胡金金，齊新文，李松軍，王德偉，譚偉源

(遵義醫(yī)科大學(xué)第五附屬(珠海)醫(yī)院骨二科，廣東 珠海 519000)

目前因交通事故及高空作業(yè)增多而導(dǎo)致的脊髓損傷發(fā)生率不斷增加[1]，脊髓損傷后治療效果往往不佳，致殘率高，因勞動(dòng)能力喪失給家庭及社會(huì)造成極大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前脊髓損傷的治療方式主要分為傳統(tǒng)治療和基因治療兩類。傳統(tǒng)治療方法主要包括椎體后路減壓、激素沖擊治療、高壓氧療法等，這些方式能不同程度地緩解脊髓損傷部位的病理改變，但對(duì)損傷神經(jīng)再生均無(wú)明顯效果[2-3]。近年來(lái)，隨著基因技術(shù)的不斷發(fā)展及完善，將目的基因通過(guò)病毒載體轉(zhuǎn)染至脂肪源性干細(xì)胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)的技術(shù)越來(lái)越成熟，ADSCs的定向歸巢機(jī)制能將目的基因攜帶至損傷部位進(jìn)行表達(dá)從而給脊髓損傷的治療帶來(lái)新的希望[4]。腦紅蛋白(neumglobin,Ngb)是2000年發(fā)現(xiàn)的一種神經(jīng)系統(tǒng)特異性的攜氧珠蛋白，是一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控因子及內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)因子[5-6]。研究表明，Ngb對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的缺氧損傷、氧化應(yīng)激損傷具有很好的神經(jīng)保護(hù)作用[7]。ADSCs是一種具有自我修復(fù)及多向分化能力的干細(xì)胞，在特定環(huán)境下可以誘導(dǎo)ADSCs向多種細(xì)胞(內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等)分化[8-9]。ADSCs具有提取方便、分離簡(jiǎn)單、培養(yǎng)及傳代操作容易等優(yōu)點(diǎn)，目前已成為干細(xì)胞研究的理想細(xì)胞來(lái)源[10]。因此，本研究將Ngb基因通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染至ADSCs治療大鼠脊髓損傷并觀察評(píng)估治療效果是否存在疊加效應(yīng)，為臨床治療脊髓損傷提供新思路及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 ①實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)SD大鼠36只，雌雄不均，12周齡，體重(230±20)g,均由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(粵)2013-0002。動(dòng)物飼養(yǎng)條件：每個(gè)鼠籠6只，群養(yǎng)，采用10 h∶14 h晝夜間斷照明模式。飼養(yǎng)溫度(24±2)℃，濕度(50±10)%，喂以鼠專用全價(jià)顆粒飼料(9.3～18.5 g/d),飲水瓶自由進(jìn)純凈水(20～45 mL/d)。②主要試劑：DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清均購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)Life Technologies公司；4%多聚甲醛、0.1% Ⅰ型膠原酶溶液、0.25%胰蛋白酶及水合氯醛顆粒均購(gòu)自合肥博美生物科技有限公司；超順磁性氧化鐵納米顆粒(superparamagnetic iron oxide nanoparticles,SPIONs)購(gòu)自上海羧菲生物醫(yī)藥科技公司；抗Ngb單克隆抗體(批號(hào)：ab108937)購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；硝酸纖維素膜(批號(hào)：FFN02)及十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳蛋白上樣緩沖液(批號(hào)：P0015L)均購(gòu)自江蘇碧云天公司；十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠制備試劑盒(批號(hào)：P12002)購(gòu)自美國(guó)Solarbio公司。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物ADSCs的提取傳代、Ngb轉(zhuǎn)染及SPIONs標(biāo)記ADSCs 任取12周齡的健康大鼠1只，從其腹股溝脂肪組織中提取ADSCs，細(xì)胞培養(yǎng)傳代至第三代，將培養(yǎng)好的ADSCs通過(guò)離心濃縮凍存，外送凍存的ADSCs至廣州杰特偉生物科技公司，成功構(gòu)建 Ngb基因慢病毒表達(dá)載體pLenti.NgbIRES-EGFP(PLentiviral.Neuroglobin Internal Ribosome Entry Site-Enhanced Green Fluorescent Protein)，再用SPIONs分別標(biāo)記ADSCs與Ngb轉(zhuǎn)染的ADSCs。

