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        新生兒缺氧缺血性腦病血清HIF-1α、miR-210水平與NBNA評(píng)分的相關(guān)性

        2021-04-14 13:33:42溫曉敏張愛明葉明陽王文翔
        關(guān)鍵詞:病情新生兒血清

        溫曉敏,焦 蓉,張愛明,葉明陽,王文翔

        新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy,HIE)是新生兒因圍生期窒息引起中樞神經(jīng)缺氧缺血性顱腦損傷[1]。HIE是嬰幼兒神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙的主要原因,屬于新生兒常見疾病,致死率較高,預(yù)后較差,臨床上缺少有效病情診斷的分子標(biāo)志物[2]。新生兒行為神經(jīng)測定(neonatal behavioral neurological assessment,NBNA)評(píng)分是早期評(píng)估新生兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能受損和預(yù)后的敏感指標(biāo)。相較于頭顱CT、Sarnat分度等方法,NBNA評(píng)分具有更高的特異性、敏感度,且更為簡便、全面[3]。低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1 alpha,HIF-1α)與HIE發(fā)生有關(guān),其作用是在氧分壓較低的環(huán)境下維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[4]。微小RNA-210(microRNA-210,miR-210)是miRNA一員,參與生物體細(xì)胞增殖、分化、凋亡等[5]。研究表明,miR-210與新生兒HIE密切相關(guān)[6]。NBNA評(píng)分及HIF-1α、miR-210均能在一定程度上反映HIE病情發(fā)展,因此,若將NBNA評(píng)分與HIF-1α、miR-210測定聯(lián)合,對疾病診斷可能更加全面。但目前探討三者在新生兒HIE病情發(fā)展中的相關(guān)性,從而將HIF-1α、miR-210及NBNA評(píng)分聯(lián)合應(yīng)用于新生兒HIE早期診斷的研究較少。因此,本研究通過檢測HIE新生兒血清中HIF-1α、miR-210水平,同時(shí)測定NBNA評(píng)分,探討二者與NBNA評(píng)分之間的相關(guān)性,從而為臨床上開發(fā)新生兒HIE病情的診斷指標(biāo)提供新思路,對評(píng)價(jià)其早期危險(xiǎn)性具有重要意義。

        1 資料與方法

        1.1 一般資料 選取2016年3月—2019年2月本院收治的80例HIE新生兒為研究對象(HIE組),同期選取75名正常新生兒作為對照組。納入標(biāo)準(zhǔn):①符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科分會(huì)新生兒組學(xué)對新生兒HIE的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7];②臨床資料齊全者;③出生24 h內(nèi)入院者;④母孕期體健,無煙酒等不良嗜好者。排除標(biāo)準(zhǔn):①伴有心肺疾病者;②伴有其他并發(fā)癥及感染性疾病者;③先天性畸形者;④先天性遺傳代謝性疾病者。本試驗(yàn)經(jīng)醫(yī)院臨床研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn),符合倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn),所有研究對象均由專業(yè)人員詳細(xì)告知家長研究內(nèi)容并同意參加,并簽署知情同意書。收集兩組一般資料,包括胎齡、性別、出生體重等,記錄Apgar評(píng)分,包括肌張力、脈搏、皺眉動(dòng)作即對刺激的反應(yīng)、外貌、呼吸,理論最高值10分。

        1.2 主要試劑與儀器 缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)分析檢測試劑盒(貨號(hào):FK-KJ0389),購自上海樊克生物科技有限公司;RNA提取試劑盒(貨號(hào):dp419),購自北京天根生化有限公司;AceQ qPCR SYBR?Green Mix(貨號(hào):Q111-02),購自南京諾唯贊生物科技有限公司;miScript SYBR?Green qPCR Kit(貨號(hào):218076),購自德國QIAGEN公司。ABI7700實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)儀,購自美國Applied Biosystems公司。

        1.3 研究方法

        1.3.1 樣品采集及保存 抽取兩組新生兒清晨空腹靜脈血,3 000 r/min離心15 min后收集血清,置于-80 ℃保存待測。

        1.3.2 檢測血清相關(guān)指標(biāo) 檢測血清相關(guān)指標(biāo),包括血清總鈣(calcium,Ca)、血清天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate amino transferase,AST)、乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase,LDH)、肌酸激酶(creatine kinase,CK)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase-MB,CK-MB)水平。

        1.3.3 檢測血清中HIF-1α水平 ELISA法檢測兩組新生兒血清HIF-1α水平,檢測方法嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

