惠利娜，馮 暉，徐 星，王瑞國，許育民

（河南省食品工業(yè)科學(xué)研究所有限公司，國家輕工業(yè)食品質(zhì)量監(jiān)督檢測鄭州站，河南鄭州 450000）

沙門氏菌在自然界中的分布十分廣泛，沙門氏菌可以在水中生存2～3 周，在糞便中存活1～2 個(gè)月，是一種常見食源性致病菌[1]。沙門氏菌是無莢膜、無芽孢的革蘭氏陰性腸道桿菌，大多有鞭毛[2]。沙門氏菌是人畜共患的病原微生物[3]，人畜主要是通過食用了被沙門氏菌污染的食物導(dǎo)致中毒，癥狀主要是惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉等，是許多國家食物中毒事件的元兇。

微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制包括室間質(zhì)量控制和內(nèi)部質(zhì)量控制。盲樣考核是室間質(zhì)量控制的一種形 式[4]，同時(shí)也是保證國家食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測和評(píng)估工作質(zhì)量的一種手段[5]。評(píng)價(jià)機(jī)構(gòu)通過制定的規(guī)則和標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)參加者的能力[6]，盲樣考核的結(jié)果會(huì)體現(xiàn)檢測機(jī)構(gòu)的檢測能力和技術(shù)水平[7]。實(shí)驗(yàn)室參加由中國食品藥品檢定研究院負(fù)責(zé)實(shí)施的乳粉中沙門氏菌檢驗(yàn)的盲樣考核活動(dòng)，為了滿足食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測工作的需要，同時(shí)鍛煉和提高實(shí)驗(yàn)室沙門氏菌的檢測能力。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品和標(biāo)準(zhǔn)菌株

10 份沙門氏菌樣品，樣品編號(hào)為CODE 1 ～CODE 10，樣品為白色球狀西林瓶裝，包含陰性樣本和陽性樣本；10 份奶粉樣品，每份樣品25 g，編號(hào)為CODE 1 ～CODE 10。每個(gè)相同編碼的沙門氏菌樣品和奶粉樣品為1 份樣品進(jìn)行檢測，共10 份盲樣考核樣品。標(biāo)準(zhǔn)菌株為鼠傷寒沙門氏菌（ATCC 14028，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司提供） 作為陽性對(duì)照，大腸埃希氏菌（ATCC 25922，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司提供） 作為陰性對(duì)照。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 培養(yǎng)基和試劑

緩沖蛋白胨水（BPW）、四硫磺酸鈉煌綠（TTB）增菌液、亞硒酸鹽胱氨酸（SC） 增菌液、亞硫酸鉍（BS） 瓊脂、木糖賴氨酸脫氧膽鹽（XLD）、瓊脂、沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基、三糖鐵（TSI） 瓊脂、營養(yǎng)瓊脂（NA）、沙門氏菌生化鑒定盒、SWARM 瓊脂，北京陸橋生物技術(shù)有限公司提供；沙門氏菌診斷血清（60 種），蘭州生物科技公司提供；沙門氏菌診斷血清（60 種），寧波天潤生物藥業(yè)有限公司提供；沙門氏菌誘導(dǎo)血清（丹麥SSI）。所用試劑和培養(yǎng)基均已按照GB 4789.28 中的規(guī)定進(jìn)行驗(yàn)收。

1.2.2 儀器和材料

無菌均質(zhì)袋，北京陸橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；500 型恒溫培養(yǎng)箱（36±1 ℃）、500 型生化培養(yǎng)箱（42±1 ℃），山東濰坊精鷹醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品；立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品；HR40-II A2 型生物安全柜，青島海爾特種設(shè)備電器有限公司產(chǎn)品；BEPU-40B 型拍擊式均質(zhì)器，無錫德譜儀器制造有限公司產(chǎn)品；漩渦混合儀，天根生化科技（北京） 有限公司產(chǎn)品；SL-203 型電子天平，上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；BCD-220 型冷凍冷藏箱，TCL 集團(tuán)股份有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品的處理

