程國(guó)富，鄭自強(qiáng)，衛(wèi)春會(huì)，黃治國(guó)

（1.四川宇晟酒業(yè)投資管理有限公司成都分公司，四川成都 610000；2.四川輕化工大學(xué)釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川宜賓 644000）

蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereusFrankland)屬于芽孢桿菌屬（Bacillus），革蘭氏陽(yáng)性菌，菌體兩端較平整，多呈鏈狀排列，是一種好氧性細(xì)菌，可產(chǎn)抗菌、增香物質(zhì)，抑制不利環(huán)境微生物的繁殖[1-3]。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是白酒釀造的主體菌種，可將原料中的氨基酸等前體物質(zhì)轉(zhuǎn)化為重要風(fēng)味物質(zhì)，并合成多種酶，對(duì)白酒的產(chǎn)量和風(fēng)味有重要影響[4]。

隨著我國(guó)白酒產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展，單一菌種的普遍應(yīng)用引起白酒風(fēng)味特征同質(zhì)化，商業(yè)競(jìng)爭(zhēng)力降低，混菌發(fā)酵逐漸受到關(guān)注，混菌發(fā)酵能改變發(fā)酵產(chǎn)物的風(fēng)味特征，改善酒質(zhì)，使風(fēng)味更加豐富、濃厚[5]。在白酒釀造過(guò)程中，微生物混菌發(fā)酵研究也十分典型，徐巖等[6]將釀酒酵母和異常畢赤酵母(Pichia anomala)共培養(yǎng)的結(jié)果表明，混菌發(fā)酵可豐富醛類(lèi)物質(zhì)的種類(lèi)，高級(jí)醇含量與總酸含量相對(duì)減少，有效改善了發(fā)酵液的風(fēng)味特性，有利于增加發(fā)酵產(chǎn)物的風(fēng)味復(fù)雜性。吳軒德等[7]利用混菌發(fā)酵采用同步接種和順序接種方式研究了釀酒酵母與巴氏醋桿菌(Acetobacter pasteurianus)的相互作用有利于乙酸乙酯的合成，其最高達(dá)595.72 mg/L±5.01 mg/L，是單菌發(fā)酵的10.1倍。

目前，微生物在白酒生產(chǎn)中的作用研究，主要是通過(guò)提高功能微生物在發(fā)酵過(guò)程中的濃度來(lái)改善白酒品質(zhì)，雖然已經(jīng)取得了一些進(jìn)展，但對(duì)功能微生物的篩選應(yīng)用還存在不足，同時(shí)缺乏發(fā)酵過(guò)程中重要微生物之間互相作用的研究以及應(yīng)用微生物在發(fā)酵過(guò)程結(jié)構(gòu)變化的解析，從而在本質(zhì)上對(duì)發(fā)酵過(guò)程機(jī)理認(rèn)識(shí)不足[8]。俗話說(shuō)“好曲產(chǎn)好酒”，而大曲在曲中表現(xiàn)出優(yōu)良的性能，從大曲中篩選芽孢桿菌并運(yùn)用于曲，更具有研究意義，本研究以前期從高溫大曲中篩選得到的蠟樣芽孢桿菌為研究對(duì)象，檢測(cè)分析蠟樣芽孢桿菌的生產(chǎn)性能，探究蠟樣芽孢桿菌與釀酒酵母共發(fā)酵的效果，以期有效提高白酒品質(zhì)，為中國(guó)白酒釀造機(jī)制提供參考依據(jù)，為微生物相互作用運(yùn)用于釀造工業(yè)生產(chǎn)提供理論背景[9]。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

蠟樣芽孢桿菌：從川南某醬香型白酒廠高溫大曲中分離得到的菌種；釀酒酵母：釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室菌種。

