劉雪莉 袁坤 趙冬 王鐵戰(zhàn) 崔曉燕 甄曉蘭 施麟 李揮

磷脂是生命的基礎(chǔ)物質(zhì)，也是制備脂質(zhì)體的主要膜材，在生物體內(nèi)可降解，且無(wú)毒性、無(wú)免疫原性[1]。磷脂氫化后的氫化大豆卵磷脂(HSPC)增強(qiáng)了其親水性和穩(wěn)定性[2]，從而可增強(qiáng)脂質(zhì)體制劑的穩(wěn)定性，因此在長(zhǎng)效靶向制劑鹽酸多柔比星脂質(zhì)體注射液[3,4]、兩性霉素B脂質(zhì)體注射液[5,6]等藥物制劑[7,8]中更多應(yīng)用。作為裝載藥物的輔料，其使用量較大，故控制藥用輔料氫化大豆卵磷脂中的細(xì)菌內(nèi)毒素含量，對(duì)于藥物制劑安全性具有重要作用。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查所用鱟試劑，與內(nèi)毒素的反應(yīng)一般在水溶液中進(jìn)行，但HSPC不溶于水，細(xì)菌內(nèi)毒素檢查無(wú)法正常進(jìn)行。查閱用有機(jī)溶劑溶解樣品，再進(jìn)行內(nèi)毒素檢查的相關(guān)研究報(bào)道[9-14]后，我們采用三氯甲烷溶解HSPC，再加入BET水振蕩萃取，進(jìn)行HSPC細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的研究。經(jīng)過(guò)探索與驗(yàn)證，通過(guò)干擾擴(kuò)大及內(nèi)毒素回收等實(shí)驗(yàn)，證明該法符合《中國(guó)藥典》2020年版通則1143[15]與現(xiàn)行美國(guó)藥典USP42-<85> 的要求，可用于控制藥用輔料氫化大豆卵磷脂中細(xì)菌內(nèi)毒素含量，其檢查限值可定為：每1毫克氫化大豆卵磷脂中含內(nèi)毒素的量應(yīng)<0.006 EU。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 氫化大豆卵磷脂(批號(hào)525600-2160616-01、525600-2160654-01、525600-2160658-01)。鱟試劑1(TAL1，批號(hào)1805163，規(guī)格為每支0.1 ml，λ=0.06 EU/ml，湛江安度斯生物有限公司)；鱟試劑2(TAL2，批號(hào)1904100，規(guī)格為每支0.1 ml，λ=0.06 EU/ml，湛江博康海洋生物有限公司)。細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品(CSE，批號(hào)150601-201784，規(guī)格為每支80 EU，中國(guó)食品藥品檢定研究院)。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水(BET水，批號(hào)1706070，規(guī)格50 ml，湛江安度斯生物有限公司)。三氯甲烷(分析純，批號(hào)20190103，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 TAL靈敏度復(fù)核試驗(yàn)：按2020年版《中國(guó)藥典》通則1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法[15]進(jìn)行試驗(yàn)，其靈敏度在0.5～2.0 λ范圍內(nèi)，方可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 供試品有效稀釋濃度計(jì)算：HSPC在脂質(zhì)體中作為裝載藥物輔料使用，根據(jù)臨床脂質(zhì)體最大使用量以及HSPC在處方中的含量，計(jì)算得到HSPC細(xì)菌內(nèi)毒素檢查限值L=0.006 EU/mg，則最低有效濃度為MVC=λ/L=0.06EU/ml/0.006 EU/mg=10 mg/ml。

1.2.3 供試品干擾預(yù)試驗(yàn)：分別量取5 ml三氯甲烷和5 ml BET水，混合均勻，渦旋振蕩2 min，靜置30 s以上使之分層，獲得三氯甲烷飽和水溶液(上層溶液)和水飽和三氯甲烷溶液(下層溶液)備用。見(jiàn)圖1。

圖1 三氯甲烷-水振蕩萃取法對(duì)氫化大豆卵磷脂的處理過(guò)程

精密稱(chēng)取3批HSPC(編號(hào)①、②、③)200.0 mg，分別加入1 ml水飽和三氯甲烷溶液，渦旋振蕩使之充分溶解，然后再加入三氯甲烷飽和水溶液4ml，充分渦旋振蕩，靜置分層，使上層成為澄清均一的溶液(相當(dāng)于50 mg/ml的供試品溶液)，取上層溶液1.0 ml加BET水1.0 ml制備成25 mg/ml的溶液(如圖1所示)，將此濃度溶液同時(shí)分兩種方式進(jìn)行稀釋?zhuān)?1)取此溶液1.0 ml加BET水1.0 ml，稀釋后的溶液(12.5 mg/ml)記為供試品溶液(NPC:即為最小有效稀釋濃度的1.25倍)；(2)取溶液1.0 ml加入4 λ濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 ml，使?jié)舛葹?2.5 mg/ml的供試品中均有2λ濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素，此溶液為供試品陽(yáng)性對(duì)照溶液(PPC)。分別取鱟試劑TAL A、TAL B(靈敏度均為0.06 EU/ml)，與上述NPC和PPC進(jìn)行反應(yīng)，陰性(NC：只加入BET水)、陽(yáng)性(PC：加入2 λ濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素工作品)對(duì)照各兩管，于(37±1)℃保溫(60±2)min。