        1.3.4 檢測血清miR-210水平 采用qRT-PCR法檢測兩組新生兒血清miR-210水平。采用RNA提取試劑盒提取血清總RNA,反轉(zhuǎn)錄得cDNA。采用qRT-PCR儀對miR-210進(jìn)行擴(kuò)增。qRT-PCR反應(yīng)體系共10 μL:cDNA(50 ng/μL)1 μL,miScript SYBR?Green Mix 5 μL,上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL,ddH2O 3.0 μL,引物由上海生工生物公司合成。反應(yīng)條件:95 ℃、10 min;95 ℃、30 s,58 ℃、1 min,40個(gè)循環(huán);72 ℃,10 min。miR-210及內(nèi)參U6引物序列見表1。采用2-△△CT法對血清miR-210表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。

        表1 qRT-PCR引物序列

        1.3.5 新生兒NBNA評(píng)分檢測 新生兒出生后均于第7天進(jìn)行NBNA評(píng)分,檢測項(xiàng)目主要包括:主動(dòng)肌張力、被動(dòng)肌張力、新生兒行為能力、原始反射、一般反應(yīng)。滿分40分,NBNA評(píng)分>36分者正常,35~36分者臨界異常,<35分者異常。

        1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,采用t檢驗(yàn);定性資料采用χ2檢驗(yàn);采用Pearson法分析HIE新生兒血清HIF-1α、miR-210水平與NBNA評(píng)分的相關(guān)性;Logistic回歸分析新生兒HIE的影響因素。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié) 果

        2.1 兩組一般資料比較 兩組胎齡、性別、出生體重比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。HIE組Apgar評(píng)分明顯低于對照組(P<0.05)。詳見表2。

        表2 兩組臨床資料比較

        2.2 兩組血清HIF-1α、miR-210水平及NBNA評(píng)分比較 HIE組血清HIF-1α、miR-210水平明顯高于對照組(P<0.05),NBNA評(píng)分明顯低于對照組(P<0.05)。詳見表3。

        表3 兩組血清HIF-1α、miR-210水平及NBNA評(píng)分比較 (x±s)

        2.3 兩組血清相關(guān)指標(biāo)比較 兩組血清Ca比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。HIE組血清AST、LDH、CK、CK-MB水平明顯高于對照組(P<0.05)。詳見表4。

        表4 兩組血清相關(guān)指標(biāo)比較 (x±s)

        2.4 HIE新生兒血清HIF-1α、miR-210水平與NBNA評(píng)分的相關(guān)性 Pearson法分析結(jié)果顯示,HIE新生兒血清HIF-1α、miR-210水平與NBNA評(píng)分均呈負(fù)相關(guān)(r值分別為-0.559、-0.567,P均<0.05)。詳見圖1、圖2。

        圖1 HIE新生兒血清HIF-1α水平與NBNA評(píng)分的相關(guān)性

        圖2 HIE新生兒血清miR-210水平與NBNA評(píng)分的相關(guān)性

        2.5 HIE新生兒HIF-1α、miR-210及NBNA評(píng)分與血清相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性 Pearson法分析結(jié)果顯示,HIE新生兒血清AST、LDH、CK、CK-MB與HIF-1α、miR-210呈正相關(guān)(P<0.05),與NBNA評(píng)分呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。詳見表5。

        表5 HIE新生兒HIF-1α、miR-210及NBNA評(píng)分與血清相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性

        2.6 影響新生兒HIE的多因素分析 將新生兒是否發(fā)生HIE作為因變量,以HIF-1α、miR-210、NBNA評(píng)分、Apgar評(píng)分、AST、LDH、CK、CK-MB為自變量進(jìn)行Logistic回歸分析,結(jié)果顯示,HIF-1α、CK-MB是影響新生兒HIE的危險(xiǎn)因素,NBNA評(píng)分是影響新生兒HIE的保護(hù)因素。詳見表6。

        表6 影響新生兒HIE的多因素分析

        3 討 論

        新生兒HIE發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜,新生兒發(fā)生HIE后腦能量代謝衰竭,大量中性粒細(xì)胞及氧自由基相互作用導(dǎo)致新生兒腦功能出現(xiàn)損傷,是臨床上圍生期新生兒致殘甚至死亡的主要原因之一[8]。新生兒HIE會(huì)引發(fā)多種神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥,使得社會(huì)整體人口素質(zhì)降低,家庭生活質(zhì)量也嚴(yán)重下降[9]。因此,尋找早期評(píng)估和診斷腦損傷的指標(biāo),對臨床上新生兒HIE治療和預(yù)后有重要意義。

