胡慧 韋偉

分子診斷是指應(yīng)用分子生物學(xué)方法，檢測病人體內(nèi)遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)或表達(dá)水平變化而做出診斷的技術(shù)。它將實驗室醫(yī)學(xué)與分子遺傳學(xué)的知識和技術(shù)有效結(jié)合起來，主要分為基因測序、基因芯片和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)等技術(shù)。

一直以來，對于乳腺癌的治療決策均基于解剖學(xué)基礎(chǔ)的腫瘤分期，以及生物學(xué)特征為基礎(chǔ)的分子分型。隨著高通量基因檢測技術(shù)的進(jìn)步，和以個體化醫(yī)療為基礎(chǔ)的“精準(zhǔn)醫(yī)療”概念提出，乳腺癌治療策略已經(jīng)由最大可耐受的治療轉(zhuǎn)變?yōu)樽钚〔涣挤磻?yīng)的有效治療。

美國癌癥聯(lián)合委員會(American Joint Committee on Cancer，AJCC) 在第8版乳腺癌分期中增加了對多基因檢測的推薦，美國臨床腫瘤學(xué)會(American Society of Clinical Oncology，ASCO) 也分別在2007年和2017年先后批準(zhǔn)Oncotype DX(21基因) 和MammaPrint(70基因) 用于指導(dǎo)早期浸潤性乳腺癌輔助治療決策。乳腺癌多基因檢測已成為學(xué)界關(guān)注的熱點之一。本文就當(dāng)前國內(nèi)外應(yīng)用最廣泛、可及性最高的乳腺癌分子診斷檢測方法及意義作一綜述。

目前檢測早期乳腺癌多基因表達(dá)譜方法主要有Oncotype DX(21基因)、MammaPrint(70 gene)、EndoPredict(12個基因)和50個基因的Prosigna,以及國內(nèi)基因公司開發(fā)的72基因等。以美國為例，每年有約40%以上乳腺癌病例會使用基于腫瘤組織基因表達(dá)的分子診斷，醫(yī)生和病人依據(jù)診斷結(jié)果決定手術(shù)后是否進(jìn)行化療、預(yù)測輔助化療獲益，甚至新輔助化療效果和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險；35%以上病例會基于分子診斷結(jié)果而改變治療方案。

一、21基因(Oncotype Dx)

1.21基因檢測：21基因檢測由美國國家外科輔助乳腺癌和大腸癌研究計劃(NSABP)與Genomic Health公司(GHI)開發(fā)。主要針對激素受體陽性和淋巴結(jié)陰性的早期乳腺癌病人，預(yù)測其內(nèi)分泌治療效果及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險。該技術(shù)是采用高通量、實時逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)的方法，檢測石蠟包埋的乳腺癌組織中16個與癌癥相關(guān)基因和5個內(nèi)參基因，共21個基因[1-2]。包括增殖相關(guān)基因(Ki-67、CyclinB1、STK15、Survivin、MYBL2)，激素受體表達(dá)相關(guān)基因(ER、PR、 Bel2、SCUBE2)，通路激活(HER-2，GRB7)，細(xì)胞侵襲相關(guān)基因(Stromelysin3、CathepsinL2)和其他基因(GSTM1、BAG1、CD68)，以及用于標(biāo)準(zhǔn)化目標(biāo)檢測基因表達(dá)水平的內(nèi)參基因(ACTB、GAPDH、GUS、RPLPO和TFRC)[3]。之后又在此基礎(chǔ)上，依據(jù)21個基因表達(dá)程度，建立了分值0～100的復(fù)發(fā)風(fēng)險評分標(biāo)準(zhǔn)(recurrence score，RS)和計算公式，再結(jié)合NSABP B-20試驗入組病人，研究RS評分與10年復(fù)發(fā)風(fēng)險之間關(guān)系，建立了最初的RS評分等級。其可將乳腺癌分為低復(fù)發(fā)風(fēng)險組(RS<18)、中復(fù)發(fā)風(fēng)險組(RS=18～31)和高度復(fù)發(fā)風(fēng)險組(RS≥31)三個閾值范圍。