在生物安全柜內(nèi)將沙門氏菌樣品瓶打開，將2 mL無菌增菌液加入到樣品瓶中，使樣品小球充分溶解，加入到無菌均質(zhì)袋中。再將無菌增菌液加入到樣品瓶中反復(fù)吹打，重復(fù)數(shù)次，盡量使西林瓶內(nèi)的所有微生物都洗脫下來。然后，將與西林瓶相同編碼的奶粉樣品加入到BPW增菌液中，均質(zhì)混勻。以該方法分別對(duì)10 份樣品進(jìn)行處理。另外，取2 瓶225 mL 滅菌BPW稀釋液分別加入到2 個(gè)無菌均質(zhì)袋中，依次接種1 mL濃度為103CFU/mL 標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 14028 作為陽性對(duì)照，1 mL 濃度為103CFU/mL 標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 25922作為陰性對(duì)照，滅菌的225 mL BPW 作為空白對(duì)照。

1.3.2 前增菌

將編碼CODE 1～CODE 10 的樣品均質(zhì)液、陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照一起置于36±1 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)18 h。

1.3.3 選擇性增菌

培養(yǎng)后的樣品混合物輕搖混合均勻，用移液器移取1 mL 接種于10 mL TTB 中，同時(shí)另取1 mL 接種于10 mL SC 中，將TTB 置于42±1 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，將SC 置于36±1 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h。陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照按照上述步驟進(jìn)行操作。

1.3.4 分離劃線

培養(yǎng)后的TTB 和SC 增菌液先用渦旋混勻器混合均勻，分別接種于3 種選擇性培養(yǎng)基（BS、XLD、沙門顯色培養(yǎng)基） 上，劃線后的平板置于適宜溫度相應(yīng)的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)需要的時(shí)間。陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照也進(jìn)行同樣的操作。培養(yǎng)結(jié)束后觀察并記錄不同培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)。

1.3.5 純化

在每個(gè)分離培養(yǎng)基上分別挑取2 個(gè)或以上不同形態(tài)的菌落，包括典型菌落、疑似菌落和非疑似菌落，在NA 平板進(jìn)行純化，置于36±1 ℃下恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h。

1.3.6 生化鑒定

挑取NA 平板上的單菌落接種TSI，再選取NA平板上的單菌落制備菌懸液（0.5 麥?zhǔn)媳葷釢舛龋?，用移液器吸取菌懸液加入到賴氨酸脫酸酶、尿素酶、靛基質(zhì)、KCN 這4 種微量生化管內(nèi)，對(duì)沙門氏菌進(jìn)行初篩。接種后用封口膜封口。賴氨酸脫酸酶和KCN 接種后還需要用無菌液體石蠟液封。將三糖鐵和上述4 種生化反應(yīng)管置于36±1 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h 后觀察記錄結(jié)果。氰化鉀試驗(yàn)若培養(yǎng)24 h 時(shí)仍為陰性，可延長培養(yǎng)至48 h。根據(jù)結(jié)果判斷是否為沙門氏菌，根據(jù)生化反應(yīng)類型，再進(jìn)行甘露醇、山梨醇、靛基質(zhì)、衛(wèi)矛醇、水楊苷、ONPG、丙二酸鹽的接種培養(yǎng)。

1.3.7 血清學(xué)分型

參照GB 4789.4—2016[8]的方法血清凝集試驗(yàn)的要求進(jìn)行自凝性檢查、多價(jià)O 抗原凝集試驗(yàn)和多價(jià)H 抗凝集試驗(yàn)。

被A～F 多價(jià)O 血清凝集者，依次用O 抗原因子進(jìn)行血清凝集試驗(yàn)，判定O 群。O 群確定之后，根據(jù)GB 4789.4—2016[8]和《Antigenic Formulae of the Salmonella serovars》 中的沙門氏菌抗原表，驗(yàn)證H抗原。確定H 抗原的第一相之后，再驗(yàn)證H 抗原的第二相。如果第二相不凝集，可以用位相變異用簡易平板法進(jìn)行誘導(dǎo)后，再次驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)

