丁艷琴，湯興萍，徐 奎，李 萍，李 玲

（1.河西學院附屬張掖人民醫(yī)院兒科，甘肅張掖 734000；2.張掖市中醫(yī)院糖尿病?？?，甘肅張掖，734000；3.河西學院臨床醫(yī)學院教科辦，甘肅張掖 734000）

I 型糖尿病又稱為胰島素依賴性糖尿病，是指體內胰島素缺乏導致葡萄糖、蛋白質、脂肪代謝紊亂，血糖水平持續(xù)升高，并最終形成糖尿?。?］。該病多發(fā)于兒童和青少年，起病迅速，長時間的胰島素不足容易造成酮癥酸中毒，嚴重威脅人類生命健康。據統(tǒng)計，我國I 型糖尿病全年齡段發(fā)病率為1.01/10 萬人，由于人們的不重視及生活習慣差等因素，近幾年發(fā)病率呈逐年遞增的趨勢［2］。目前，臨床上針對I 型糖尿病的治療方案主要有胰島移植、基因治療及外源性補充胰島素，但需要患者長期堅持以及良好的生活習慣［3］。白茅苷是白芷根的活性成分之一，具有除濕止痛、消腫排膿、抗炎癥、抗腫瘤等功效［4］。有研究報道，白茅苷已被用于高血壓、心血管及急性肝損傷等疾病中［5-7］。但白茅苷在I型糖尿病中的研究鮮見報道，因此，本研究通過建立鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）誘導的I型糖尿病幼鼠模型，探討白茅苷對I型糖尿病幼鼠肝損傷、過氧化應激和免疫反應的影響，為白茅苷的臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑和儀器

白茅苷（純度≥98%）購自上海源葉生物科技有限公司（貨號B20929），鏈脲佐菌素購自（純度≥98%）購自北京索萊寶科技有限公司（貨號S8050），HE 染色試劑盒、TUNEL 試劑盒和ELISA 試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司，超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛試劑盒購自上海碧云天生物技術公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒和ECL化學發(fā)光試劑購自美國Sigma 公司，兔單克隆抗體及HRP 標記的對應二抗均購自美國Abcam 公司，酶標儀（Rayto，RT6100），臺式高速離心機（大龍，D3024R，最大離心力21 380×g），成像系統(tǒng)（上海天能科技公司，Tanon-1600R），光學顯微鏡（日本尼康，Nikon Eclipse E100）。全自動生化分析儀（日本HITACH，7600）。

1.2 動物分組、建模及給藥

無特殊病原菌（SPF）級BALB/c雄性幼齡鼠（1～2 周齡，體質量15～20 g）購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產許可證號SCXK（京）2016-0008，使用許可證號SYXK（京）2017-0022，健康狀況良好，實驗動物使用過程中嚴格遵守3R 原則，并通過河西學院動物實驗中心倫理委員會審核批準。動物飼養(yǎng)條件：每只幼鼠給予24 h晝夜燈光照射控制及嚴格、規(guī)范的卡片登記管理，24 ℃條件下封閉群養(yǎng)。建模：參照文獻［8］建立I型糖尿病幼鼠模型，健康對照組幼鼠進行正常喂食飲水，模型組和模型加藥組禁食不禁水，12 h 后模型組進行腹腔注射60 mg/kg 的鏈脲佐菌素誘導I 型糖尿病幼鼠模型，幼鼠出現多飲、多食、多尿等癥狀時表明造模成功，造模成功后，模型加藥組幼鼠參照文獻［9］分別灌胃給藥3、6 和12 mg/kg 的白茅苷，72 h 后測定空腹血糖、血清胰島素、肥胖指數，采用全自動生化分析儀測量血脂四項，處死小鼠，收集肝臟組織和主動脈血進行后續(xù)實驗。

1.3 HE染色觀察肝損傷

取幼鼠肝組織，用40 g/L 多聚甲醛固定幼鼠肝組織，石蠟包埋切片，經乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋后，二甲苯脫蠟，行HE 染色，脫水透明并封片后，在光鏡下觀察拍照并記錄組織學形態(tài)變化。

1.4 TUNEL染色觀察細胞凋亡

取各組幼鼠肝組織，用40 g/L 多聚甲醛固定，石蠟切片脫蠟至水，經組織修復、阻斷內源性過氧化物酶和室溫平衡后，加入反應液按TUNEL 試劑盒說明書進行染色。細胞核被染成藍色或藍紫色，陽性細胞被染成棕黃色或褐色。