1.2.4 細(xì)菌內(nèi)毒素回收率驗(yàn)證試驗(yàn)：上述三氯甲烷溶解，水振蕩萃取操作，是否會(huì)造成樣品本身所含細(xì)菌內(nèi)毒素的流失，造成假陰性現(xiàn)象導(dǎo)致誤判。基于此問(wèn)題，我們建立細(xì)菌內(nèi)毒素回收實(shí)驗(yàn)。見(jiàn)圖2。

圖2 細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品回收驗(yàn)證試驗(yàn)處理方法

將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品(CSE)，用BET水溶解成100 EU/ml的母液備用。取母液20 μl加至1.04 ml的水飽和三氯甲烷液中混勻，再加入三氯甲烷飽和BET水溶液4.16 ml，振蕩萃取，水溶液中內(nèi)毒素含量相當(dāng)于0.48 EU/ml(以上操作與萃取時(shí)水與三氯甲烷的比例，與預(yù)實(shí)驗(yàn)中對(duì)HSPC的處理完全一致)。再用BET水稀釋?zhuān)渲?.0 λ、1.0 λ、0.5 λ、0.25 λ濃度(0.12 EU/ml、0.06 EU/ml、0.03 EU/ml、0.015 EU/ml)的CSE溶液，進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素回收驗(yàn)證。

1.2.5 供試品干擾確證試驗(yàn)：干擾確證試驗(yàn)根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果而設(shè)定，操作方法嚴(yán)格執(zhí)行2020年版《中國(guó)藥典》通則1143及 USP42-<85>細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法。

2 結(jié)果

2.1 TAL靈敏度復(fù)核 按2020年版《中國(guó)藥典》通則1143[15]進(jìn)行TAL靈敏度復(fù)核試驗(yàn)，結(jié)果其靈敏度均在0.5～2.0 λ范圍內(nèi)，符合規(guī)定，可用于細(xì)菌內(nèi)毒素干擾試驗(yàn)及樣品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)(“+”表示鱟試劑安瓿從恒溫箱中輕輕取出，緩緩倒轉(zhuǎn)180°，所形成凝膠不變形，不滑脫?！?” 表示未形成凝膠或凝膠不堅(jiān)實(shí)，變形并滑脫)。見(jiàn)表1。

表1 TAL靈敏度復(fù)核試驗(yàn)結(jié)果

2.2 供試品干擾預(yù)試驗(yàn) 按圖1所示進(jìn)行供試品干擾預(yù)試驗(yàn)操作，實(shí)驗(yàn)結(jié)果：當(dāng)濃度為最小有效稀釋濃度(MVC=10 mg/ml)的1.25倍，即12.5 mg/ml時(shí)對(duì)TAL A、TAL B均無(wú)干擾作用，故可將HSPC 12.5 mg/ml濃度進(jìn)行正式干擾試驗(yàn)。見(jiàn)表2。

表2 氫化大豆卵磷脂干擾預(yù)試驗(yàn)結(jié)果

2.3 細(xì)菌內(nèi)毒素回收率驗(yàn)證試驗(yàn) 細(xì)菌內(nèi)毒素回收率驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明：TAL A、TAL B的Et在0.5～2 λ范圍內(nèi)，即0.03～0.12 EU/ml范圍內(nèi)，說(shuō)明三氯甲烷溶解以及水振蕩萃取的操作方法對(duì)內(nèi)毒素含量無(wú)影響。見(jiàn)表3。

表3 細(xì)菌內(nèi)毒素回收驗(yàn)證結(jié)果

2.4 供試品干擾確證試驗(yàn) 根據(jù)干擾預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，將3批供試品，采用1.25倍MVC濃度(12.5 mg/ml)進(jìn)行干擾確證試驗(yàn)，結(jié)果表明：3批供試品在12.5 mg/ml濃度時(shí)，Et均在0.5～2 λ間，對(duì)鱟試劑無(wú)干擾作用。見(jiàn)表4。

表4 氫化大豆卵磷脂干擾確證試驗(yàn)結(jié)果

2.5 三批供試品檢查 三批HSPC(供試品編號(hào)①至③)，按2020年版《中國(guó)藥典》通則1143，以及 USP42-<85>細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，以檢查限值為0.006 EU/mg進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，結(jié)果均為陰性，符合規(guī)定。見(jiàn)表5。