可溶性淀粉、酪素、濃鹽酸、蔗糖、葡萄糖、氫氧化鈉均為分析純，甲醇、正己烷均為色譜純，盧氏碘液，購(gòu)自成都市科龍化工試劑廠；牛肉膏、蛋白胨、酵母浸粉和瓊脂均為生物試劑，購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

儀器設(shè)備：LRH-250 生化培養(yǎng)箱，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；ZHWY-103D 恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；MLS-3020 全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌鍋，北京艾飛博科技有限公司；DZKW-4 水浴鍋，北京市中興偉業(yè)儀器有限公司；7890A-5975B 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Agilent；Sherlock 微生物鑒定系統(tǒng)，美國(guó)MIDI；Scan1200 全自動(dòng)菌落分析儀，上海智理科學(xué)儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化鈉10 g/L，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH7.0，121 ℃滅菌20 min。

液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：土豆200 g/L，葡萄糖20 g/L，牛肉膏1.5 g/L，蛋白胨5 g/L，氯化鈉2.5 g/L，121 ℃滅菌20 min。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：原料按高粱∶麩皮∶水=3∶2∶4配比60 g，接入5 U/g α-淀粉酶，以30 ℃恒溫水浴2 h；淀粉酶液化，接入150 U/g 糖化酶60 ℃恒溫水浴20 h，121 ℃滅菌20 min。

1.2.2 菌種的生理生化和耐受性

菌落形狀確定：分別取兩株菌株于牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基平板涂布，37 ℃恒溫倒置培養(yǎng)24 h，觀察記錄菌落形態(tài)。

生理生化試驗(yàn)：參照鐘小廷等[10-13]《產(chǎn)細(xì)菌素蠟樣芽孢桿菌的篩選、鑒定及培養(yǎng)基優(yōu)化》的步驟及方法，分別對(duì)菌株進(jìn)行革蘭氏染色、糖發(fā)酵試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、乙酰甲基甲醇試驗(yàn)、過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)。

耐受性試驗(yàn)：①制備菌懸液：取0.9%的生理鹽水9 mL，接種稀釋至10-1、10-2、10-3，分別取樣，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，鏡檢，配制濃度梯度為10-7～10-8的菌懸液。②溫度耐受性試驗(yàn)：移取1 mL 菌懸液于細(xì)菌種子液LB 培養(yǎng)基，分別于35 ℃、37 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、60 ℃，在轉(zhuǎn)速170 r/min 搖床中培養(yǎng)24 h，于600 nm下測(cè)定培養(yǎng)液的吸光值，并計(jì)數(shù)；③pH 值耐受性試驗(yàn)：移取1 mL 菌懸液于細(xì)菌種子液LB 培養(yǎng)基，控制溫度為40 ℃，調(diào)節(jié)初始pH 值分別為5.50、6.00、6.50、7.00、7.50、8.00，在轉(zhuǎn)速170 r/min搖床中培養(yǎng)24 h，于600 nm 下測(cè)定培養(yǎng)液的吸光值，并計(jì)數(shù)；④耐乙醇試驗(yàn)：移取1 mL 菌懸液于細(xì)菌種子液LB 培養(yǎng)基，控制溫度為40 ℃，初始pH7.0，調(diào)節(jié)初始乙醇濃度分別為6 %vol、8 %vol、10%vol、12%vol、14%vol、16%vol、18%vol，在轉(zhuǎn)速170 r/min 搖床中培養(yǎng)24 h，于600 nm 下測(cè)定培養(yǎng)液的吸光值，并計(jì)數(shù)。

1.2.3 菌種在液態(tài)發(fā)酵中的相互作用

接種順序?qū)ο灅友挎邨U菌與釀酒酵母混菌發(fā)酵的影響：分別按不同順序接種于液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，37 ℃，150 r/min 搖床中培養(yǎng)2 d，并計(jì)數(shù)[14-15]。接入時(shí)間對(duì)蠟樣芽孢桿菌與釀酒酵母共發(fā)酵的影響：分別以0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h的時(shí)隔接入液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，37 ℃、150 r/min搖床中恒溫培養(yǎng)2 d，并計(jì)數(shù)。全程均無(wú)菌操作，所有試驗(yàn)均做3 個(gè)平行試驗(yàn)。