2.21基因檢測的預(yù)測價值：NSABPB14試驗首次驗證了21基因檢測的預(yù)后價值。在低、中、高風(fēng)險人群中，10年遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)率分別為6.8%、14.3%和30.5%[1]。2006年4月，美國國家癌癥研究所資助了第一個前瞻性研究，TAILORx(Trial Assigning Individualized Options for Treatment)臨床試驗，研究結(jié)果于2015年發(fā)表[4]。結(jié)果表明，應(yīng)用21基因檢測RS為0～10的病人只接受內(nèi)分泌治療，5年無病生存率(disease-free survival，DFS)為93.8%，5年無復(fù)發(fā)生存率(recurrence-free survival，RFS)為99.3%，5年總生存率(overall-survival rate，OS)為98.0%。表明HR陽性、HER-2陰性的cT1-2N0期的乳腺癌病人，如果RS<11，僅接受內(nèi)分泌治療的5年遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)風(fēng)險<1%，可免除不必要的化療。2019年TAILORx研究在新英格蘭雜志上發(fā)布了二次分析的結(jié)果，研究顯示對于RS評分為11～25分的HR+/HER2-，單純內(nèi)分泌治療的療效并不劣于化療聯(lián)合內(nèi)分泌治療；但從年齡分層來看，50歲或以下，RS評分16～25分的患者，化療能帶來一定的獲益。2021年NCCN指南在對21gene的推薦中也提出對于復(fù)發(fā)評分16～25歲、年齡≤50歲的患者，除內(nèi)分泌治療外應(yīng)該給予化療。

2016年4月《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》發(fā)表了法國貝格尼研究所、瑞典卡羅林斯卡醫(yī)學(xué)院、美國蒙特菲尓醫(yī)學(xué)中心，關(guān)于乳腺癌21基因表達(dá)檢測法國際多中心大樣本前瞻性驗證結(jié)果，顯示根據(jù)21基因檢測的結(jié)果，高達(dá)70%的ER陽性、淋巴結(jié)陰性的病人手術(shù)后可以免除化療[5]。

21基因在新輔助化療也進(jìn)行了相關(guān)研究。ASCO2020的一項研究顯示，穿刺活檢的復(fù)發(fā)評分結(jié)果可以預(yù)測乳腺癌對新輔助化療的反應(yīng)，21基因有助于預(yù)測早期乳腺癌病人選擇新輔助化療是否受益。復(fù)發(fā)評分≥25分的病人獲得0-1型組織學(xué)反應(yīng)的可能性要高5倍[6]。2020年SABCS公布的ADAPT研究也顯示，21基因RS評分能預(yù)測新輔助化療療效，RS>25分亞組比RS≤25分的亞組pCR率顯著升高(16.1% vs 7.2%)[7]。

3.21基因復(fù)發(fā)評分臨床加強(qiáng)版：2020年12月，美國《臨床腫瘤學(xué)雜志》在線發(fā)表了美國愛因斯坦醫(yī)學(xué)院、匹茲堡大學(xué)、哈佛大學(xué)達(dá)納法伯癌癥研究院、以色列拉賓醫(yī)療中心、特拉維夫大學(xué)的聯(lián)合研究結(jié)果[8]。該研究通過對TAILORx和NSABP B-14研究中的10 004例激素受體陽性、HER2陰性、淋巴結(jié)陰性乳腺癌病人進(jìn)行薈萃分析，結(jié)合21基因復(fù)發(fā)評分和臨床病理因素(腫瘤分級、腫瘤大小、年齡)，開發(fā)出一種新工具：復(fù)發(fā)風(fēng)險臨床加強(qiáng)版(RSClin)。之后，又根據(jù)以色列克拉利特醫(yī)療服務(wù)登記數(shù)據(jù)庫1 098例病例觀察到的遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)風(fēng)險，對RSClin推算遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)風(fēng)險的準(zhǔn)確性進(jìn)行了驗證。結(jié)果顯示，RSClin與單用復(fù)發(fā)評分或單用臨床病理因素相比，其對遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)的預(yù)測準(zhǔn)確率顯著較高(P<0.001)，并且與觀察到的10年遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)風(fēng)險非常接近(林氏一致性指數(shù)高達(dá)0.962)。對于腫瘤分級Ⅱ級、腫瘤1.5 cm的55歲乳腺癌，如果RSClin復(fù)發(fā)評分范圍為11～50，那么化療絕對獲益率僅為0～15%，可選擇避免化療。

