袁 韻，王秀菊，劉石雪，王麗萍，禚林娜，張貴選

(1.山東中科新銳檢測(cè)檢驗(yàn)有限公司，山東臨沂 276700；2.山東沂蒙老區(qū)酒業(yè)有限公司,山東臨沂 276700）

酯類是白酒中主要的香味物質(zhì)，己酸乙酯是濃香型白酒的主體香味物質(zhì)[1-2]，其含量的占比決定了濃香型白酒的整體品質(zhì)及風(fēng)格[3]。優(yōu)質(zhì)濃香型原酒乙己比（乙酸乙酯與己酸乙酯含量比值）在0.5 左右，近年來，企業(yè)生產(chǎn)的原酒乙酸乙酯含量偏高，不同等級(jí)的原酒乙己比甚至大于1，導(dǎo)致原酒香型錯(cuò)位，典型性差[4]。分析影響濃香型原酒中乙酸乙酯含量的因素，并通過主動(dòng)干預(yù)是提高濃香型原酒質(zhì)量的主要手段[5]。過去對(duì)濃香型原酒中乙酸乙酯含量影響的研究通?；谏a(chǎn)工藝、原輔料、窖泥、窖池養(yǎng)護(hù)等方面考慮，但未對(duì)釀造用水、酒醅、車間內(nèi)部土壤等釀造環(huán)境進(jìn)行論述。

本研究通過對(duì)釀酒車間釀造用水、酒醅、車間內(nèi)部土壤等釀造環(huán)境進(jìn)行論述，得出釀造環(huán)境與濃香型原酒中乙酸乙酯含量的相關(guān)性。本研究主要包括3 個(gè)方面：不同車間酒醅、窖泥、窖池周圍土壤乙酸菌含量對(duì)比；不同車間酒醅、釀造用水中金屬離子含量對(duì)比；不同車間濃香型原酒乙酸乙酯含量對(duì)比。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器及試劑

1.1.1 材料

本研究所有樣品均由山東沂蒙老區(qū)酒業(yè)有限公司提供。

1.1.2 試劑及耗材

乙酸乙酯、純度≥99.7%、阿拉丁試劑(上海)有限公司；水中錳標(biāo)準(zhǔn)溶液、水中鎂標(biāo)準(zhǔn)溶液、水中鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液、水中鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液、水中銅標(biāo)準(zhǔn)溶液，1000 mg/L，北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司；錳標(biāo)準(zhǔn)溶液、鎂標(biāo)準(zhǔn)溶液、鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液、鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液、銅標(biāo)準(zhǔn)溶液1000 μg/mL、國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心；醋酸菌分離培養(yǎng)基[6]，青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；去離子水。

1.1.3 儀器與設(shè)備

7890B 氣相色譜儀、FID 檢測(cè)器、美國(guó)Agilent公司；ICE3500 原子吸收光譜儀、石墨爐/火焰一體機(jī)、美國(guó)賽默飛；YQX-LS-100A 立式壓力蒸汽滅菌器、上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DH6000BⅡ電熱恒溫培養(yǎng)箱、天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乙酸乙酯成分含量的測(cè)定

色譜條件：CP-Wax 57 CB Acidic 毛細(xì)管色譜柱；程序升溫：初始溫度為35 ℃，保持4 min，以4 ℃/min 升到80 ℃，保持10 min，以8 ℃/min 升到200 ℃，保持10 min；進(jìn)樣口溫度250 ℃；檢測(cè)器溫度300 ℃；載氣氮?dú)狻⒘魉?.8 mL/min、分流比40∶1；進(jìn)樣量1μL。

測(cè)定方法：在上述色譜條件下，吸取樣品10.0 mL于10 mL 容量瓶中，加內(nèi)標(biāo)混勻后進(jìn)樣，根據(jù)保留時(shí)間及峰面積測(cè)定乙酸乙酯含量。每個(gè)樣品測(cè)定兩次，取平均值。

1.2.2 金屬離子含量測(cè)定

Mn2+、Mg2+、K+、Fe3+、Cu2+根據(jù)GB 5009.242—2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中錳的測(cè)定》、GB 5009.241—2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中鎂的測(cè)定》、GB 5009.91—2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中鉀、鈉的測(cè)定》、GB 5009.90—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中鐵的測(cè)定》、GB 5009.13—2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中銅的測(cè)定》、GB/T 5750.6—2006《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法金屬指標(biāo)》分別進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3 乙酸菌含量測(cè)定

取樣方法：窖泥（窖底泥）四角與中心各取10 g；窖壁泥，依據(jù)窖壁高度等分為3 段，每段取中心線上3 點(diǎn)窖泥，每點(diǎn)取10 g；將樣品混合均勻，分裝待測(cè)[7]。酒醅：混勻后在酒醅樣品堆的10 不同部位各取10 g的樣品，將樣品混合均勻，分裝待測(cè)。土樣：窖池四周土樣地點(diǎn)，每邊在3 個(gè)不同部位各取10 g的樣品，將樣品混合均勻，分裝待測(cè)。