1.2.4 菌種固態(tài)發(fā)酵對(duì)比研究

固態(tài)單發(fā)酵：取B-1、B-2 蠟樣芽孢桿菌1×107CFU/mL 11 mL 于不同固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37 ℃下發(fā)酵20 d。固態(tài)共發(fā)酵：先接入B-1、B-2蠟樣芽孢桿菌1×107CFU/mL 11 mL 于不同固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 h 后，分別接入釀酒酵母1×107CFU/mL 11 mL，在37 ℃下發(fā)酵20 d。空白：接入空白細(xì)菌種子液LB 培養(yǎng)基11 mL，空白土豆培養(yǎng)基11 mL，在37 ℃下發(fā)酵20 d。

1.2.5 發(fā)酵產(chǎn)物風(fēng)味分析

樣品前處理：稱(chēng)取3 g 固態(tài)發(fā)酵樣品于頂空瓶中，將頂空瓶放入全自動(dòng)固相微萃取儀中，于55 ℃平衡10 min，萃取30 min。氣相色譜條件：DBWAX 60.0 m×0.25 mm×0.25 μm 毛細(xì)管色譜柱；進(jìn)樣口溫度230 ℃；分流比20∶1；程序升溫：50 ℃保持3 min，以5 ℃/min 升至150 ℃，保持2 min，再以10 ℃/min 升至230 ℃，保持2 min，載氣：99.999 %氦氣，載氣流速：1 mL/min。質(zhì)譜條件：電離電壓70 eV，離子源溫度為230 ℃，四極桿溫度為150 ℃，電離方式為EI，全掃描。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

通過(guò)固相微萃取氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法（HSSPME-GC-MS）檢測(cè)分析蠟樣芽孢桿菌與釀酒酵母混菌發(fā)酵產(chǎn)物，采用NIST8.0 譜庫(kù)檢索分析風(fēng)味物質(zhì)成分；利用SPSS 軟件進(jìn)行方差分析，數(shù)值以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 蠟樣芽孢桿菌的形態(tài)和生理特性

從形態(tài)分類(lèi)結(jié)果分析（圖1），B-1 號(hào)菌株單菌落為白色，直徑為1～3 mm，邊緣不光滑，不透明，菌落比較干燥，易挑取，且挑起無(wú)黏性；B-2 號(hào)菌株單菌落為白色泛紅色，直徑為1 mm，菌落扁平，較干燥，易挑取，且挑起無(wú)黏性。兩株菌均為革蘭氏陽(yáng)性菌，菌株均能利用葡萄糖以及蔗糖產(chǎn)酸，且產(chǎn)過(guò)氧化氫酶和淀粉酶（表1）。

圖1 蠟樣芽孢桿菌菌落形態(tài)和革蘭氏染色鏡檢圖（10×100）

表1 蠟樣芽孢桿菌生理生化鑒定結(jié)果

2.2 蠟樣芽孢桿菌的耐受性

培養(yǎng)條件影響細(xì)菌的生長(zhǎng)、代謝活動(dòng)，適宜的培養(yǎng)環(huán)境能使菌株生長(zhǎng)情況良好，有利于發(fā)揮其生產(chǎn)性能。適宜的溫度能使細(xì)菌有效地吸收培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分，也同時(shí)影響菌株的應(yīng)激性[14]。蠟樣芽孢桿菌的生長(zhǎng)、代謝不僅可能會(huì)產(chǎn)生酸類(lèi)物質(zhì)，改變環(huán)境酸度，而且不適宜的外部酸度環(huán)境也對(duì)其活性有調(diào)控作用，導(dǎo)致其生長(zhǎng)及代謝異常[17]，同時(shí)，高濃度的乙醇是一個(gè)典型的極端條件，更高的乙醇耐受性有助于蠟樣芽孢桿菌運(yùn)用于實(shí)際釀造生產(chǎn)[18]。不同培養(yǎng)溫度對(duì)菌株的影響結(jié)果見(jiàn)表2，不同初始pH值對(duì)蠟樣芽孢桿菌的影響結(jié)果見(jiàn)表3，不同初始乙醇濃度對(duì)菌株的影響結(jié)果見(jiàn)表4。