采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，計量資料以（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，采用t檢驗；計數(shù)資料以（n，%）表示，采用χ2檢驗，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

RSClin結(jié)合了臨床病理和基因組風(fēng)險，在指導(dǎo)淋巴結(jié)陰性乳腺癌術(shù)后輔助化療方面，與單用臨床病理數(shù)據(jù)或單用基因組數(shù)據(jù)相比，其能夠提供更具個體化的療效和預(yù)后信息。

二、70基因(MammaPrint)

1.70基因概述：70基因是荷蘭癌癥研究院與Agendia公司聯(lián)合開發(fā)的一種乳腺癌多基因檢測系統(tǒng)，其采用雙色cDNA芯片技術(shù)測定包含與調(diào)控細(xì)胞周期、增殖、血管新生、侵襲、轉(zhuǎn)移、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等癌癥生物學(xué)特征相關(guān)的70個基因的表達(dá)情況。是在病人接受手術(shù)之后，作出其他治療決定之前，對乳腺癌新鮮或石蠟包埋的組織進(jìn)行檢測。早在2007年MammaPrint便已獲美國FDA批準(zhǔn)上市，成為第一個經(jīng)批準(zhǔn)的體外診斷多基因檢測產(chǎn)品。CSCO乳腺癌診療指南也在2019年將70基因檢測正式納入乳腺癌術(shù)后輔助治療的評估推薦，用于指導(dǎo)1～3個淋巴結(jié)陽性早期乳腺癌病人治療決策[9-10]。

與21基因方法類似，70基因根據(jù)基因表達(dá)水平對病人進(jìn)行評分，并限于ER陽性和淋巴結(jié)陰性乳腺癌病人，以及部分淋巴結(jié)陽性但不愿接受術(shù)后全身輔助化療病人的治療決策。但70基因只分低和高復(fù)發(fā)風(fēng)險組，以減少中間組造成的不確定性。目前MammPrint(瑪普潤)已經(jīng)在中國市場經(jīng)官方授權(quán)正版引進(jìn)。

2.70基因與MINDACT研究：作為一種預(yù)后工具，70基因檢測具有良好的預(yù)后預(yù)測價值，可將淋巴結(jié)陰性或1～3枚陽性的病人分為預(yù)后好組與預(yù)后差組，其對于乳腺癌病人復(fù)發(fā)風(fēng)險的分類精確度達(dá)98.5%，技術(shù)重復(fù)性達(dá)98.9%[11]。

為了前瞻性驗證70基因的準(zhǔn)確性，研究者開展了名為MINDACT的臨床試驗，以判定臨床指標(biāo)與基因指標(biāo)的優(yōu)劣。MINDACT研究入組了來自歐洲112個腫瘤中心的6 693例早期乳腺癌病人，以70基因檢測確定基因風(fēng)險，以Adjuvant! Online v8.0臨床病理系統(tǒng)來確定臨床風(fēng)險。若基因檢測與臨床病理系統(tǒng)均提示低風(fēng)險，病人不予化療，僅接受內(nèi)分泌治療；若兩種檢測都判斷為高風(fēng)險，則予術(shù)后化療；當(dāng)基因評估和臨床評估不一致時，隨機(jī)分為接受或不接受化療組。

2016年《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》報道該研究達(dá)到首要終點目標(biāo)，即在臨床高危(C-High)/基因低危(G-Low)組不化療的病人中，5年無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存率(DMFS)為94.7%，而化療組較不化療組的5年DMFS獲益增加只有約1.5%；而對于C-Low/G-High組，化療帶來的DMFS獲益更小。從總體上看，在全部臨床高風(fēng)險病人中，若采用70基因檢測指導(dǎo)化療，將減少46.2%的化療率[4]。

