來亞男，姚玉峰，郭曉奎，倪進婧

1.上海交通大學基礎(chǔ)醫(yī)學院免疫學與微生物學系，上海200025；2.上海交通大學醫(yī)學院-國家熱帶病研究中心全球健康學院，上海200025

核糖體是蛋白質(zhì)的合成機器，部分臨床上常用的抗生素通過阻斷細菌核糖體的蛋白質(zhì)合成來發(fā)揮抗菌作用［1］。細菌核糖體由30S小亞基和50S大亞基組成，包含3 種核糖體RNA（ribosomal RNA，rRNA）和54 種核糖體蛋白［2］。很多已知的抗生素作用于核糖體翻譯的延伸階段，如氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類、氯霉素類、夫西地酸類和四環(huán)素類等［3］。細菌為了避免其被藥物清除，可通過一系列限制性行為減少藥物對自身的作用。例如，某些革蘭陰性菌通過外膜來阻止抗生素進入細胞［4］。除此之外，細菌還可對核糖體成分修飾或使其發(fā)生突變，來減弱抗生素與核糖體的結(jié)合能力。例如細菌通常會利用甲基轉(zhuǎn)移酶來甲基化修飾50S 亞基23S rRNA 或30S 亞基16S rRNA，獲得耐藥性［5-6］；30S 亞基核糖體蛋白S12的突變也被證明可誘導細菌對引起蛋白質(zhì)錯誤合成的抗生素如鏈霉素產(chǎn)生耐藥性［7-8］。

乙?；揎検羌毦w內(nèi)主要的蛋白翻譯后修飾類型，對蛋白質(zhì)表達和細胞代謝具有多個方面的影響。例如，乙酰化修飾影響細菌的致病性［9］、對外界環(huán)境的應(yīng)答［10］和代謝過程等［11］。在細菌中，蛋白質(zhì)乙酰轉(zhuǎn)移酶（protein acetyltransferase，Pat）是目前研究較充分的乙酰轉(zhuǎn)移酶［12］。乙酰磷酸（acetyl-phosphate，AcP）可直接將其自身的乙?；鶊F轉(zhuǎn)移到賴氨酸殘基ε-氨基上；相比Pat，AcP 的底物范圍更廣，但特異性較低［13-14］。AcP 的水平取決于磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶（phosphotransacetylase，Pta）催化生成乙酰輔酶A 的速率，以及被乙酸激酶（acetate kinase，AckA）降解為乙酸的速率。敲除編碼AckA 的基因ackA 會導致細胞內(nèi)AcP 含量升高。乙?；揎椧材鼙粺燉０废汆堰识塑账嵋蕾囆匀ヒ阴；福∟AD+-dependent protein deacylase，CobB）進行去乙?；揎?，它可以去除Pat 和AcP 2 種修飾途徑來源的乙?；鶊F［15］。細菌核糖體是臨床常用抗生素的主要靶標。研究［7-8］證實核糖體蛋白的突變會影響細菌對抗生素的敏感性。課題組前期通過乙酰化質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)鼠傷寒沙門菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium，S. Typhimurium）的核糖體蛋白存在廣泛的乙?；揎?，然而這種普遍的修飾狀態(tài)是否影響抗生素與細菌的結(jié)合還未知。故本研究以3 種乙?；揎椣嚓P(guān)基因敲除株（pat 基因敲除株Δpat、cobB基因敲除株ΔcobB和ackA基因敲除株ΔackA）為研究對象，探究細菌乙?；揎棇股嘏c細菌結(jié)合關(guān)系有無影響，從而為尋找解決細菌耐藥問題提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株 S.Typhimurium 14028S 菌株購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）。 Δpat、 ΔcobB、 ΔackA 是 在S. Typhimurium 14028S 的遺傳背景下分別敲除pat 基因、cobB 基因、ackA基因獲得的菌株，均來自本實驗室。

1.1.2 試劑與儀器 嘌呤霉素（貨號A610593）、四環(huán)素（貨號A100422）、壯觀霉素（貨號A600901）、巴龍霉素（貨號A614181）均購于生工生物工程（上海）股份有限公司。Easyspiral dilute細菌涂布儀購于上海書俊儀器設(shè)備有限公司，Synergy 2酶標儀購于美國伯騰儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細菌生長曲線測定 挑取單克隆菌落于無菌LB培養(yǎng)基（Luria-Bertani medium）中，37 ℃過夜培養(yǎng)；用新鮮LB 培養(yǎng)基調(diào)整菌液在波長600 nm 處的吸光度值D（600 nm），待D（600 nm）=1 后，將菌液按照1∶10 的比例轉(zhuǎn)接，使起始D（600 nm）=0.1，之后每1 h 測量1 次D（600 nm）。以時間為橫坐標，D（600 nm）為縱坐標，繪制細菌生長曲線。