表2 不同培養(yǎng)溫度對(duì)蠟樣芽孢桿菌的影響

兩株菌的最適生長(zhǎng)溫度為37 ℃左右，最高耐受溫度為65 ℃，熱耐受性情況基本相同，過(guò)高的培養(yǎng)溫度會(huì)降低菌株的存活率，故蠟樣芽孢桿菌的培養(yǎng)溫度應(yīng)控制在37～40 ℃為宜。

表3 不同初始pH值對(duì)蠟樣芽孢桿菌的影響

當(dāng)生長(zhǎng)環(huán)境趨近中性條件時(shí)，B-1、B-2均能有較好的長(zhǎng)勢(shì)，芽孢桿菌在中性的環(huán)境下能實(shí)現(xiàn)生物量的最大富集。故控制B-1、B-2 菌株在中性或弱酸性條件下生長(zhǎng)有助于提高其生產(chǎn)性能。

表4 不同初始乙醇濃度對(duì)菌株的影響

B-1 菌株在較高的乙醇濃度下仍然生長(zhǎng)良好（最大耐受濃度為16 %vol），較B-2 菌株表現(xiàn)出更高的乙醇耐受性（最大耐受濃度為14 %vol），同種菌內(nèi)在生理特性差異會(huì)在一定程度上表現(xiàn)出不同的脅迫表征，致使在相同的釀造條件下，B-1 菌株表現(xiàn)出更優(yōu)良的生產(chǎn)性能。

2.3 菌種的相互作用

液態(tài)發(fā)酵適應(yīng)現(xiàn)代化工業(yè)生產(chǎn)，原料適應(yīng)性強(qiáng)、輔料用量少，且能極大地改善勞動(dòng)、生產(chǎn)環(huán)境[17]，模擬蠟樣芽孢桿菌與釀酒酵母液態(tài)混菌發(fā)酵環(huán)境能一定程度體現(xiàn)其實(shí)際生產(chǎn)價(jià)值。發(fā)酵過(guò)程中，不同的接種順序以及接種時(shí)間會(huì)影響菌株的營(yíng)養(yǎng)利用情況，從而影響菌株代謝，不同的接種順序、接種時(shí)間對(duì)液態(tài)共發(fā)酵影響分別見(jiàn)圖2、圖3。

圖2 不同接種順序?qū)N數(shù)量影響

由圖2 可知，先接入釀酒酵母，后接入蠟樣芽孢桿菌的接種順序可使蠟樣芽孢桿菌數(shù)量與釀酒酵母較為接近，B-1 菌株接種情況整體較B-2 菌株略好?；炀l(fā)酵相較于單獨(dú)酵母培養(yǎng)，雖然蠟樣芽孢桿菌數(shù)量相對(duì)減少，但仍處于一個(gè)數(shù)量級(jí)，這是由于釀酒酵母的發(fā)酵過(guò)程會(huì)產(chǎn)酸，致使發(fā)酵環(huán)境處于酸性條件，從而抑制了適合于中性生長(zhǎng)環(huán)境的B-1、B-2 蠟樣芽孢桿菌的生長(zhǎng)；編號(hào)4 中酵母菌數(shù)量極少，蠟樣芽孢桿菌在此培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)較快，成為優(yōu)勢(shì)菌種，吸收了釀酒酵母生長(zhǎng)代謝所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，抑制了釀酒酵母的生長(zhǎng)；編號(hào)5 釀酒酵母與蠟樣芽孢桿菌相差一個(gè)數(shù)量級(jí)，可能為同等環(huán)境下，蠟樣芽孢桿菌相較于釀酒酵母優(yōu)先進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，優(yōu)先獲取發(fā)酵液中營(yíng)養(yǎng)，故長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)于釀酒酵母，但混菌發(fā)酵的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)受限，相較于編號(hào)2 數(shù)量更少。綜合上述結(jié)果：編號(hào)3 即先接入釀酒酵母，后接入蠟樣芽孢桿菌的接種順序更有助于蠟樣芽孢桿菌與釀酒酵母共混菌酵，利于實(shí)際生產(chǎn)。