1.2.2動(dòng)物造模分組及給藥 36只SD大鼠造模前脊髓損傷行為學(xué)BBB(Basso-Beattie-Bresnahan)評(píng)分均為21分，用改良Allen′s法造模后BBB評(píng)分均為0分，采用隨機(jī)數(shù)字法將造模成功后的SD大鼠分為空白對(duì)照組、干細(xì)胞組及轉(zhuǎn)染干細(xì)胞組，每組12只,實(shí)驗(yàn)過(guò)程中出現(xiàn)死亡大鼠均用備用大鼠造模成功后替代?？瞻讓?duì)照組尾靜脈注射DMEM高糖培養(yǎng)基0.3 mL,共1周；干細(xì)胞組尾靜脈注射含有細(xì)胞密度1×107/mL ADSCs培養(yǎng)液0.3 mL，共1周；轉(zhuǎn)染干細(xì)胞組尾靜脈注射含有細(xì)胞密度1×107/mL Ngb轉(zhuǎn)染的ADSCs培養(yǎng)液0.3 mL，共1周。

1.2.3BBB評(píng)分 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后的第1、3、5、7、14、28天分別對(duì)各組脊髓損傷大鼠行BBB評(píng)分，評(píng)分小組由3名本科室成員組成，每只大鼠的評(píng)分為3人評(píng)分的平均值。

1.2.4損傷脊髓組織蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining，HE染色) 第28天BBB評(píng)分結(jié)束后立即處死所有實(shí)驗(yàn)大鼠并提取損傷處脊髓組織，每組12份樣本，共36份樣本，然后從空白組、干細(xì)胞組及轉(zhuǎn)染干細(xì)胞組中隨機(jī)各選取4份樣本進(jìn)行固定12 h后，脫水、常規(guī)石蠟包埋、切片，厚度4 μm，進(jìn)行HE染色觀察損傷處脊髓組織改變情況。

1.2.6透射電鏡觀察 將每組剩余的4份樣本脊髓組織進(jìn)行固定6 h、脫水、包埋、固化、切片(厚度50～60 nm)、3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色、透射電鏡觀察、拍片。

2 結(jié) 果

2.1動(dòng)物造模 采用改良Allen′s法造模，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中空白對(duì)照組大鼠死亡2只，干細(xì)胞組大鼠死亡3只，轉(zhuǎn)染干細(xì)胞組死亡2只，死亡均出現(xiàn)在第3天后，考慮脊髓損傷后大小便潴留致感染導(dǎo)致死亡。見(jiàn)圖1。

1a:打開(kāi)椎板暴露脊髓；1b:造模后雙下肢完全癱瘓

2.2各組脊髓損傷大鼠BBB評(píng)分比較 在損傷后的第1天、第3天，各組大鼠BBB評(píng)分比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；第5天、7天、14天、28天，各組大鼠BBB評(píng)分比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，干細(xì)胞組和轉(zhuǎn)染干細(xì)胞組BBB功能評(píng)分均高于空白對(duì)照組(P<0.05)，轉(zhuǎn)染干細(xì)胞組BBB評(píng)分高于干細(xì)胞組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組脊髓損傷大鼠BBB評(píng)分比較

2.3HE染色 空白對(duì)照組組織排列紊亂，膠質(zhì)瘢痕，神經(jīng)元空泡樣及囊腔改變明顯；干細(xì)胞組組織排列更加規(guī)則，神經(jīng)元空泡樣及囊腔樣改變明顯較前者少，單位面積內(nèi)神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增多；轉(zhuǎn)染干細(xì)胞組組織排列規(guī)則，膠質(zhì)纖維形成少，神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量較多，神經(jīng)元空泡樣及囊腔樣改變較少，見(jiàn)圖2。

2a:空白對(duì)照組；2b：干細(xì)胞組；2c：轉(zhuǎn)染干細(xì)胞組

2.4各組損傷脊髓組織Ngb相對(duì)表達(dá)水平比較 空白對(duì)照組、干細(xì)胞組、轉(zhuǎn)染干細(xì)胞組Ngb表達(dá)水平分別為(0.14±0.04)mg/kg、(0.38±0.11)mg/kg、(0.72±0.05)mg/kg，各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=183.541,P<0.001)，其中干細(xì)胞組、轉(zhuǎn)染干細(xì)胞組高于空白對(duì)照組(P<0.05)，轉(zhuǎn)染干細(xì)胞組高于干細(xì)胞組(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

Ngb：腦紅蛋白；A：空白對(duì)照組；B：干細(xì)胞組；C：轉(zhuǎn)染干細(xì)胞組

2.5各組損傷脊髓組織電鏡檢查結(jié)果 空白對(duì)照組神經(jīng)組織脫髓鞘病變嚴(yán)重，部分髓鞘消失，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞核固縮改變嚴(yán)重，部分神經(jīng)元細(xì)胞溶解，神經(jīng)元細(xì)胞及膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量及突觸小泡數(shù)量極少；干細(xì)胞組神經(jīng)髓鞘板層結(jié)構(gòu)連續(xù)清楚，新生神經(jīng)髓鞘結(jié)構(gòu)清楚且包裹神經(jīng)纖維，突觸間隙存在，突觸小泡數(shù)量進(jìn)一步增多；轉(zhuǎn)染干細(xì)胞組可見(jiàn)新髓鞘及軸突形成明顯增多，突觸間隙清晰，神經(jīng)元細(xì)胞及突觸小泡數(shù)量明顯增多。見(jiàn)圖4。