1.5 Western blot 檢測線粒體損傷標記蛋白表達水平

取各組幼鼠肝組織，預冷的PBS 洗滌2～3 次，然后用手術剪成小塊并置于勻漿研磨儀中研磨，研磨均勻后用RIPA 蛋白裂解液于冰上提取總蛋白，12 000 r/min（離心機半徑為84.993 mm）離心15 min取上清，用BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定組織蛋白濃度，每孔上樣15～20 μg，經SDS-PAGE 凝膠電泳、轉膜、脫脂奶粉封閉后，加入一抗（1：500），4℃搖床孵育過夜，回收一抗并加入HRP 標記的對應二抗（1：4 000），室溫孵育2 h。采用ECL 化學發(fā)光試劑于暗室下曝光顯影。將膠片進行掃描存檔，經PS 整理去色，Alpha 軟件分析光密度值，計算各組幼鼠中Bax、Bcl-2、caspase-3 和c-Myc 蛋白相對表達量（內參ACTIN），結果以目標條帶與內參比值表示，獨立進行試驗3次，最終結果取平均值。

1.6 ELISA檢測炎癥因子水平

收集各組幼鼠主動脈血，3 000 r/min（r=84.993 mm）4 ℃條件下離心10 min，取血清樣本，按ELISA試劑盒操作說明書進行檢測各組幼鼠血清中SOD、MDA、IL-6、TNF-α和IL-1β的含量水平。

1.7 統(tǒng)計學分析

使用SPSS17.0和GraphPad Prism6.0軟件分析，符合正態(tài)分布的計量資料表示為均數±標準差（xˉ±s）。多組數據比較采用單因素方差分析，方差分析有統(tǒng)計學意義時，兩兩比較采用Sidak 法，以P＜0.05為組間差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 白茅苷對I 型糖尿病幼齡鼠血清胰島素和血糖水平的影響

采用糖耐量實驗（OGTT）檢測各組小鼠血糖和空腹血清胰島素水平，并測量各組小鼠肥胖指數，經單因素方差分析，五組間肥胖指數、空腹血清胰島素水平（μU/L）和空腹血糖水平（mmol/L）差異具有統(tǒng)計學意義（F=47.262、94.570、119.696，P=0.000、0.000、0.000），采用Sidak 法進一步作兩兩比較，發(fā)現模型組與3 mg/kg 白茅苷組比較差異無統(tǒng)計學意義（P=0.997、1.000、0.999），而與6 mg/kg 白茅苷組比較差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.000、0.000、0.000），與12 mg/kg 白茅苷組比較差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.000、0.000、0.000；圖1）。

圖1 小鼠肥胖指數、空腹血清胰島素和血糖指標Fig.1 Obesity index，fasting serum insulin and fasting glucose in mice

2.2 白茅苷對I型糖尿病幼齡鼠血脂水平的影響

自動生化分析儀檢測各組小鼠血清中總膽固醇（TC，mmol/L）、甘油三酯（TG，mmol/L）、高密度脂蛋白（HDL，mmol/L）、低密度脂蛋白（LDL，mmol/L）水平，經單因素方差分析，五組間TC、TG、LDL、HDL 水平差異具有統(tǒng)計學意義（F=95.474、27.156、42.704、153.816，P=0.000、0.000、0.000、0.000），采用Sidak 法進一步作兩兩比較，發(fā)現模型組與3 mg/kg 白茅苷組比較差異無統(tǒng)計學意義（P=1.000、1.000、1.000、0.989），而與6 mg/kg 白茅苷組比較差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.000、0.007、0.000、0.000），與12 mg/kg白茅苷組比較差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.000、0.000、0.000、0.000，圖2）。

圖2 血脂四項檢測Fig.2 Four items of blood lipid tests

2.3 白茅苷對I型糖尿病幼齡鼠肝損傷的影響

HE 染色觀測I 型糖尿病小鼠肝損傷程度。健康對照組小鼠肝組織形態(tài)正常，排列規(guī)則，無炎性浸潤等病變情況。模型組小鼠肝組織紊亂，無完整肝小葉結構，肝細胞胞質疏松、彌漫性水腫，匯管區(qū)可見炎性細胞浸潤和纖維組織增生。低劑量組（3 mg/kg白茅苷組）小鼠肝組織結構紊亂，可見少量正常的肝小葉結構，仍然可見大量炎性細胞浸潤。中高劑量組（6 和12 mg/kg 白茅苷組）小鼠肝組織結構趨于正常，肝小葉結構排列規(guī)則，匯管區(qū)未見炎性細胞浸潤，肝細胞索以中央靜脈為中心呈輻射狀排列（圖3）。