表5 樣品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果

3 討論

3.1 三氯甲烷-水振蕩萃取法可用于氫化大豆卵磷脂細(xì)菌內(nèi)毒素檢查 根據(jù)以上試驗(yàn)研究，通過(guò)特定比例的三氯甲烷-水振蕩萃取法，可建立符合《中國(guó)藥典》2020年版通則1143以及 USP42-<85>的藥用輔料氫化大豆卵磷脂細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，檢查限值定為每1毫克氫化大豆卵磷脂中含內(nèi)毒素的量應(yīng)<0.006 EU，此方法可控制藥用輔料氫化大豆卵磷脂中的細(xì)菌內(nèi)毒素含量。

3.2 三氯甲烷和水互飽和溶液的制備與使用關(guān)鍵 氫化大豆卵磷脂在第一步溶解與萃取時(shí)需要采用水飽和三氯甲烷溶液，及三氯甲烷飽和水溶液，其余步驟均用BET水稀釋。飽和溶液制備時(shí)，BET水和三氯甲烷需充分混合，確保形成各自的飽和溶液，使萃取過(guò)程不會(huì)發(fā)生氫化大豆卵磷脂的析出而致溶液渾濁，從而保證研究方法的可行性。

用水飽和三氯甲烷溶液溶解HSPC時(shí)，先溶解為200 mg/ml的溶液，然后用三氯甲烷飽和水溶液萃取其中含有的細(xì)菌內(nèi)內(nèi)毒素，三氯甲烷水溶液和水飽和三氯甲烷溶液的體積比≥4∶1，方可使內(nèi)毒素萃取完全；小于此體積比，無(wú)法通過(guò)細(xì)菌內(nèi)毒素回收率驗(yàn)證試驗(yàn)，易導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果假陰性，從而造成誤判，無(wú)法控制藥用輔料氫化大豆卵磷脂的質(zhì)量安全。

3.3 藥用輔料氫化大豆卵磷脂細(xì)菌內(nèi)毒素檢查標(biāo)準(zhǔn)制定 沿用中國(guó)藥典的表述習(xí)慣，藥用輔料氫化大豆卵磷脂細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法可定為：取本品，可用0.06 EU/ml及以上靈敏度鱟試劑，依法檢查(《中國(guó)藥典》2020年版通則1143)，每1毫克氫化大豆卵磷脂中含內(nèi)毒素的量應(yīng)<0.006 EU。此方法同樣符合美國(guó)藥典USP42-<85>細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的要求。

三氯甲烷-水振蕩萃取法建立的藥用輔料氫化大豆卵磷脂細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法，為其安全性檢查標(biāo)準(zhǔn)的制定提供了有力的研究資料；為其他常規(guī)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法不能滿足的藥品原料及藥用輔料方法學(xué)[16]，擴(kuò)展了思路。

3.4 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法為檢測(cè)化學(xué)藥品及輔料中熱原物質(zhì)的主要技術(shù) 熱原物質(zhì)檢測(cè)技術(shù)是保證藥品安全性的關(guān)鍵技術(shù)，目前中國(guó)藥典收錄的主要檢測(cè)方法為家兔熱原檢查法及細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，并規(guī)定：對(duì)于化學(xué)藥品注射液，首選細(xì)菌內(nèi)毒素檢查項(xiàng)[17]。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法包括凝膠法和光度法共6種檢查方法[18]，當(dāng)結(jié)果有爭(zhēng)議時(shí)，以凝膠限度試驗(yàn)結(jié)果為準(zhǔn)[15]。故在此研究中，我們采用具有仲裁意義的凝膠限度試驗(yàn)建立藥用輔料氫化大豆卵磷脂細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法，以更好地控制輔料質(zhì)量，為確保藥物制劑質(zhì)量安全做好充分的技術(shù)支持。

3.5 重組C因子法的后續(xù)研究 C因子是鱟試劑中對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素敏感的蛋白，能夠選擇性識(shí)別內(nèi)毒素并激活蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)[19]。重組C因子法作為細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的補(bǔ)充方法，已首次被2020年版中國(guó)藥典收錄[18]，近年來(lái)受到廣泛關(guān)注與研究[20-22]。通過(guò)生物技術(shù)重組獲得的鱟試劑中的C因子，可代替海洋生物鱟作為鱟試劑原料唯一來(lái)源，具有很好的發(fā)展前景。本科研團(tuán)隊(duì)將繼續(xù)進(jìn)行重組C因子法對(duì)藥用輔料氫化大豆卵磷脂中細(xì)菌內(nèi)毒素的探索研究，以期采用新技術(shù)、多手段、高質(zhì)量控制藥品安全。