溫曉敏，焦 蓉，張愛明，葉明陽，王文翔

新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE)是新生兒因圍生期窒息引起中樞神經(jīng)缺氧缺血性顱腦損傷[1]。HIE是嬰幼兒神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙的主要原因，屬于新生兒常見疾病，致死率較高，預(yù)后較差，臨床上缺少有效病情診斷的分子標(biāo)志物[2]。新生兒行為神經(jīng)測定(neonatal behavioral neurological assessment，NBNA)評(píng)分是早期評(píng)估新生兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能受損和預(yù)后的敏感指標(biāo)。相較于頭顱CT、Sarnat分度等方法，NBNA評(píng)分具有更高的特異性、敏感度，且更為簡便、全面[3]。低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1 alpha，HIF-1α)與HIE發(fā)生有關(guān)，其作用是在氧分壓較低的環(huán)境下維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[4]。微小RNA-210(microRNA-210，miR-210)是miRNA一員，參與生物體細(xì)胞增殖、分化、凋亡等[5]。研究表明，miR-210與新生兒HIE密切相關(guān)[6]。NBNA評(píng)分及HIF-1α、miR-210均能在一定程度上反映HIE病情發(fā)展，因此，若將NBNA評(píng)分與HIF-1α、miR-210測定聯(lián)合，對疾病診斷可能更加全面。但目前探討三者在新生兒HIE病情發(fā)展中的相關(guān)性，從而將HIF-1α、miR-210及NBNA評(píng)分聯(lián)合應(yīng)用于新生兒HIE早期診斷的研究較少。因此，本研究通過檢測HIE新生兒血清中HIF-1α、miR-210水平，同時(shí)測定NBNA評(píng)分，探討二者與NBNA評(píng)分之間的相關(guān)性，從而為臨床上開發(fā)新生兒HIE病情的診斷指標(biāo)提供新思路，對評(píng)價(jià)其早期危險(xiǎn)性具有重要意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年3月—2019年2月本院收治的80例HIE新生兒為研究對象(HIE組)，同期選取75名正常新生兒作為對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科分會(huì)新生兒組學(xué)對新生兒HIE的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；②臨床資料齊全者；③出生24 h內(nèi)入院者；④母孕期體健，無煙酒等不良嗜好者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴有心肺疾病者；②伴有其他并發(fā)癥及感染性疾病者；③先天性畸形者；④先天性遺傳代謝性疾病者。本試驗(yàn)經(jīng)醫(yī)院臨床研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，符合倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，所有研究對象均由專業(yè)人員詳細(xì)告知家長研究內(nèi)容并同意參加，并簽署知情同意書。收集兩組一般資料，包括胎齡、性別、出生體重等，記錄Apgar評(píng)分，包括肌張力、脈搏、皺眉動(dòng)作即對刺激的反應(yīng)、外貌、呼吸，理論最高值10分。

1.2 主要試劑與儀器 缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)分析檢測試劑盒(貨號(hào)：FK-KJ0389)，購自上海樊克生物科技有限公司；RNA提取試劑盒(貨號(hào)：dp419)，購自北京天根生化有限公司；AceQ qPCR SYBR?Green Mix(貨號(hào)：Q111-02)，購自南京諾唯贊生物科技有限公司；miScript SYBR?Green qPCR Kit(貨號(hào)：218076)，購自德國QIAGEN公司。ABI7700實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)儀，購自美國Applied Biosystems公司。

1.3 研究方法

1.3.1 樣品采集及保存 抽取兩組新生兒清晨空腹靜脈血，3 000 r/min離心15 min后收集血清，置于-80 ℃保存待測。

1.3.2 檢測血清相關(guān)指標(biāo) 檢測血清相關(guān)指標(biāo)，包括血清總鈣(calcium，Ca)、血清天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate amino transferase，AST)、乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)、肌酸激酶(creatine kinase，CK)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase-MB，CK-MB)水平。

