丁海月，薛 冰，刁華瓊，魏 丹，李小黎

神經干細胞(neural stem cells，NSCs)是指分布于神經系統(tǒng)的具有自我更新和多分化潛能的干細胞。其主要功能是作為一種儲備，參與神經系統(tǒng)損傷修復或細胞正常死亡的更新。因此，NSCs在中樞神經系統(tǒng)損傷和退行性疾病中可能發(fā)揮重要的治療作用[1-2]，如帕金森病、阿爾茨海默病、缺血性腦卒中等疾病[3]。腦內海馬區(qū)分布的NSCs較多，尤其海馬齒狀回是哺乳動物腦內存在NSCs的主要區(qū)域之一。NSCs的增殖與分化有益于神經系統(tǒng)的生長發(fā)育，對學習和記憶有著重要的作用[4-5]。然而NSCs的原代培養(yǎng)難度大，細胞活力低，純度不高。因此，本實驗取新生大鼠海馬組織，總結一種體外培養(yǎng)海馬NSCs的簡便方法，為進一步研究神經系統(tǒng)疾病中NSCs的增殖分化提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 新生24 h的SD大鼠，普通無特定病原體(SPF)級，由斯貝福(北京)生物技術有限公司提供，許可證號：SCXK(京)2019-0010。

1.2 主要試劑與儀器 DMEM/F12培養(yǎng)基、B27、青鏈霉素(美國Gibco公司)；表皮生長因子(EGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF，美國Proteintech公司)；D-Hanks液(美國HyClone公司)；5-嗅-2-脫氧尿苷(5-Bromo-2-deoxy-uridine，BrdU)、二甲基亞砜(DMSO)、多聚賴氨酸(美國Sigma公司)；兔抗巢蛋白(Nestin)抗體、小鼠抗BrdU抗體、異硫氰酸熒光素(FITC)標記的羊抗兔IgG、Cy3標記羊抗小鼠IgG(美國Peprotech公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱(德國Memmert公司)；激光共聚焦顯微鏡(日本OLYMPUS公司)。

1.3 海馬NSCs的培養(yǎng)與鑒定

1.3.1 溶液配制及器材準備 培養(yǎng)基：DMEM/F12培養(yǎng)液、20 ng/mL EGF、20 ng/mL bFGF、2% B27、1%雙抗(青霉素、鏈霉素)。取材用的手術器械、玻璃燒杯及玻璃培養(yǎng)皿、濾紙等要提前高壓蒸汽滅菌，然后放置于60 ℃烘箱中干燥4～6 h。

1.3.2 預處理 鑒定所用的細胞爬片需要提前用多聚賴氨酸處理，具體步驟為：將細胞爬片浸在多聚賴氨酸溶液中，常溫放置5 min，然后吸去多余多聚賴氨酸，超凈臺中晾干，然后用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗3次，晾干備用。

1.3.3 取材及培養(yǎng) 新生24 h的SD大鼠，用75%的乙醇浸泡消毒10 min后剪下大鼠頭部，移入放有無菌濾紙的培養(yǎng)皿中(濾紙用于吸去多余血水)。彎鑷夾住大鼠眼眶以固定頭部，用眼科剪從斷頭切口的中線將頭皮和顱骨剪至嗅球部，用另一把鑷子將頭皮及顱骨向兩側掀開，暴露出大小腦及延髓，用鑷子夾斷正前方嗅球與全腦的連接，并從側面輕輕將全腦與腦底分離，小心將全腦取出放入一個盛有D-Hanks液的培養(yǎng)皿中。因左右大腦相連，用游絲鑷在大腦皮層背側表面正中矢狀位夾斷，使左右腦分開，并向外側小心掀開大腦皮質表面，即可見“C”形海馬臥在皮層內，用游絲鑷夾斷海馬前后及邊緣組織，即可分離出整個海馬，然后將周圍的腦膜剝離干凈(以見不到含有血管的腦膜為佳)，將剝離出的海馬單獨放置在盛有DMEM/F12培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中。將海馬組織剪成1 mm3大小的組織塊，吹打40～60次，制成細胞懸液，過40 μm細胞篩，收集入離心管中，1 000 r/min室溫離心5～10 min，加培養(yǎng)基重懸細胞，再反復吹打20次，取少量細胞懸液加在計數板上，在顯微鏡下計數細胞密度，以1.5×105～2.5×105個/mL接種于培養(yǎng)皿或25 mL的培養(yǎng)瓶中，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每隔3 d半量換液，5～7 d可傳代1次，每天在熒光倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況。

1.3.4 鑒定 取傳代后第3天的海馬NSCs，在培養(yǎng)皿中加入BrdU，終濃度為10 μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。然后再接種到放有預先處理過多聚賴氨酸的細胞爬片的6孔板中，孵育24 h使細胞貼壁。在培養(yǎng)板中將已經爬好細胞的玻片用PBS洗3次，每次5 min；用4%多聚甲醛常溫固定30 min，PBS洗3次，每次5 min；用含0.3%的TritonX-100的PBS溶液室溫破膜30 min，PBS洗3次，每次5 min；含10%山羊血清的PBS液室溫下封閉1 h，除去山羊血清，不洗；分別滴加用PBS稀釋后的兔抗Nestin單克隆抗體(1∶100)、小鼠抗BrdU抗體(1∶200)4 ℃過夜，清洗3次后，分別加入含FITC標記的羊抗兔、Cy3標記羊抗小鼠IgG(1∶100)的PBS溶液，室溫避光1 h，清洗3次后在激光共聚焦顯微鏡下觀察并攝片。

