陳高健，何錦鋒，湯麗昌

（北海市食品藥品檢驗(yàn)所，廣西北海 536000）

食品添加劑是為改善食品品質(zhì)和色、香、味，以及為防腐、保鮮和加工工藝的需要而加入食品中的人工合成或者天然物質(zhì)[1]。食品添加劑的合理使用，不僅改善食品的風(fēng)味和口感，同時(shí)也豐富食品種類、延長(zhǎng)了食品保存期。但是食品添加劑超出限量控制、超出范圍、違禁使用等現(xiàn)象使食品添加劑的安全問(wèn)題又成為了食品安全方面的重大問(wèn)題[2-3]。食品添加劑本身沒(méi)有太大營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，而且可能還具有一定的副作用[4]。此外,有研究報(bào)道糖精鈉、檸檬黃分別與苯甲酸鈉聯(lián)合作用于L-929 細(xì)胞,可表現(xiàn)出毒性相加作用，食品添加劑的混合使用可能產(chǎn)生聯(lián)合毒性作用[5]。酒類產(chǎn)品作為節(jié)假日及婚喪喜慶必不可少的飲品，其飲用安全重要性不言而喻。因此，筆者針對(duì)酒類產(chǎn)品中的甜味劑、防腐劑等食品添加劑進(jìn)行了一種快速、準(zhǔn)確、靈敏的分析方法研究。目前，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)針對(duì)甜味劑和防腐劑等的檢測(cè)主要以液相色譜法、氣相色譜法為主要檢測(cè)手段，而且各成分間執(zhí)行檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)又各不相同[6-11]。從文獻(xiàn)報(bào)道來(lái)看[12-18]，存在檢測(cè)酒類產(chǎn)品單一（僅為白酒或葡萄酒）或所測(cè)成分僅為甜味劑，關(guān)于酒類防腐劑研究較少等問(wèn)題。

本研究建立了一種高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)酒類產(chǎn)品中13 種食品添加劑的分析方法，其中，9 種甜味劑分別是甜蜜素、三氯蔗糖、安賽蜜、阿斯巴甜、紐甜、赤鮮糖醇、糖精鈉、甘草酸、山梨糖醇；3 種防腐劑分別是山梨酸、苯甲酸、脫氫乙酸；以及作為酸度調(diào)節(jié)劑和防腐功能的檸檬酸。該方法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可同時(shí)檢測(cè)多種添加劑，滿足高通量的檢測(cè)要求，為酒類產(chǎn)品中添加劑檢測(cè)提供快速有效的方法，為白酒中非法添加甜味劑等食品添加劑的快速篩查提供有力的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

酒樣：啤酒、葡萄酒、黃酒、配制酒、果酒、白酒樣品，市售。

儀器設(shè)備：LC-MS/MS G6460 高效液相色-串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)Agilent 公司，具體配置為1290 超高效液相色譜儀，G6460 三重串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜儀，Agilent Mass Hunter B.06.00 工作站），XS205DU 十萬(wàn)分之一電子分析天平（瑞士Mettler 公司），3-18KS 高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（德國(guó)SIGMA 公司），5510E-DTH 超聲波清洗儀（上海必能信超聲有限公司），Mili-Q超純水儀（德國(guó)Merck 公司）。

試劑及耗材：甘草酸、三氯蔗糖、紐甜、阿斯巴甜、檸檬酸、糖精鈉、山梨醇、甜蜜素、脫氫乙酸、安賽蜜、赤蘚糖醇、苯甲酸、山梨酸對(duì)照品，分別購(gòu)自德國(guó)Dr Ehrenstorfer GmbH 公司、中國(guó)食品藥品檢定所、上海安普生物科技有限公司（純度≥98.0%；甲醇（色譜純，美國(guó)Fisher 公司），甲酸、乙酸銨（色譜純，美國(guó)Tedia 公司），亞鐵氰化鉀、乙酸鋅（優(yōu)級(jí)純，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司），水為Mili-Q制備超純水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 對(duì)照品溶液制備

精密稱取甘草酸、三氯蔗糖、紐甜、阿斯巴甜、檸檬酸、糖精鈉、山梨醇、甜蜜素、脫氫乙酸、安賽蜜、赤蘚糖醇、苯甲酸、山梨酸對(duì)照品適量，加50%甲醇分別制成1 mg/mL 貯備液。分別取各對(duì)照品溶液1 mL，置于同一50 mL 量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得13 種食品添加劑混合對(duì)照品溶液。