2020年ASCO大會又更新了MINDACT中位隨訪8.7年的數(shù)據(jù)，基本維持了2016年結(jié)論。更新數(shù)據(jù)后，C-High/G-Low組5年和8年DMFS分別為95.1%和90.8%，G-Low不化療組較G-High化療組預(yù)后更佳；對于C-High/G-Low病人，化療與不化療相比，5年DMFS差異是0.9%，8年DMFS差異僅增加2.6%，依然沒有統(tǒng)計學(xué)意義，也就是說C-High/G-Low組病人可以考慮豁免化療。但對于絕經(jīng)前(年齡<50歲)的C-High/G-Low病人，DMFS仍有5%化療獲益。因此，這部分病人在權(quán)衡獲益與毒副作用的基礎(chǔ)上，可以選擇化療[12]。

另一項新輔助化療前瞻性研究顯示，經(jīng)過新輔助化療的ER+/HER2-乳腺癌，MammaPrint70基因低危亞組pCR率僅為2%，而高危亞組pCR率可達(dá)到13%，而且新輔助化療的pCR率與MammaPrint分?jǐn)?shù)呈線性相關(guān)[13]。

三、50基因(PAM50)

50基因由美國北卡羅來納大學(xué)教堂山分校與Prosigna公司共同研發(fā)，其通過檢測腫瘤組織中與乳腺癌相關(guān)的50個基因的表達(dá)量來對乳腺癌進(jìn)行分型，并用于預(yù)測腫瘤小于5 cm、激素受體陽性、HER2陰性，且最多有3個淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的絕經(jīng)后早期乳腺癌，在接受激素治療5年后，10年內(nèi)出現(xiàn)遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)的風(fēng)險[14]。

2013年9月美國FDA批準(zhǔn)其用于乳腺癌預(yù)后預(yù)測的體外診斷,目前PAM50已被歐盟、澳大利亞等國家和地區(qū)批準(zhǔn)用于乳腺癌分型及預(yù)后預(yù)測。如果PAM50評分高，則表明乳腺癌轉(zhuǎn)移風(fēng)險高，除內(nèi)分泌治療外還建議病人化療；如果PAM50評分低，則僅予病人內(nèi)分泌治療即足夠。因此，PAM50能幫助一部分病人免除化療及其帶來的副作用[15]。此外，目前PAM50 還在進(jìn)行是否能幫助識別哪些ER陽性乳腺癌病人，可以從超出5年的內(nèi)分泌治療中獲益的相關(guān)研究[16]。

與21基因相比，50基因增加了分子分型，能依據(jù)分型指導(dǎo)不同亞型的輔助治療。但不足之處在于其沒有將那些和乳腺癌預(yù)后密切相關(guān)的腫瘤組織免疫基因的表達(dá)，納入風(fēng)險評估體系，因而對轉(zhuǎn)移危險評估尚待提高。

四、EndoPredict測試(12基因)

EndoPredict測試是Myriad公司推出的一項將腫瘤分子生物學(xué)狀態(tài)與臨床因素(腫瘤大小和淋巴結(jié)狀態(tài))相結(jié)合的第二代多基因檢測方法，可分析乳腺癌細(xì)胞中12個基因的活性，這些基因都與癌癥10年內(nèi)遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)的風(fēng)險相關(guān)[17]。

EndoPredict主要針對那些初診為ER陽性、HER2陰性、淋巴結(jié)陰性或者不超過3個淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的早期乳腺癌病人的基因組測試，使用的是手術(shù)或者活檢過程中切除的組織，可用于判斷腫瘤在10年之內(nèi)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的風(fēng)險，進(jìn)一步區(qū)分低復(fù)發(fā)和高復(fù)發(fā)風(fēng)險人群，幫助醫(yī)生在內(nèi)分泌治療基礎(chǔ)上，針對性地選擇是否聯(lián)合化療或者延長內(nèi)分泌治療，以進(jìn)一步減少治療不足和過度治療。

測試采用EPclin風(fēng)險評分，該評分在1.1到6.2之間，對應(yīng)于復(fù)發(fā)風(fēng)險的百分比：EPclin風(fēng)險評分高于3.328 7(高于10%的復(fù)發(fā)風(fēng)險)為高復(fù)發(fā)風(fēng)險；風(fēng)險評分低于3.328 7(低于10%的復(fù)發(fā)風(fēng)險)為低復(fù)發(fā)風(fēng)險。