2 結 果

2.1 NSCs的生長情況 第1天可見細胞懸浮生長，形態(tài)不一，體積微小，有少量大小不等的片狀物及雜質，因細胞是懸浮生長，所以培養(yǎng)基的每個層面都存在細胞，鏡下會很密集(圖1A)。第3天可見片狀物減少，雜質越來越少，大量的單個細胞懸浮生長，細胞呈球形(圖1B)。第5天可見細胞數量增多，體積變大，多個神經球易聚集形成細胞團似桑葚樣，細胞團體積大小各不相同，周圍有新增殖的體積相對較小的神經球，無明顯的片狀物，雜質細胞越來越少(圖1C)。當神經球中心開始變黃變暗時需要傳代，若繼續(xù)培養(yǎng)細胞球很可能貼壁分化，每5～7 d可傳代1次。

圖1 海馬NSCs生長情況(×200)

2.2 NSCs的鑒定 將第2代培養(yǎng)的NSCs懸液行Nestin、BrdU的免疫熒光細胞化學染色鑒定。鑒定結果表明，培養(yǎng)的NSCs呈Nestin陽性(圖2A)；部分細胞檢測為BrdU陽性(圖2B)；說明本實驗方法培養(yǎng)出的細胞為NSCs且具有增殖能力。詳見圖2。

圖2 海馬NSCs鑒定(×600)

3 討 論

NSCs是一類能夠向特定類型神經元或神經膠質細胞分化的原始細胞的總稱，對NSCs的研究已經成為神經科學中重要的領域。有研究發(fā)現，NSCs移植治療神經退行性疾病在動物模型中顯示出有益的作用[6]。王凌飛[7]認為NSCs移植治療具有保護血腦屏障、抑制炎癥反應、促進神經發(fā)生等作用，是治療缺血性腦卒中的有效方法。NSCs用于神經功能障礙等疾病的治療具有廣闊的開發(fā)前景，一直以來都是研究的重點方向。

本實驗中海馬組織的正確取出對細胞的培養(yǎng)極為重要，因為鼠腦的海馬組織過小，肉眼難以分辨，且腦組織柔軟，易融為一體，所以原代培養(yǎng)取材難度大，且純度不夠高，雜質細胞多，成活率低。研究表明用新生鼠培養(yǎng)NSCs取材相對簡單，且不易造成污染，選用孕鼠海馬的取材難度大[8]。這是因為新生鼠與孕鼠相比腦組織更大，易分辨，操作更容易，不易損傷，獲得的海馬組織更多更完整，從而使得培養(yǎng)的細胞無其他混雜細胞的生長，純度高，因此，本實驗選用新生鼠作為細胞培養(yǎng)的來源。其次，腦組織易融化，取材過程在冰盒上進行，所用到的試劑要提前預冷，低溫能保持海馬形態(tài)，同時提高細胞活力。取出的全腦要放在盛有無酚紅的D-Hanks液中，無色透明的D-Hanks液可以使全腦的形態(tài)完整呈現出來，即肉眼下就可操作而不用借助解剖顯微鏡，避免污染，相比苗宗寧等[9]在顯微鏡下操作更簡便。按照本實驗方法取材，可以清楚地看到海馬的位置，能較完整地剝離出海馬，縮短取材時間，快速培養(yǎng)，可以用于培養(yǎng)海馬NSCs，選用不同的培養(yǎng)基也可用來培養(yǎng)海馬神經元。

在細胞培養(yǎng)過程中，NSCs不斷增殖，周圍雜質逐漸減少，純度不斷增加，其關鍵在于海馬組織的完整性。培養(yǎng)的第一代NSCs經臺盼藍染色計數細胞存活率高達96%，與實驗過程中的操作有關，動作越輕柔，細胞損傷越小，取材速度越快，細胞活性越高。Nestin是目前作為識別NSCs的重要標志蛋白，Nestin陽性細胞具有干細胞的特征。BrdU可以替代胸腺嘧啶在細胞增殖時期滲入DNA，是反映增殖能力的重要指標。本實驗對第二代細胞進行鑒定，結果顯示幾乎所有的細胞都呈Nestin陽性，表明培養(yǎng)的細胞為NSCs，且純度較高，大部分細胞呈BrdU陽性，顯示NSCs具有較強的增殖力。

中醫(yī)藥治療神經系統(tǒng)疾病具有一定的優(yōu)勢，在動物實驗中發(fā)現中藥可以誘導體內海馬NSCs增殖分化，從而保護腦損傷[10]。有研究者在離體實驗中通過培養(yǎng)NSCs來探討中藥對疾病的治療作用。陳琳等[11]發(fā)現三七總皂苷對缺糖缺氧-再灌注損傷新生大鼠海馬NSCs具有保護作用；Han等[12]建立糖尿病腦病的細胞模型，發(fā)現降糖膠囊對海馬NSCs存活、自我更新和分化產生積極作用；為了探討補益脾胃元氣類方藥治療阿爾茨海默病的作用，岳濤等[13]研究方藥對海馬NSCs增殖分化的影響。因此，培養(yǎng)獲得穩(wěn)定的NSCs是關鍵，為下一步探討中藥對海馬NSCs增殖分化的作用提供支持。

綜上所述，本實驗以新生大鼠培養(yǎng)海馬NSCs，對海馬的損傷小，細胞活力高，并且操作簡便，降低了原代取材的難度。細胞的成功培養(yǎng)為下一步的實驗研究奠定了基礎。