)高碘酸鈉氧化CMC可制得OCMC。在將兩種前體溶液按照體積比1∶1進(jìn)行混合后倒置，隨時(shí)間的延長(zhǎng)瓶?jī)?nèi)混合液體可以逐漸形成凝膠，約40秒后完全形成凝膠，凝膠前體溶液在經(jīng)過(guò)注射器針頭混合后依然可以形成凝膠。在注射到補(bǔ)片上后，凝膠可以有效定置在PP補(bǔ)片上，且與補(bǔ)片整合良好。

a:PP組;b:SRL/gel/PP組;c:PROCEED?組

a,d:PP組;b,e:SRL/gel/PP組;c,f:PROCEED?組

2.動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)及粘連評(píng)估：PP組補(bǔ)片發(fā)生了嚴(yán)重的粘連，無(wú)法通過(guò)鈍器松解，SRL/gel/PP組沒(méi)有臟器粘連，僅在補(bǔ)片邊緣及少量區(qū)域出現(xiàn)少量組織增生，且表面被間皮層所覆蓋，PROCEED?組依然存在著一定程度的粘連。見(jiàn)圖2和表1。

表1 各組補(bǔ)片發(fā)生粘連的面積及強(qiáng)度評(píng)估(分)

從表1的定量評(píng)價(jià)我們可以看到，PP組無(wú)論在粘連面積還是在粘連強(qiáng)度都顯著的高于其余2組。SRL/gel/PP組通過(guò)評(píng)價(jià)僅發(fā)現(xiàn)非常少量的粘連，且粘連強(qiáng)度和面積都很小，粘連面積僅為PP組的1/6，通過(guò)剝離評(píng)估，粘連強(qiáng)度僅為PP組的1/9。同樣，PROCEED?對(duì)照組也具有較小的粘連強(qiáng)度和面積，雖然SRL/gel/PP組和PROCEED?對(duì)照組在組間沒(méi)有顯著差異，但是和PP組的對(duì)比可以表明，所制備的SRL/gel/PP補(bǔ)片具有優(yōu)良的防粘連性能。

3.組織病理學(xué)檢查：PP補(bǔ)片和PROCEED?植入后，補(bǔ)片單絲周圍存在一定的炎性反應(yīng)，SRL/gel/PP組的炎性反應(yīng)明顯減小。與PP組比較，間皮層厚度明顯減小，豐富的血管滲透其間，SRL/gel/PP補(bǔ)片單絲周圍的膠原沉積顯著小于PP補(bǔ)片和PROCEED?補(bǔ)片，且補(bǔ)片很好的被間皮層覆蓋。PP補(bǔ)片和PROCEED?補(bǔ)片周圍存在大量的膠原沉積。見(jiàn)圖3。

4.免疫組化炎性分析：PP組單絲周圍有大量的IL-6表達(dá)，PROCEED?組單絲周圍的IL-6表達(dá)顯著減少， SRL/gel/PP補(bǔ)片單絲周圍的IL-6僅有輕微的表達(dá)。SRL/gel/PP補(bǔ)片組的TNF-α的表達(dá)最低。PP組出現(xiàn)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，PROCEED?組的炎癥表達(dá)較輕。見(jiàn)圖4。

a,d:PP組;b,e:SRL/gel/PP組;c,f:PROCEED?組

通過(guò)利用Image J 對(duì)不同補(bǔ)片組的單絲周圍組織進(jìn)行半定量分析可以發(fā)現(xiàn)，在炎癥反應(yīng)方面，SRL/gel/PP組的IL-6和TNF-α的表達(dá)量顯著小于PP組，分別僅為PP組的1/5和1/6，見(jiàn)表2。