1.2.2 供試品溶液

準(zhǔn)確稱取啤酒、葡萄酒、黃酒、配制酒、果酒2 g于50 mL PE 管中，加50 %甲醇約25 mL，渦旋混勻，于50 ℃水浴超聲50 min，冷卻至室溫后加亞鐵氰化鉀溶液2 mL 和乙酸鋅溶液2 mL，混勻，置離心機(jī)中，以8000 r/min 離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中，于殘?jiān)屑?0 %甲醇20 mL，渦旋混勻后超聲5 min，以8000 r/min 離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移到同一50 mL 容量瓶中，并用水定容至刻度，混勻，經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾[10]，取續(xù)濾液，即得。

準(zhǔn)確稱取白酒2 g 于蒸發(fā)皿中，于60 ℃恒溫水浴鍋加熱蒸發(fā)至無(wú)醇味，冷卻至室溫后用水少量多次轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中，并用水定容至刻度，經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

1.2.3 空白樣品溶液

除不加試樣外，按“1.2.2”項(xiàng)下方法同法制備空白樣品溶液。

1.2.4 儀器測(cè)試條件

表1 13種待測(cè)食品添加劑質(zhì)譜條件

色譜條件：Agilent EC-C18色譜柱（4.6 mm×50 mm,2.7 μm）；流動(dòng)相：水（A）-10 mmol/L 甲酸和10 mmol/L甲酸銨水溶液（B），梯度洗脫（0～1 min，5%→10% B；1～5 min，10%→90%B；5～8 min；90%B；8～10 min，90%→5%B），流速為0.2 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。

質(zhì)譜條件：采用電噴霧負(fù)離子源模式（Electronic spray ion,ESI-），掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring,MRM）；霧化氣壓力：30 psi；干燥氣溫度：250 ℃；干燥氣流速：8 L/min；毛細(xì)管電壓為3500 V；MRM 模式定量。13 種食品添加劑的電離方式、分子量、母離子、子離子、碎裂電壓（Fragmentor）、碰撞能量（CE）等質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件優(yōu)化

本試驗(yàn)考察了甲醇-10 mmol 甲酸水、甲醇-10 mmol 乙酸銨水、乙腈-10 mmol 甲酸水、甲醇-10 mmol 甲酸10 mmol 乙酸銨水溶液等流動(dòng)相條件，發(fā)現(xiàn)以甲醇-10 mmol 甲酸10 mmol 乙酸銨水溶液作為流動(dòng)相，優(yōu)化梯度洗脫程序后各成分均可以達(dá)到較好的分離和峰形。

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

通過(guò)對(duì)離子源模式（ESI）、碎裂電壓（Fragmentor）、碰撞能量（CE）等條件進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)離子源在負(fù)離子模式（ESI mg/kg）優(yōu)于負(fù)離子模式（ESI+），負(fù)離子模式（ESI mg/kg）下各成分均顯示出較高的檢測(cè)靈敏度。優(yōu)化所得13 種成分UPLC mg/kg MS/MS 色譜圖結(jié)果見(jiàn)圖1，由圖1 可知，13種活性成分分離良好無(wú)干擾，且峰形較好。苯甲酸與山梨酸雖然只產(chǎn)生一個(gè)子離子，但可以從母離子、子離子以及合理的豐度比來(lái)確證及定量，故不影響檢測(cè)要求。

2.3 線性關(guān)系、定量限和檢測(cè)限

按上文所建立的最佳實(shí)驗(yàn)色譜及質(zhì)譜條件，精密量取對(duì)照品溶液適量，采用倍數(shù)稀釋法，制得6個(gè)不同濃度梯度的混合系列溶液，分別進(jìn)樣測(cè)定3次，記錄峰面積。以對(duì)照品待測(cè)液濃度（x）為橫坐標(biāo)，峰面積平均值（y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸，得到13種成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)，再將混合對(duì)照品溶液逐步稀釋，分別以信噪比S/N=10、S/N=3 時(shí)的質(zhì)量濃度作為定量限和檢測(cè)限，結(jié)果見(jiàn)表2，表明各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r＞0.998）。由檢出限和定量限結(jié)果可以看出，本方法靈敏度較高。