1.2.2 抗生素梯度稀釋液制備 根據(jù)Wiegand等［16］的方法制備抗生素梯度稀釋液。首先配置成濃度為1 280 mg/L的抗生素母液。計算公式為W=（C×V）/P，其中W=需溶解的抗生素質(zhì)量（mg），V=實驗需要的體積（mL），C=最終儲存濃度（μg/mL），P=說明書中顯示的抗生素有效含量（μg/mg）。按照表1 在無菌試管中用無菌LB 培養(yǎng)基制備抗生素稀釋液。

1.2.3 菌落形成單位計算 挑取單克隆菌落于新鮮的LB培養(yǎng)基中，37 ℃過夜培養(yǎng)，測定過夜培養(yǎng)菌液的D（600 nm）。用無菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）按照1∶10的比例倍比稀釋菌液直至稀釋度達到10?7；分別取100 μL 10?4～10?7稀釋度的菌液涂布平板，37 ℃培養(yǎng)，隔日計數(shù)每個平板中的單克隆菌落數(shù)。菌落形成單位（colony forming unit，CFU）根據(jù)公式N=C×101+D計算，其中N=每毫升菌液的CFU數(shù)，C=每個平板中的單克隆菌落數(shù)（100～400 個），D=按照1∶10 進行稀釋的次數(shù)。實驗重復3 次，取平均值。確定D（600 nm）與CFU的關(guān)系系數(shù)。

表1 抗生素稀釋液的配制Tab 1 Preparation of antibiotic dilution

1.2.4 肉湯稀釋法測定最低抑菌濃度 根據(jù)D（600 nm）和CFU 的關(guān)系系數(shù)，調(diào)整過夜培養(yǎng)菌液的起始接種量為1×108CFU/mL。取96 孔板，無菌對照孔加入100 μL 無菌LB培養(yǎng)基，生長對照孔加入50 μL無菌LB培養(yǎng)基，其他孔加入各稀釋度抗生素50 μL。將1×108CFU/mL細菌懸浮液按照1︰100稀釋，在生長對照孔和加入各稀釋度抗生素的孔中加入50 μL細菌懸液，充分混勻。37 ℃孵育16～20 h，酶標儀測量D（600 nm），同時可通過涂布法確保96孔板中細菌數(shù)量約為5×105CFU/mL。當某稀釋度抗生素對應(yīng)的孔中與無菌對照孔中菌液的D（600 nm）相同，則該稀釋度下的抗生素濃度即為最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。

1.2.5 稀釋點板實驗 將過夜培養(yǎng)菌液按照1∶100 轉(zhuǎn)接至新鮮的LB 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至D（600 nm）=1。取1 mL菌液3 000×g離心8 min，無菌PBS洗滌，調(diào)整D（600 nm）至0.1。按照1∶10的比例倍比稀釋至10?4稀釋度。取各稀釋度（100、10?1、10?2、10?3、10?4）菌液2 μL 依次點板，37 ℃培養(yǎng)16 h，觀察細菌的生長狀態(tài)。

2 結(jié)果

2.1 乙?；揎棇毦L狀態(tài)的影響

為了排除乙?；揎棇毦L狀態(tài)的影響，首先測量了S.Typhimurium 14028S及3種乙酰化修飾相關(guān)基因敲除株Δpat、ΔcobB和ΔackA的生長曲線。由于點板稀釋實驗設(shè)置的初始D（600 nm）=0.1，故以D（600 nm）=0.1作為起始D（600 nm）連續(xù)監(jiān)測。圖1 顯示，隨著培養(yǎng)時間的增加，S.Typhimurium 14028S 和3 種乙?；揎椣嚓P(guān)基因敲除株的生長曲線較為吻合，表明乙?；腿ヒ阴；揎棽挥绊懠毦纳L狀態(tài)。此外，在D（600 nm）都為0.1 的情況下，通過稀釋涂布法確定的3 種乙酰化修飾相關(guān)基因敲除株和S.Typhimurium 14028S 活菌數(shù)量也沒有明顯差異。

2.2 S.Typhimurium 14028S的MIC測定

為了探究乙?；揎検欠裼绊懠毦鷮颂求w靶向抗生素的敏感性，我們選擇4種核糖體靶向抗生素——嘌呤霉素、巴龍霉素、四環(huán)素和壯觀霉素，通過肉湯稀釋法檢測其對S. Typhimurium 14028S 的MIC。結(jié)果顯示：嘌呤霉素的MIC 為256 mg/L，巴龍霉素的MIC 為32 mg/L，四環(huán)素的MIC為4 mg/L，壯觀霉素的MIC為128 mg/L。