4a:空白對(duì)照組；4b：干細(xì)胞組；4c：轉(zhuǎn)染干細(xì)胞組

3 討 論

脊髓損傷是一種嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷疾病，制作高度契合的模型對(duì)治療脊髓損傷的研究至關(guān)重要，目前常用的模型制作方法主要包括傳統(tǒng)Allen′s法[11]、改良Allen′s法[12]、電磁打擊法[13]等，改良Allen′s法具有操作簡(jiǎn)單，價(jià)廉、學(xué)習(xí)時(shí)間短及與脊髓損傷相似度高等優(yōu)點(diǎn)[14]，同時(shí)能制備出可靠性和重復(fù)性更高的脊髓損傷動(dòng)物模型。故本研究選擇改良的Allen′s法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)SD大鼠造模，通過(guò)BBB評(píng)分來(lái)反映雙下肢神經(jīng)功能情況，所有大鼠造模后BBB評(píng)分均為0分，證明造模成功，同時(shí)也說(shuō)明這種造模方式成功率高且造模效果理想。

近年來(lái)，各種不同干細(xì)胞被廣泛用于血液系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療研究，自體來(lái)源的ADSCs具有數(shù)量多、操作方便、便于提取等優(yōu)勢(shì)，ADSCs在特定的環(huán)境下可以被誘導(dǎo)向多種細(xì)胞(內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、施萬(wàn)細(xì)胞等)分化[15-16]，ADSCs定向分化形成的神經(jīng)細(xì)胞對(duì)大鼠脊髓損傷具有修復(fù)作用。Zhang等[17]在體外實(shí)驗(yàn)中將ADSCs置于神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)分化，然后聯(lián)合神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-3移植到脊髓損傷部位，實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到損傷局部組織內(nèi)神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量增多、突觸小泡和神經(jīng)髓鞘形成增加，一定程度上證明了ADSCs能夠向神經(jīng)元細(xì)胞分化的能力，同時(shí)還能促進(jìn)突觸及神經(jīng)髓鞘的再生。本實(shí)驗(yàn)中3組大鼠在28 d分別進(jìn)行了脊髓損傷局部組織的HE染色，發(fā)現(xiàn)脊髓損傷大鼠組織中神經(jīng)元空泡樣改變和囊腔樣改變程度不同，轉(zhuǎn)染干細(xì)胞組低于干細(xì)胞組，干細(xì)胞組低于空白對(duì)照組，其次在第28天分別對(duì)各組大鼠脊髓損傷部位行透射電鏡觀察顯示轉(zhuǎn)染干細(xì)胞組神經(jīng)細(xì)胞、突觸及神經(jīng)髓鞘等數(shù)量最多，干細(xì)胞組其次，空白對(duì)照組最少，表明干細(xì)胞有向神經(jīng)細(xì)胞分化的可能性，從而對(duì)大鼠脊髓損傷起到修復(fù)作用。

Ngb是被發(fā)現(xiàn)的第三種攜氧珠蛋白，與神經(jīng)系統(tǒng)組織氧供有密切關(guān)系，它不僅是一種攜氧球蛋白，也是一種氧感受器[7,18]。Luyckx等[19]研究不同區(qū)域腦組織在缺血條件下腦損傷的嚴(yán)重程度，結(jié)果顯示Ngb在大腦皮質(zhì)中的水平遠(yuǎn)高于海馬組織，達(dá)4倍左右，證實(shí)了Ngb表達(dá)水平高低與該區(qū)域神經(jīng)元對(duì)缺血、缺氧的耐受性呈正相關(guān)。同時(shí)，Ngb能夠作為氧傳感器，發(fā)揮調(diào)節(jié)信號(hào)通路，減弱氧化應(yīng)激，保持線粒體功能的作用[20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染干細(xì)胞組Ngb表達(dá)水平明顯高于干細(xì)胞組；同時(shí)轉(zhuǎn)染干細(xì)胞組的大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)較干細(xì)胞組好，表明Ngb有利于促進(jìn)大鼠脊髓損傷神經(jīng)功能的恢復(fù)，對(duì)大鼠脊髓損傷神經(jīng)有一定修復(fù)作用。

綜上所述，靜脈注射Ngb轉(zhuǎn)染的ADSCs能夠靶向遷移到脊髓損傷部位，同時(shí)Ngb能在脊髓損傷部位表達(dá)，減輕脊髓損傷局部的氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而對(duì)大鼠脊髓損傷發(fā)揮一定治療作用。ADSCs具有多向分化能力，可以促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，ADSCs及Ngb均對(duì)大鼠脊髓損傷有效，而Ngb轉(zhuǎn)染的ADSCs治療脊髓損傷的效果更佳。