        HIF-1α受缺氧信號(hào)調(diào)控,其C末端是活性調(diào)控區(qū)域,能感受缺氧信號(hào)[10]。當(dāng)機(jī)體缺氧時(shí),HIF-1α聚集并與HIF-1β結(jié)合形成復(fù)合物,進(jìn)而激活下游相關(guān)靶基因,調(diào)節(jié)一系列生長介質(zhì)和細(xì)胞因子變化從而對疾病造成影響。HIE發(fā)生時(shí),HIF-1α通過激活凋亡相關(guān)基因,使腦組織適應(yīng)缺氧環(huán)境,從而發(fā)揮重要作用[11]。miR-210參與缺氧缺血環(huán)境下臟器組織出現(xiàn)的血管新生,與供血和保護(hù)神經(jīng)元作用關(guān)系密切。miR-210能調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育,腦缺血損傷后miR-210參與組織損傷后的神經(jīng)發(fā)生過程。且miR-210能破壞HIE血腦屏障完整性,誘導(dǎo)HIE新生兒出現(xiàn)腦水腫[12]。NBNA評(píng)分是一項(xiàng)簡單實(shí)用的用于新生兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損及HIE預(yù)后評(píng)定的方法[13],是北京協(xié)和醫(yī)院兒科主任鮑秀蘭教授以美國和法國新生兒行為神經(jīng)測定法為基礎(chǔ),結(jié)合臨床經(jīng)驗(yàn)而創(chuàng)定的評(píng)分方法,20個(gè)項(xiàng)目共40分,具有較好的特異性和靈敏度。郭穎等[13]通過檢測HIE患兒血清HIF-1α水平并對其進(jìn)行NBNA評(píng)分,證明HIE患兒血清HIF-1α水平隨病情加重而升高,且與NBNA評(píng)分呈負(fù)相關(guān)。本研究結(jié)果顯示,HIE組血清HIF-1α、miR-210水平明顯高于對照組,NBNA評(píng)分明顯低于對照組;HIE新生兒血清HIF-1α、miR-210水平與NBNA評(píng)分均呈負(fù)相關(guān)。提示HIE患兒血清HIF-1α、miR-210水平與病情的發(fā)生、發(fā)展有密切聯(lián)系。分析血清中HIF-1α、miR-210可能通過某種聯(lián)系影響新生兒神經(jīng)系統(tǒng)損傷,進(jìn)而影響NBNA評(píng)分,進(jìn)一步提示三者都可作為評(píng)估新生兒HIE的參考指標(biāo)。

        研究顯示,Apgar評(píng)分是表征新生兒窒息程度的一項(xiàng)指標(biāo),可作為新生兒未來腦部受損、發(fā)展及預(yù)后的參考指標(biāo)[14]。且有研究發(fā)現(xiàn),HIE新生兒血清酶AST、LDH等水平與病情程度成正比[15]。本研究中兩組胎齡、性別、出生體重比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。HIE組Apgar評(píng)分明顯低于對照組。提示HIE患兒Apgar評(píng)分較低,其窒息程度相對較嚴(yán)重。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),HIE組血清AST、LDH、CK、CK-MB水平均明顯高于對照組。HIE新生兒血清AST、LDH、CK、CK-MB與HIF-1α、miR-210呈正相關(guān),與NBNA評(píng)分呈負(fù)相關(guān)。提示HIE患兒血清酶AST、LDH等水平較正常新生兒高表達(dá),且與HIE病情程度呈正相關(guān)。Logistic回歸分析結(jié)果顯示,HIF-1α、CK-MB是影響新生兒HIE的危險(xiǎn)因素,NBNA評(píng)分是新生兒HIE的保護(hù)因素。提示臨床上可密切監(jiān)測新生兒HIF-1α、CK-MB、NBNA評(píng)分,以便及時(shí)采取治療措施,降低發(fā)病概率。

        綜上所述,HIE新生兒血清HIF-1α、miR-210水平與NBNA評(píng)分均呈負(fù)相關(guān),三者與新生兒HIE病情發(fā)展密切相關(guān)。將NBNA評(píng)分與HIF-1α、miR-210測定聯(lián)合,能更加全面地評(píng)價(jià)新生兒HIE的早期危險(xiǎn)性及預(yù)測預(yù)后,對新指標(biāo)的開發(fā)、應(yīng)用具有重要的臨床意義。但HIF-1α、miR-210水平影響新生兒HIE病情的具體作用機(jī)制尚不十分明確,有待進(jìn)一步深入研究。

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