圖1 S.Typhimurium 14028S和各乙?；揎椣嚓P(guān)基因敲除株的生長曲線Fig 1 Growth curves of S. Typhimurium 14028S and acetylation related gene mutants

2.3 乙?；揎椣嚓P(guān)基因敲除株對核糖體靶向抗生素的敏感性

根據(jù)上述MIC 測定結(jié)果，制備濃度低于相關(guān)抗生素MIC 的含抗生素平板培養(yǎng)基。培養(yǎng)S. Typhimurium 14028S 和3 種乙?；揎椣嚓P(guān)基因敲除株單克隆，調(diào)整D（600 nm）=0.1；將菌液按照1∶10 的比例倍比稀釋至10?4稀釋度，取10?4～100稀釋度的菌液分別點板。

2.3.1 乙?；揎椣嚓P(guān)基因敲除株對嘌呤霉素的敏感性 在無抗生素的平板培養(yǎng)基上，4種菌株的生長狀態(tài)相似且生長狀態(tài)均正常（圖2）。在含128 mg/L 嘌呤霉素的平板培養(yǎng)基上，S. Typhimurium 14028S、Δpat 和ΔcobB的生長狀態(tài)正常，ΔackA（胞內(nèi)AcP 含量增加，乙?；潭壬撸╋@示生長缺陷，表明在AcP 的調(diào)控下，細菌對結(jié)合在50S 亞基上的嘌呤霉素的敏感性提高。cobB 基因敲除后（ΔcobB），雖然整體乙?；潭壬撸obB 在點板稀釋實驗中并沒有明顯表型，表明去乙?；窩obB 不參于調(diào)控S. Typhimurium 對嘌呤霉素的敏感性。

2.3.2 乙?；揎椣嚓P(guān)基因敲除株對巴龍霉素的敏感性 在含8 mg/L 巴龍霉素的平板培養(yǎng)基上，S.Typhimurium 14028S、ΔcobB 和ΔackA 的生長狀態(tài)較為正常，但Δpat已經(jīng)出現(xiàn)明顯的生長缺陷；在含16 mg/L巴龍霉素的平板培養(yǎng)基上，10?4～100稀釋度的ΔackA仍然可以生 長，而10?3和10?4稀 釋 度 的S. Typhimurium 14028S 和ΔcobB的生長受到明顯抑制（圖3）。這一結(jié)果表明乙?；潭冉档停éat），S.Typhimurium對巴龍霉素的敏感性增加；而乙?；潭壬撸éckA），S.Typhimurium 對巴龍霉素的敏感性降低。巴龍霉素可引起細菌翻譯錯誤率升高。相比S. Typhimurium 14028S，Δpat 呈現(xiàn)明顯的生長缺陷表型，表明乙?；揎棇τ诩毦S持正常的翻譯保真度至關(guān)重要。

圖2 嘌呤霉素的點板稀釋實驗結(jié)果Fig 2 Spot dilution assay of puromycin

圖3 巴龍霉素的點板稀釋實驗結(jié)果Fig 3 Spot dilution assay of paromomycin

2.3.3 乙?；揎椣嚓P(guān)基因敲除株對四環(huán)素和壯觀霉素的敏感性 3種乙?；揎椣嚓P(guān)基因敲除株在同一四環(huán)素和壯觀霉素濃度下，生長狀態(tài)和生長受到抑制的程度與S.Typhimurium 14028S 相同（圖4、5），表明乙?；潭仍龈撸éobB、ΔackA）或降低（Δpat），S.Typhimurium對四環(huán)素和壯觀霉素的敏感性沒有受到影響。

圖4 四環(huán)素點板稀釋實驗Fig 4 Spot dilution assay of tetracycline

圖5 壯觀霉素點板稀釋實驗結(jié)果Fig 5 Spot dilution assay of spectinomycin

3 討論

蛋白質(zhì)是所有生物體生存的物質(zhì)基礎(chǔ)。真核生物和原核生物的蛋白質(zhì)翻譯過程存在明顯差異，一些抗生素的開發(fā)正是利用了這一差異［17］。本實驗室前期的乙?；|(zhì)譜分析顯示S.Typhimurium 的核糖體蛋白存在廣泛的乙?；揎棧⑶沂蹵cP 和Pat共同調(diào)控。核糖體蛋白的氨基酸突變會影響細菌對抗生素的敏感性［18］，但核糖體蛋白翻譯后修飾在其中的作用尚不清楚。本研究以3種乙?；揎椣嚓P(guān)基因敲除株為研究對象，并選擇4種核糖體靶向抗生素，來探究細菌核糖體蛋白的乙酰化修飾在應(yīng)對抗生素的作用時所扮演的角色。