2.4 白茅苷對I型糖尿病幼齡鼠肝細胞凋亡的影響

TUNEL 染色觀測各組小鼠肝細胞凋亡情況。健康對照組小鼠肝組織中未見凋亡細胞，肝組織結構正常。模型組小鼠肝組織中可見大量凋亡細胞，組織結構紊亂。低劑量組（3 mg/kg 白茅苷組）小鼠肝組織中仍可見大量凋亡細胞，組結構紊亂。中高劑量組（6和12 mg/kg白茅苷組）小鼠肝細胞凋亡數目明顯減少，組織結構趨于正常（圖4）。

圖3 肝組織病理染色圖Fig.3 Pathological staining image of liver tissue

圖4 肝組織凋亡染色圖Fig.4 Staining image of liver tissue apoptosis

2.5 白茅苷對I 型糖尿病幼齡鼠血清中氧化應激指標的影響

SOD 和MDA 試劑盒檢測各組小鼠血清中SOD（U/mL）和MDA（mmol/mL）含量水平，經單因素方差分析，五組間SOD 和MDA 含量差異具有統(tǒng)計學意義（F=26.216、24.309，P=0.000、0.000），采用Sidak法進一步作兩兩比較，發(fā)現模型組與3 mg/kg白茅苷組比較差異無統(tǒng)計學意義（P=1.000、1.000），而與6 mg/kg白茅苷組比較差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.068、0.022），與12 mg/kg 白茅苷組比較差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.001、0.001；圖5）。

圖5 SOD、MDA含量水平Fig.5 SOD and MDA content levels

2.6 白茅苷對I型糖尿病幼齡鼠線粒體損傷的影響

Western blot 檢測各組小鼠線粒體中Bax/Bcl-2、caspase-3 和c-Myc 蛋白表達水平，經單因素方差分析，五組間Bax/Bcl-2、caspase-3、c-Myc 差異具有統(tǒng)計學意義（F=255.894、42.415、159.547，P=0.000、0.000、0.000），采用Sidak 法進一步作兩兩比較，發(fā)現模型組與3 mg/kg 白茅苷組間差異無統(tǒng)計學意義（P=0.991、0.998、1.000），而與6 mg/kg 白茅苷組比較差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.000、0.000、0.000），與12 mg/kg 白茅苷組比較差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.000、0.000、0.000；圖6）。

2.7 白茅苷對I 型糖尿病幼齡鼠血清中炎癥因子水平的影響

ELISA 檢測各組小鼠血清中IL-6（pg/mL）、TNF-α（pg/mL）和IL-1β（pg/mL）含量水平，經單因素方差分析，五組間IL-6（F=15.893，P=0.000）、TNF-α（F=48.912，P=0.000）、IL-1β（F=25.166，P=0.000）含量差異具有統(tǒng)計學意義，采用Sidak 法進一步作兩兩比較，發(fā)現模型組與3 mg/kg 白茅苷組比較差異無統(tǒng)計學意義（P=1.000、1.000、1.000），而與6 mg/kg 白茅苷組比較差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.017、0.007、0.003），與12 mg/kg 白茅苷組比較差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.007、0.000、0.001；圖7）。

圖6 Bax/Bcl-2、cleaved cas3/cas3和c-Myc蛋白表達水平Fig.6 Bax/Bcl-2，cleaved cas3/cas3 and c-Myc protein expression levels

3 討論

圖7 IL-6、TNF-α和IL-1β含量水平Fig.7 Content levels of IL-6，TNF-α and IL-1β

I型糖尿病是自身異常免疫應答破壞胰島B 細胞，從而引起的一種自身免疫代謝性疾病，胰島B細胞的損傷與多種免疫細胞和炎癥因子有關，如T淋巴細胞、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素（IL）等［10-12］。STZ 是一種天然的化學物質，能特異性的破壞分泌胰島素的胰島B 細胞，由于其誘導的I 型糖尿病動物模型臨床表現與人的組織病理表現極為相似，且導致I 型糖尿病產生自身免疫反應及氧化應激等，因此，STZ 誘導的I型糖尿病動物模型常被用于實驗研究［13］。本研究利用STZ誘導I型糖尿病動物模型，觀測白茅苷對I 型糖尿病模型幼鼠肝損傷、過氧化應激及免疫應答的影響，結果發(fā)現，白茅苷能夠緩解STZ誘導的I型糖尿病模型幼鼠肝損傷，降低過氧化應激反應，調控免疫應答等。