2.4 加樣回收率、精密度試驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)分別選取啤酒、葡萄酒、黃酒、配制酒、果酒（除檸檬酸外）及白酒陰性樣品為樣品，分別添加3 個(gè)質(zhì)量濃度水平的標(biāo)樣溶液，濃度梯度分別為：5 mg/kg、25 mg/kg、100 mg/kg，按照以上最優(yōu)實(shí)驗(yàn)方法，分別測(cè)定其含量，不同濃度水平樣品進(jìn)行6 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，計(jì)算出加標(biāo)回收率及精密度，結(jié)果見(jiàn)表3。13 種成分的回收率為88.7%～107.1%，表明該方法回收率良好。RSD：2.2%～8.3%，表明該方法精密度良好。

圖1 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下13 種成分UPLC-MS/MS 色譜圖

表2 13種成分的回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、LOQ 和LOD

2.5 樣品測(cè)定

按所建立的方法對(duì)5 批次葡萄酒、5 批次黃酒、5 批次啤酒、5 批次果酒、5 批次配制酒及20 批次白酒（包括十二大香型白酒）進(jìn)行了13 種食品添加劑的篩查，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3 次。所檢葡萄酒樣品中有1 批檢出安賽蜜、甜蜜素和山梨酸，含量分別為33.82 mg/kg、219.77 mg/kg、132.13 mg/kg；3 批配制酒檢出三氯蔗糖，含量分別為28.93 mg/kg、88.26 mg/kg、96.45 mg/kg；1 批白酒檢出三氯蔗糖，含量為8.80 mg/kg；1 批配制酒檢出檸檬酸，含量為15.02 mg/kg；1 批果酒檢出苯甲酸，含量為123.10 mg/kg；其余樣品的檢測(cè)結(jié)果均為陰性。其中，兩批配制酒標(biāo)簽分別顯示配料表為：水、大米、糯米、蔗糖素，水、大米、清爽型干型清酒（水、糯米、蔗糖素），從配料表來(lái)看可以推測(cè)這兩款酒是白酒生產(chǎn)工藝所得白酒外加三氯蔗糖，而標(biāo)簽顯示執(zhí)行配制酒標(biāo)準(zhǔn)，從檢測(cè)結(jié)果判定來(lái)說(shuō)，這兩個(gè)產(chǎn)品是否能執(zhí)行配制酒國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)有待商榷。另外1批檢出三氯蔗糖的配制酒標(biāo)簽顯示配料為：固液法白酒、多種藥材、三氯蔗糖，標(biāo)簽標(biāo)識(shí)符合配制酒要求[19]，其檢出的三氯蔗糖含量也符合低于0.25 g/kg 限度要求[1]。檢出三氯蔗糖的1 批白酒，其結(jié)果和本課題組成員采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法所得結(jié)果一致[8]，白酒中不得添加任何非白酒發(fā)酵產(chǎn)生的呈香呈味物質(zhì)，因此，判定為不符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。檢出檸檬酸的1批配制酒，標(biāo)準(zhǔn)顯示檸檬酸出現(xiàn)可在各類食品中按生產(chǎn)需要適量使用的食品添加劑名單中[1]，可判定為符合規(guī)定。啤酒、葡萄酒、黃酒、果酒中則均檢出檸檬酸，含量在63.20～1221.23 mg/kg 之間，因檸檬酸為自身產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)，且可按生產(chǎn)需要適量使用，故不做判定。

表3 回收率及精密度測(cè)定結(jié)果(n=6)

3 結(jié)論

經(jīng)方法學(xué)考察驗(yàn)證，本試驗(yàn)建立了UPLC-MS/MS 法同時(shí)同時(shí)檢測(cè)酒類產(chǎn)品中13 種食品添加劑的分析方法。與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法比較，該方法簡(jiǎn)便快速、專屬性強(qiáng)、靈敏度高、快速且成本較低，符合相應(yīng)的檢測(cè)需求，其快速性可對(duì)各酒類樣品進(jìn)行快速篩查，較強(qiáng)的專屬性可避免假陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生的誤判，滿足市場(chǎng)日常監(jiān)管需求。該方法為酒類產(chǎn)品的質(zhì)量控制、安全評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)，為保障日常酒類產(chǎn)品的飲用安全具有重要的意義。