嘌呤霉素因為其分子結(jié)構(gòu)類似于氨酰轉(zhuǎn)運RNA（aminoacyl transfer RNA，aa-tRNA）而被摻入肽鏈的合成，從而導致肽鏈合成提前終止，其作用位點位于肽酰轉(zhuǎn)移酶活性中心［19］。我們發(fā)現(xiàn)ackA 基因敲除后，即乙?；潭壬?，S.Typhimurium 對嘌呤霉素的敏感性增加。通常嘌呤霉素摻入導致細菌蛋白質(zhì)翻譯終止的原因是肽酰轉(zhuǎn)移酶對其的識別和催化，但在乙?；潭壬叩那闆r下，S.Typhimurium 對嘌呤霉素的敏感性增加，我們猜測乙酰化修飾可能會增加肽酰轉(zhuǎn)移酶的活性從而導致更多嘌呤霉素的摻入。

巴龍霉素結(jié)合在細菌核糖體30S亞基的解碼中心，引起其構(gòu)象變化，從而影響A 位點上mRNA 和aa-tRNA 密碼子反密碼子螺旋的形成［20］。我們發(fā)現(xiàn)ΔackA 菌株對巴龍霉素的敏感性降低，這一結(jié)果提示乙?；揎椏赡軙绊?0S亞基解碼中心結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象，從而影響巴龍霉素的結(jié)合。細菌核糖體蛋白的氨基酸突變，造成核糖體蛋白側(cè)鏈結(jié)構(gòu)改變，影響抗生素結(jié)合位點的空間構(gòu)型，從而影響細菌對抗生素的敏感性［18］。我們猜測乙?；揎椊档蚐.Typhimurium 對巴龍霉素的敏感性，可能是核糖體蛋白的乙?；揎椝?。核糖體蛋白的賴氨酸發(fā)生乙?；揎?，會中和生理條件下核糖體蛋白賴氨酸所帶的正電荷；同時乙?；鶊F的摻入會使蛋白質(zhì)側(cè)鏈結(jié)構(gòu)發(fā)生變化；這2 種改變都可能會削弱核糖體蛋白與rRNA 的結(jié)合，影響核糖體結(jié)構(gòu)，從而導致巴龍霉素在核糖體上結(jié)合位點的空間構(gòu)型發(fā)生改變。但乙酰化修飾影響S.Typhimurium 對巴龍霉素敏感性的具體調(diào)節(jié)機制仍需要進一步研究。

四環(huán)素阻止aa-tRNA 結(jié)合到30S 亞基A 位點［21］，使其被16S rRNA 完全包圍，與核糖體蛋白沒有任何接觸。壯觀霉素抑制tRNA-mRNA 的易位過程，除了與16S rRNA 的螺旋34（helix 34）相互作用外，與核糖體蛋白S5的第25位賴氨酸也存在相互作用［21］。我們發(fā)現(xiàn)乙酰化修飾程度改變不影響S.Typhimurium 對這2 種抗生素的敏感性，表明乙?；揎棽挥绊懣股亟Y(jié)合位點的空間構(gòu)型。但不能認為核糖體蛋白的乙酰化修飾在其中沒有發(fā)揮作用，因為乙?；揎検菍颂求w蛋白整體的功能調(diào)控，并非對某一核糖體蛋白的單一調(diào)控。一個比較經(jīng)典的例子是核糖體蛋白S12和S4之間的關(guān)系。有研究［22］發(fā)現(xiàn)S12 突變后會減弱S.Typhimurium 的毒力，但在S12 突變株中會出現(xiàn)高頻率的S4 突變株來回補毒力。同理，乙?；揎椧彩且环N全局性調(diào)控，影響核糖體蛋白與rRNA、tRNA 等組分之間的相互作用，從而保證細菌在應(yīng)對各種脅迫環(huán)境下依然能夠生存。

本研究發(fā)現(xiàn)乙?；揎棔绊懠毦鷮颂求w靶向抗生素的敏感性，這種影響可能是通過核糖體蛋白的乙?；揎梺碚{(diào)控的。探究乙?；揎椗c細菌對抗生素敏感性的關(guān)系對于解決臨床上日益嚴重的耐藥問題以及新藥的研制具有重要的意義。