五、72基因

2018年10月，由復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院和美國北卡羅來納大學(xué)Lineberger癌癥研究中心牽頭，聯(lián)合國內(nèi)多家機(jī)構(gòu)共同完成了一項腫瘤內(nèi)免疫基因表達(dá)對乳腺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險影響的研究，首次將免疫相關(guān)基因表達(dá)引入乳腺癌預(yù)后及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險評估。該研究通過對5000余例乳腺癌全基因表達(dá)譜及臨床數(shù)據(jù)分析，篩選出17個與預(yù)后密切相關(guān)的免疫基因，這些基因?qū)R陰性、增殖基因高表達(dá)的乳腺癌病人發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險有顯著影響。有進(jìn)一步結(jié)合以往研究結(jié)果，建立了72基因乳腺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險預(yù)測模型PrecitypeDx[18]。

乳腺癌72基因檢測是基于亞洲人群浸潤性乳腺癌設(shè)計優(yōu)化的多基因檢測工具，其通過二代測序(NGS)方法，對乳腺癌腫瘤組織中72個基因(免疫相關(guān)基因、增殖相關(guān)基因、基底細(xì)胞相關(guān)基因、ER相關(guān)基因、HER2相關(guān)基因、侵襲相關(guān)基因和參考基因)的表達(dá)進(jìn)行檢測。根據(jù)各基因的表達(dá)譜特征，對乳腺癌進(jìn)行亞型分型，得到五種分子亞型：(1)管腔A型(Luminal A) ；(2)管腔B型(Luminal B) ；(3)HER2富集型(HER2-enriched) ；(4)基底細(xì)胞型(Basal-like) ；(5)免疫增強(qiáng)型(Immune-enhanced)。并可以對其治療給出不同建議。

另外72基因可結(jié)合增殖指數(shù)(proliferation score)和免疫指數(shù)(immune score)來計算風(fēng)險，將最終的檢測結(jié)果量化為一個0到100之間的數(shù)字，以得到一個復(fù)發(fā)風(fēng)險評分(PRS)，進(jìn)而預(yù)測5年和10年內(nèi)遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)風(fēng)險。72基因有望為臨床治療方案的選擇提供更有用的支持信息。

六、不足之處及展望

2017年版的《中國抗癌協(xié)會乳腺癌診治指南與規(guī)范》提出，乳腺癌術(shù)后輔助全身治療的選擇，應(yīng)基于復(fù)發(fā)風(fēng)險個體化評估與腫瘤病理分子分型及對不同治療方案的反應(yīng)性。多基因檢測的目的在于幫助乳癌病人避免過度治療或治療不足。但在國內(nèi)目前還沒有自主研發(fā)的成熟多基因產(chǎn)品，現(xiàn)有的多基因檢測技術(shù)在研發(fā)過程中缺乏中國病人的隨訪數(shù)據(jù)，檢測結(jié)果用于指導(dǎo)中國病人的臨床治療存在一定的不確定性。

有報道稱通過對6個多基因檢測工具進(jìn)行兩兩比較后，一致性僅有36%～74%。另有研究提示，不同檢測工具之間的一致性差，如30%在70基因檢測中評價為高風(fēng)險人群，卻被21基因檢測評價為低風(fēng)險[19]。此外，基因檢測只能預(yù)測特定人群的復(fù)發(fā)風(fēng)險與化療獲益，無法制定個體化的化療方案，也無法預(yù)測高危病人輔助化療后的殘存風(fēng)險。而國內(nèi)檢測費用高昂，檢測機(jī)構(gòu)不規(guī)范，也限制了分子診斷在臨床上的推廣和應(yīng)用。

分子診斷檢測技術(shù)本身是精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的體現(xiàn)，利于制定個體化的治療方案。盡快糾正國內(nèi)現(xiàn)有檢測混亂現(xiàn)象，可讓病人盡早享受到該技術(shù)帶來的獲益。但在目前循證醫(yī)學(xué)證據(jù)下，分子診斷只能作為傳統(tǒng)臨床病理因素的補(bǔ)充和有限應(yīng)用于特定病人。未來依靠高通量平臺建立多組學(xué)特征譜、多學(xué)科交叉預(yù)測模型及多節(jié)點動態(tài)監(jiān)測復(fù)發(fā)風(fēng)險，應(yīng)成為乳腺癌多基因檢測的發(fā)展方向。