本研究結果顯示，經白茅苷給藥治療后，I型糖尿病幼鼠肥胖指數、空腹血糖、空腹血清胰島素和血脂四項水平均明顯降低，結果提示，白茅苷在I型糖尿病幼鼠胰島功能中具有調節(jié)作用，為明確白茅苷調節(jié)I 型糖尿病胰島功能的作用機制，我們還檢測了幼鼠肝損傷、細胞凋亡、過氧化應激指標和炎癥因子的水平。

I 型糖尿病發(fā)生時，由于胰島素分泌不足或相對缺乏會使肝臟脂代謝紊亂，嚴重時發(fā)生酮癥酸中毒，引起肝臟腫大，脂肪組織浸潤，最終導致肝組織功能損傷［14］。因此，增加I 型糖尿病患者體內胰島素分泌的同時，還應防止肝功能受損。本研究結果顯示，白茅苷顯著改善I 型糖尿病幼鼠肝組織病理損傷，抑制肝細胞凋亡，結果進一步提示白茅苷在I型糖尿病幼鼠胰島功能和肝功能中的具有調控作用。

氧化應激也是胰島B 細胞受損的重要因素之一，超氧化物歧化酶（SOD）是氧自由基清除酶，能夠清除細胞內過氧化產物保護細胞免受氧化和過氧化產物的損害［15］。丙二醛（MDA）是脂質過氧化產物，機體內大量產生或積累MDA 會破壞細胞膜結構，并導致細胞代謝紊亂，從而影響細胞正常功能［16］。研究發(fā)現，STZ 誘導的I 型糖尿病小鼠SOD水平均有明顯降低，MDA明顯增高，且MDA和SOD含量能間接的反應細胞損傷程度和氧化應激反應［17］。本研究結果顯示，經白茅苷給藥治療后，STZ 誘導的I 型糖尿病幼鼠SOD 含量明顯增高，MDA 含量明顯降低。結果提示，白茅苷通過調節(jié)I型糖尿病幼鼠氧化應激水平緩解幼鼠胰島功能和肝功能損傷。

線粒體是機體有氧代謝和能量轉換的主要場所，與I型和Ⅱ型糖尿病發(fā)病機制密切相關。I型糖尿病發(fā)生時，機體內胰島素分泌異常導致細胞能量代謝紊亂，引起線粒體通透性轉換（MPT）孔開放，使線粒體中促凋亡蛋白的大量釋放并最終導致細胞死亡［18］。Bax/Bcl-2、caspase-3 和c-Myc 是線粒體損傷標志物，同時也是凋亡標記蛋白。Bax/Bcl-2和caspase-3高表達預示線粒體功能損傷嚴重，凋亡細胞增多［19］。而c-Myc 則與之相反，在I 型糖尿病幼鼠中，c-Myc 能夠激活分泌胰島素的胰島素基因轉錄表達［20］。本研究結果顯示，經白茅苷給藥治療后，I 型糖尿病幼鼠線粒體中Bax/Bcl-2 和caspase-3 蛋白表達明顯降低，c-Myc 表達增高，結果提示，白茅苷對I 型糖尿病幼鼠線粒體功能也具有調節(jié)作用。

前文提到I型糖尿病是由于機體自身異常免疫反應導致胰島B 細胞受損的代謝性疾病，因此，檢測I型糖尿病幼鼠免疫反應調節(jié)因子水平能夠間接明確幼鼠胰島功能，而白細胞介素6（IL-6）、TNF-α和白介素-1β（IL-1β）是重要的炎癥和免疫調控因子。研究表明，在I型糖尿病發(fā)生過程中，巨噬細胞通過釋放IFN-γ 激活并釋放IL-6、IL-1β 和TNF-α等，導致胰島B 細胞損傷甚至死亡［21-22］。研究結果發(fā)現，經白茅苷給藥治療后，I 型糖尿病幼鼠IL-6、TNF-α 和IL-1β 含量均有明顯降低，結果提示，白茅苷通過調節(jié)I型糖尿病幼鼠免疫炎癥因子水平緩解幼鼠因過度免疫反應引起的胰島功能損傷。

綜上所述，白茅苷在STZ 誘導的I 型糖尿病幼鼠肝功能、胰島功能和線粒體功能中具有調節(jié)作用，其機制與降低幼鼠肝細胞凋亡、過氧化應激反應和免疫反應有關。