樣品CODE 1～CODE10、陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照經(jīng)過前增菌、選擇性增菌和劃線分離培養(yǎng)后，結(jié)果CODE 2，CODE 5，CODE 6 和陽性對(duì)照在3 種選擇性培養(yǎng)基上菌落形態(tài)基本一致，均出現(xiàn)可疑或典型菌落；而CODE 1，CODE 3，CODE 4 在3 種選擇性培養(yǎng)基上出現(xiàn)的菌落形態(tài)一致，均未發(fā)現(xiàn)疑似或典型菌落，可以初步判定為非沙門氏菌；CODE 7，CODE 8，CODE 10 在3 種選擇性培養(yǎng)基上出現(xiàn)的菌落形態(tài)一致，無疑似或典型菌落可以初步判定為非沙門氏菌，同時(shí)在顯色培養(yǎng)基上都出現(xiàn)藍(lán)綠色菌落，與陰性對(duì)照上的菌落形態(tài)一致，可以初步判定CODE 7，CODE 8，CODE 10 樣品里添加有大腸菌群；CODE 9與空白對(duì)照結(jié)果一致，無菌落生長。

沙門氏菌在選擇性培養(yǎng)基上的菌落特征見表1。

2.2 生化鑒定

表1 沙門氏菌在選擇性培養(yǎng)基上的菌落特征

為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，取上述選擇性培養(yǎng)基上非疑似菌落、疑似菌落、典型菌落經(jīng)純化培養(yǎng)后，取純菌落先接種三糖鐵瓊脂、賴氨酸脫酸梅、尿素酶、靛基質(zhì)、KCN，進(jìn)行初篩，符合沙門氏菌反應(yīng)的再選用沙門氏菌生化鑒定盒進(jìn)行生化鑒定。

沙門氏菌生化試驗(yàn)初步鑒定結(jié)果見表2。

表2 沙門氏菌生化試驗(yàn)初步鑒定結(jié)果

由表2 可知，編號(hào)CODE 1，CODE 3，CODE 4的樣品的生化反應(yīng)初步鑒定結(jié)果不符合反應(yīng)序號(hào)A1，A2，A3，即不符合典型沙門氏菌生化反應(yīng)特征，可報(bào)告25 g 樣品中未檢出沙門氏菌，與選擇性培養(yǎng)基鑒定結(jié)果基本一致，故無需進(jìn)行后續(xù)生化鑒定和血清凝集試驗(yàn)。樣品CODE 2，CODE 5，CODE 6，陽性對(duì)照和陰性對(duì)照符合反應(yīng)序號(hào)A2，需補(bǔ)做甘露醇和山梨醇試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果符合后還需要繼續(xù)進(jìn)行血清凝集試驗(yàn)。樣品CODE 3，CODE 8 大多數(shù)非疑似菌落初步生化反應(yīng)不符合反應(yīng)序號(hào)A1，A2，A3，但是個(gè)別非疑似菌株生化反應(yīng)初步判斷符合沙門氏菌個(gè)別變體，需要結(jié)合血清鑒定結(jié)果判斷。

沙門氏菌屬生化群的鑒定結(jié)果見表3。

2.3 血清學(xué)分型

表3 沙門氏菌后續(xù)生化鑒定結(jié)果

樣品CODE 3，CODE 8 和陰性對(duì)照經(jīng)A～F 多價(jià)O 血清試驗(yàn)均不凝集，可以判定為非沙門氏菌。參照GB 4789.4—2016 附錄B[8]和盲樣考核作業(yè)指導(dǎo)書中提供的沙門氏菌抗原表[9]，發(fā)現(xiàn)樣品CODE 2，CODE 5，CODE 6 中分離出的菌株均能與O 多價(jià)血清凝集，同時(shí)生理鹽水對(duì)照并未發(fā)生凝集現(xiàn)象；樣品CODE 2 分離出S. Colindale，樣品CODE 5 分離出S. Agona，樣品CODE 6 分離出S. Liverpool 和Salmonella II。陽性對(duì)照經(jīng)血清學(xué)分型是S. Typhimurium與鼠傷寒沙門氏菌（ATCC 14028） 結(jié)果一致。

血清學(xué)分型結(jié)果見表4。

2.4 判定

表4 血清學(xué)分型結(jié)果

對(duì)上述鑒定結(jié)果綜合分析，可判定10 份中樣品有3 份樣品中含有沙門氏菌，并且分離出4 種沙門氏菌，檢測結(jié)果和血清分型結(jié)果與中國食品藥品檢定研究院反饋的報(bào)告相符。