測(cè)定方法：根據(jù)樣品實(shí)際狀況，將樣品依次制成10倍遞增系列稀釋樣品勻液。取3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種2 個(gè)無菌平皿，每皿1 mL。同時(shí)取1 mL 生理鹽水加入無菌平皿作空白對(duì)照。及時(shí)將15～20 mL 融化并恒溫至46 ℃的醋酸菌分離培養(yǎng)基（含有無水乙醇）傾注于每個(gè)平皿中。小心旋轉(zhuǎn)平皿，將培養(yǎng)基與樣液充分混勻，待瓊脂凝固后。翻轉(zhuǎn)平板，置于30 ℃±1 ℃下培養(yǎng)36 h[8]。選取菌落數(shù)在15 CFU～150 CFU之間的平板，分別計(jì)數(shù)平板上出現(xiàn)的典型和可疑醋酸菌群菌落。記錄典型菌落形態(tài)及特征，選取可疑菌落進(jìn)行革蘭氏染色驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙酸菌含量檢測(cè)

對(duì)4 個(gè)釀酒車間指定窖池酒醅、窖泥及周圍土壤中乙酸菌含量進(jìn)行對(duì)比，對(duì)比結(jié)果如表1 所示。并對(duì)典型菌落進(jìn)行菌落形態(tài)及染色驗(yàn)證，典型菌落形態(tài)及鏡檢結(jié)果見圖1。

表1 4個(gè)車間酒醅、窖泥及周圍土壤中乙酸菌含量(CFU/g)

由表1 可以看出，4 個(gè)釀酒車間不同樣品乙酸菌含量趨勢(shì)相同，其含量由低到高順序?yàn)?#＜1#＜2#＜3#。由圖1 可以看出，其菌落形態(tài)呈圓形、油脂狀，表面光滑、凸起，邊緣整齊，菌落周圍出現(xiàn)白色透明圈；鏡下細(xì)胞呈短桿狀、革蘭陰性、無芽胞、有夾饃和鞭毛，證實(shí)為乙酸菌。

圖1 乙酸菌菌落形態(tài)

2.2 金屬離子檢測(cè)

對(duì)試驗(yàn)中酒醅樣品及釀酒車間釀造用水進(jìn)行金屬離子檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見表2。從表2 可看出，車間酒醅及釀造用水中1#及4#的Fe3+含量高于其他兩個(gè)車間且4#含量大于1#，K+含量由低到高順序?yàn)椋?#＜1#＜2#＜3#，Mn2+、Cu2+均未檢出。已有研究表明，F(xiàn)e3+能夠促進(jìn)白酒中乙酸乙酯的降解，加快白酒的老熟[9-11]，降低白酒中乙酸乙酯的含量。

表2 酒醅及釀造用水金屬離子含量檢測(cè)

2.3 乙酸乙酯含量檢測(cè)

對(duì)4 個(gè)釀酒車間，每個(gè)車間15 個(gè)指定窖池濃香型原酒進(jìn)行乙酸乙酯含量檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如表3 所示，各車間濃香型原酒乙酸乙酯含量趨勢(shì)如圖2 所示。從圖2 可以看出，4 個(gè)釀酒車間濃香型原酒乙酸乙酯含量由低到高的順序?yàn)?#＜1#＜2#＜3#。

圖2 各車間濃香型原酒乙酸乙酯含量

表3 不同車間、不同窖池濃香型原酒乙酸乙酯含量(g/L)

3 結(jié)論

從結(jié)果分析看出，4個(gè)車間實(shí)驗(yàn)窖池酒醅、窖泥及周圍土壤中乙酸菌含量，酒醅及釀造用水中K+含量，與4 個(gè)車間濃香型原酒乙酸乙酯含量趨勢(shì)相同，其含量由低到高的順序均為4#＜1#＜2#＜3#。酒醅及釀造用水中Fe3+含量，與4 個(gè)車間濃香型原酒乙酸乙酯含量趨勢(shì)相反。

通過對(duì)釀酒車間窖泥、酒醅、窖池周圍土壤、釀造用水進(jìn)行乙酸菌及金屬離子含量檢測(cè)，并將結(jié)果與不同車間原酒乙酸乙酯含量進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)釀造環(huán)境能夠影響濃香型原酒中乙酸乙酯的含量。其環(huán)境中乙酸菌、K+含量與濃香型原酒中乙酸乙酯含量成正比關(guān)系，F(xiàn)e3+含量與濃香型原酒中乙酸乙酯含量成反比關(guān)系，Mn2+、Mg2+、Cu2+對(duì)濃香型原酒中乙酸乙酯含量無明顯影響。本相關(guān)性結(jié)論，旨在對(duì)白酒釀造工藝控制起到一個(gè)理論性指導(dǎo)。