1.3.3 檢測血清中HIF-1α水平 ELISA法檢測兩組新生兒血清HIF-1α水平，檢測方法嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.4 檢測血清miR-210水平 采用qRT-PCR法檢測兩組新生兒血清miR-210水平。采用RNA提取試劑盒提取血清總RNA，反轉(zhuǎn)錄得cDNA。采用qRT-PCR儀對miR-210進(jìn)行擴(kuò)增。qRT-PCR反應(yīng)體系共10 μL：cDNA(50 ng/μL)1 μL，miScript SYBR?Green Mix 5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，ddH2O 3.0 μL，引物由上海生工生物公司合成。反應(yīng)條件：95 ℃、10 min；95 ℃、30 s，58 ℃、1 min，40個(gè)循環(huán)；72 ℃，10 min。miR-210及內(nèi)參U6引物序列見表1。采用2-△△CT法對血清miR-210表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.5 新生兒NBNA評(píng)分檢測 新生兒出生后均于第7天進(jìn)行NBNA評(píng)分，檢測項(xiàng)目主要包括：主動(dòng)肌張力、被動(dòng)肌張力、新生兒行為能力、原始反射、一般反應(yīng)。滿分40分，NBNA評(píng)分>36分者正常，35～36分者臨界異常，<35分者異常。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，采用t檢驗(yàn)；定性資料采用χ2檢驗(yàn)；采用Pearson法分析HIE新生兒血清HIF-1α、miR-210水平與NBNA評(píng)分的相關(guān)性；Logistic回歸分析新生兒HIE的影響因素。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組一般資料比較 兩組胎齡、性別、出生體重比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。HIE組Apgar評(píng)分明顯低于對照組(P<0.05)。詳見表2。

表2 兩組臨床資料比較

2.2 兩組血清HIF-1α、miR-210水平及NBNA評(píng)分比較 HIE組血清HIF-1α、miR-210水平明顯高于對照組(P<0.05)，NBNA評(píng)分明顯低于對照組(P<0.05)。詳見表3。

表3 兩組血清HIF-1α、miR-210水平及NBNA評(píng)分比較 (x±s)

2.3 兩組血清相關(guān)指標(biāo)比較 兩組血清Ca比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。HIE組血清AST、LDH、CK、CK-MB水平明顯高于對照組(P<0.05)。詳見表4。

表4 兩組血清相關(guān)指標(biāo)比較 (x±s)

2.4 HIE新生兒血清HIF-1α、miR-210水平與NBNA評(píng)分的相關(guān)性 Pearson法分析結(jié)果顯示，HIE新生兒血清HIF-1α、miR-210水平與NBNA評(píng)分均呈負(fù)相關(guān)(r值分別為-0.559、-0.567，P均<0.05)。詳見圖1、圖2。

圖1 HIE新生兒血清HIF-1α水平與NBNA評(píng)分的相關(guān)性

圖2 HIE新生兒血清miR-210水平與NBNA評(píng)分的相關(guān)性

2.5 HIE新生兒HIF-1α、miR-210及NBNA評(píng)分與血清相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性 Pearson法分析結(jié)果顯示，HIE新生兒血清AST、LDH、CK、CK-MB與HIF-1α、miR-210呈正相關(guān)(P<0.05)，與NBNA評(píng)分呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。詳見表5。

表5 HIE新生兒HIF-1α、miR-210及NBNA評(píng)分與血清相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性

2.6 影響新生兒HIE的多因素分析 將新生兒是否發(fā)生HIE作為因變量，以HIF-1α、miR-210、NBNA評(píng)分、Apgar評(píng)分、AST、LDH、CK、CK-MB為自變量進(jìn)行Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，HIF-1α、CK-MB是影響新生兒HIE的危險(xiǎn)因素，NBNA評(píng)分是影響新生兒HIE的保護(hù)因素。詳見表6。

表6 影響新生兒HIE的多因素分析

3 討 論

新生兒HIE發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，新生兒發(fā)生HIE后腦能量代謝衰竭，大量中性粒細(xì)胞及氧自由基相互作用導(dǎo)致新生兒腦功能出現(xiàn)損傷，是臨床上圍生期新生兒致殘甚至死亡的主要原因之一[8]。新生兒HIE會(huì)引發(fā)多種神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，使得社會(huì)整體人口素質(zhì)降低，家庭生活質(zhì)量也嚴(yán)重下降[9]。因此，尋找早期評(píng)估和診斷腦損傷的指標(biāo)，對臨床上新生兒HIE治療和預(yù)后有重要意義。