表2 補(bǔ)片單絲周圍組織IL-6和TNF-α表達(dá)量的半定量分析

討論

聚丙烯補(bǔ)片是腹壁重建的常用材料之一，但植入后對(duì)周圍組織較強(qiáng)的刺激，導(dǎo)致異物反應(yīng)，引起炎性反應(yīng)，導(dǎo)致粘連。Diamond等[9]利用透明質(zhì)酸溶液有效地減小了發(fā)生粘連的面積，但液體防粘連劑多為天然高分子或其衍生物，在腹腔液的存在下會(huì)很快被稀釋，且其流動(dòng)性決定了它將無(wú)法有效覆蓋需要防治的區(qū)域，加之體內(nèi)復(fù)雜環(huán)境條件下，液體防粘連劑很快被機(jī)體代謝，無(wú)法達(dá)到預(yù)期的粘連防治周期。固體薄膜是一種很好的防粘連屏障，Seprafilm?作為一種防粘連屏障膜已廣泛用于臨床，但是由于其質(zhì)地較脆，容易破裂，且潤(rùn)濕后容易與手術(shù)器械黏附[10-11]，因此會(huì)在操作上帶來(lái)了不必要的麻煩。

水凝膠化學(xué)成分和機(jī)械性質(zhì)與細(xì)胞外基質(zhì)相似。水凝膠模擬細(xì)胞外基質(zhì)不僅可以防止受損組織之間的直接接觸，還可以抑制膠原蛋白和其他免疫反應(yīng)的過(guò)度沉積，消除異物反應(yīng)并最小化或避免過(guò)度纖維化。Zhang等[12]開(kāi)發(fā)了一種可生物降解和熱可逆的半乳糖修飾的木葡聚糖水凝膠，用于預(yù)防術(shù)后腹膜粘連。結(jié)果表明，木葡聚糖水凝膠(4%，w/v)可有效預(yù)防術(shù)后腹膜粘連。水凝膠屏障由于其高度親水的表面難以黏附到組織上，導(dǎo)致其從潛在粘連部位移位而不能有效預(yù)防粘連發(fā)生。

我們的研究采用兒茶酚胺制備了具有自固定、可注射、可降解性能的防粘連水凝膠。凝膠在補(bǔ)片表面可以有效形成自固定不易移位的凝膠覆蓋體，通過(guò)腹腔鏡鞘卡通道完成操作，達(dá)到凝膠在粘連防治目標(biāo)位點(diǎn)的全覆蓋，有效阻隔補(bǔ)片與臟器直接接觸。采用腹腔鏡技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)豬實(shí)施了腹腔內(nèi)補(bǔ)片植入術(shù)，術(shù)后1年觀察術(shù)后部位，與PP組相比，凝膠組補(bǔ)片具有優(yōu)良的防粘連性能，且補(bǔ)片與腹壁整合良好，未發(fā)生皺縮與位移。病理研究顯示，SRL/gel/PP組補(bǔ)片表面覆蓋著一層較薄的間皮層，與水凝膠優(yōu)異的組織相容性，抑制了瘢痕組織的異常增生相關(guān)。切片未顯示水凝膠在補(bǔ)片周圍殘留，可見(jiàn)凝膠可以完全被生物體降解。補(bǔ)片單絲周圍膠原沉積染色顯示，三種補(bǔ)片的骨架均為聚丙烯單絲，SRL/gel/PP組補(bǔ)片單絲周圍的膠原沉積顯著少于PP組與PROCEED?組，水凝膠親水表面有效防止膠原聚集。進(jìn)一步對(duì)補(bǔ)片周圍組織的炎性因子表達(dá)的情況分析發(fā)現(xiàn)，SRL/gel/PP補(bǔ)片組炎性因子表達(dá)明顯降低，由于水凝膠優(yōu)良的細(xì)胞與組織相容性極大地降低了機(jī)體的異物反應(yīng)，負(fù)載SRL也能夠很好地抑制機(jī)體過(guò)度的免疫反應(yīng)，從而與水凝膠具有協(xié)同作用，抑制膠原沉積[13]。PROCEED?組由于其成分中的氧化再生纖維素會(huì)與損傷部位的出血位點(diǎn)形成血栓，導(dǎo)致炎性反應(yīng)，病理染色和免疫組化的結(jié)果中得到了證實(shí)。

本研究采用IPOM術(shù)式對(duì)實(shí)驗(yàn)豬直接植入普通聚丙烯補(bǔ)片并在其上涂覆具有自固定、可降解的負(fù)載SRL的水凝膠，形成復(fù)合式的水凝膠防粘連聚丙烯補(bǔ)片。該復(fù)合補(bǔ)片制備及操作簡(jiǎn)便，粘連防治效果顯著，組織相容性優(yōu)良。