3 結(jié)論

盲樣考核是國家及各省級(jí)監(jiān)督部門評(píng)價(jià)檢測機(jī)構(gòu)的檢驗(yàn)?zāi)芰Φ闹匾侄沃籟10]。開展盲樣考核可以鍛煉和提高檢測人員的操作技能，提高檢驗(yàn)檢測機(jī)構(gòu)的技術(shù)水平。

盲樣考核的關(guān)鍵在于必須控制好檢測過程的每個(gè)環(huán)節(jié)?？偨Y(jié)如下：

（1） 操作時(shí)要認(rèn)真核對(duì)樣品編號(hào)，避免混淆樣品導(dǎo)致結(jié)果出錯(cuò)。

（2） 必須保證無菌操作，避免來自人員和環(huán)境的污染。試驗(yàn)產(chǎn)生的廢棄物和生物安全事項(xiàng)必須嚴(yán)格《GB 19489—2008 實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求》執(zhí)行[11]，避免人員感染。

（3） 對(duì)所有試劑進(jìn)行驗(yàn)收，驗(yàn)收合格以后才能使用[12]。

（4） 在生物安全柜內(nèi)打開樣品瓶，首先將樣品小球溶解，溶解后反復(fù)吹打、多次潤洗，盡量使西林瓶內(nèi)的所有微生物都洗脫下來。

（5） 盲樣考核過程中需要用陽性對(duì)照、陰性對(duì)照、空白對(duì)照對(duì)培養(yǎng)基、試劑和操作進(jìn)行監(jiān)控。

（6） 沙門氏菌劃線分離時(shí)用的選擇性培養(yǎng)基要全面，培養(yǎng)后的菌落形態(tài)判斷需要一定的經(jīng)驗(yàn)積累。菌落形態(tài)的判定是后續(xù)試驗(yàn)操作的關(guān)鍵。這次盲樣考核的干擾菌可能有變形桿菌、弗氏檸檬酸桿菌和大腸菌群等，這些菌在XLD、BS 等平板上的菌落形態(tài)都類似于沙門氏菌，而沙門氏菌顯色培養(yǎng)基可以將其有效分離。沙門氏菌顯色培養(yǎng)基的特異性和敏感性較高，可有效排除這些菌的干擾[13]。沙門氏菌顯色培養(yǎng)基的原理是利用沙門氏菌代謝出的辛酯酶與培養(yǎng)基中的特異性顯色底物結(jié)合，游離出產(chǎn)色基因使培養(yǎng)基顯示特定顏色[14]。但顯色培養(yǎng)基也有缺點(diǎn)，由于某些雜菌也具有同樣的酶，從而出現(xiàn)個(gè)別的假陽性現(xiàn)象。

（7） 為避免出現(xiàn)漏檢的情況，選擇生化試驗(yàn)的菌落形態(tài)要全面，盡可能多地挑取可疑菌。此次試驗(yàn)過程中每種平板上選擇典型菌落2～3 個(gè)，疑似菌落2～3 個(gè)，非疑似菌落2 個(gè)進(jìn)行生化試驗(yàn)，總計(jì)共進(jìn)行了80 組生化鑒定，保證鑒定結(jié)果的全面性。進(jìn)行生化試驗(yàn)時(shí)，一定要注意在要求的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)觀察記錄結(jié)果，否則會(huì)造成生化結(jié)果的偏差。

（8） 有些非疑似菌落在生化試驗(yàn)過程中也會(huì)呈現(xiàn)和沙門氏菌相同的反應(yīng)，所以血清學(xué)鑒定在沙門氏菌的分離鑒定過程中顯得尤為關(guān)鍵。沙門氏菌血清學(xué)分型操作復(fù)雜且工作量大，試驗(yàn)過程需要認(rèn)真細(xì)心，結(jié)果判斷需要經(jīng)驗(yàn)積累。O 抗原的鑒定相對(duì)好操作，凝集效果明顯。但是，H 抗原的鑒別難度相對(duì)較大，對(duì)菌株的要求校高。在利用血清誘導(dǎo)鑒別H 抗原時(shí)，要避免挑取接種的中心部位，容易造成血清凝集不明顯，影響結(jié)果的判讀[15]。血清的質(zhì)量對(duì)于血清分型結(jié)果至關(guān)重要[16]，此次試驗(yàn)采用了2 種沙門氏菌診斷血清進(jìn)行試驗(yàn)，相互驗(yàn)證，保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。