HIF-1α受缺氧信號(hào)調(diào)控，其C末端是活性調(diào)控區(qū)域，能感受缺氧信號(hào)[10]。當(dāng)機(jī)體缺氧時(shí)，HIF-1α聚集并與HIF-1β結(jié)合形成復(fù)合物，進(jìn)而激活下游相關(guān)靶基因，調(diào)節(jié)一系列生長介質(zhì)和細(xì)胞因子變化從而對疾病造成影響。HIE發(fā)生時(shí)，HIF-1α通過激活凋亡相關(guān)基因，使腦組織適應(yīng)缺氧環(huán)境，從而發(fā)揮重要作用[11]。miR-210參與缺氧缺血環(huán)境下臟器組織出現(xiàn)的血管新生，與供血和保護(hù)神經(jīng)元作用關(guān)系密切。miR-210能調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，腦缺血損傷后miR-210參與組織損傷后的神經(jīng)發(fā)生過程。且miR-210能破壞HIE血腦屏障完整性，誘導(dǎo)HIE新生兒出現(xiàn)腦水腫[12]。NBNA評(píng)分是一項(xiàng)簡單實(shí)用的用于新生兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損及HIE預(yù)后評(píng)定的方法[13]，是北京協(xié)和醫(yī)院兒科主任鮑秀蘭教授以美國和法國新生兒行為神經(jīng)測定法為基礎(chǔ)，結(jié)合臨床經(jīng)驗(yàn)而創(chuàng)定的評(píng)分方法，20個(gè)項(xiàng)目共40分，具有較好的特異性和靈敏度。郭穎等[13]通過檢測HIE患兒血清HIF-1α水平并對其進(jìn)行NBNA評(píng)分，證明HIE患兒血清HIF-1α水平隨病情加重而升高，且與NBNA評(píng)分呈負(fù)相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，HIE組血清HIF-1α、miR-210水平明顯高于對照組，NBNA評(píng)分明顯低于對照組；HIE新生兒血清HIF-1α、miR-210水平與NBNA評(píng)分均呈負(fù)相關(guān)。提示HIE患兒血清HIF-1α、miR-210水平與病情的發(fā)生、發(fā)展有密切聯(lián)系。分析血清中HIF-1α、miR-210可能通過某種聯(lián)系影響新生兒神經(jīng)系統(tǒng)損傷，進(jìn)而影響NBNA評(píng)分，進(jìn)一步提示三者都可作為評(píng)估新生兒HIE的參考指標(biāo)。

研究顯示，Apgar評(píng)分是表征新生兒窒息程度的一項(xiàng)指標(biāo)，可作為新生兒未來腦部受損、發(fā)展及預(yù)后的參考指標(biāo)[14]。且有研究發(fā)現(xiàn)，HIE新生兒血清酶AST、LDH等水平與病情程度成正比[15]。本研究中兩組胎齡、性別、出生體重比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。HIE組Apgar評(píng)分明顯低于對照組。提示HIE患兒Apgar評(píng)分較低，其窒息程度相對較嚴(yán)重。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，HIE組血清AST、LDH、CK、CK-MB水平均明顯高于對照組。HIE新生兒血清AST、LDH、CK、CK-MB與HIF-1α、miR-210呈正相關(guān)，與NBNA評(píng)分呈負(fù)相關(guān)。提示HIE患兒血清酶AST、LDH等水平較正常新生兒高表達(dá)，且與HIE病情程度呈正相關(guān)。Logistic回歸分析結(jié)果顯示，HIF-1α、CK-MB是影響新生兒HIE的危險(xiǎn)因素，NBNA評(píng)分是新生兒HIE的保護(hù)因素。提示臨床上可密切監(jiān)測新生兒HIF-1α、CK-MB、NBNA評(píng)分，以便及時(shí)采取治療措施，降低發(fā)病概率。

綜上所述，HIE新生兒血清HIF-1α、miR-210水平與NBNA評(píng)分均呈負(fù)相關(guān)，三者與新生兒HIE病情發(fā)展密切相關(guān)。將NBNA評(píng)分與HIF-1α、miR-210測定聯(lián)合，能更加全面地評(píng)價(jià)新生兒HIE的早期危險(xiǎn)性及預(yù)測預(yù)后，對新指標(biāo)的開發(fā)、應(yīng)用具有重要的臨床意義。但HIF-1α、miR-210水平影響新生兒HIE病情的具體作用機(jī)制尚不十分明確，有待進(jìn)一步深入研究。