兩株菌生長(zhǎng)情況差異較小，先接釀酒酵母，時(shí)隔4 h 接入蠟樣芽孢桿菌的接種方式可使蠟樣芽孢桿菌數(shù)量級(jí)與釀酒酵母數(shù)量級(jí)最為接近。在時(shí)隔少于4 h 接入蠟樣芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，蠟樣芽孢桿菌數(shù)量遠(yuǎn)大于釀酒酵母，分析其原因，蠟樣芽孢桿菌的生長(zhǎng)周期較短，生長(zhǎng)4 h 左右便進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，消耗了釀酒酵母代謝所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，隨著接種時(shí)隔繼續(xù)延長(zhǎng)，酵母抑制蠟樣芽孢桿菌的生長(zhǎng)，成為優(yōu)勢(shì)菌株，可能是酵母代謝產(chǎn)物的積累對(duì)蠟樣芽孢桿菌有抑制作用。綜合上述結(jié)果，接入蠟樣芽孢桿菌后，最適接入釀酒酵母時(shí)間為4 h。

圖3 不同接種時(shí)間對(duì)菌種數(shù)量影響

2.4 混合固態(tài)發(fā)酵的代謝產(chǎn)物分析

固態(tài)發(fā)酵法是生產(chǎn)大曲酒應(yīng)用最廣泛的釀造方法之一，其法有增糧香、改善酒質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)。故本研究模擬固態(tài)釀造環(huán)境，利用HS-SPME-GC-MS對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行風(fēng)味物質(zhì)成分鑒定[19-21]，探索兩株蠟樣芽孢桿菌與釀酒酵母混菌發(fā)酵的代謝性能，各香味成分鑒定結(jié)果見(jiàn)表5。

由表5 可知，混菌發(fā)酵相較于單菌發(fā)酵，共新增27 種風(fēng)味物質(zhì)，醇類(lèi)、酯類(lèi)、酚類(lèi)、酸類(lèi)、醛酮類(lèi)、雜環(huán)類(lèi)及烷烴類(lèi)化合等風(fēng)味物質(zhì)均有所增加，特別是醇類(lèi)及酯類(lèi)物質(zhì)產(chǎn)量有較大提高。丙二醇、苯乙醇在單菌發(fā)酵中均未檢測(cè)到，而B(niǎo)-1、B-2 混菌發(fā)酵的苯乙醇產(chǎn)量分別達(dá)12.86 mg/kg、13.71 mg/kg，對(duì)促進(jìn)形成酒體風(fēng)味、促使酒體豐滿(mǎn)、濃厚起著重要的作用；單菌發(fā)酵產(chǎn)酯類(lèi)較少，其中辛酸乙酯、α-戊基-γ-丁內(nèi)酯、苯乙酸乙酯、丙位辛內(nèi)酯均只產(chǎn)生在混菌發(fā)酵中，酯類(lèi)具有增香作用，混菌發(fā)酵可促使酒體呈香多樣性上升，放香更為飽滿(mǎn)協(xié)調(diào)。酚類(lèi)物質(zhì)如愈創(chuàng)木酚主要呈現(xiàn)出煙熏風(fēng)味，為醬香型白酒的重要香味成分，具有良好的抗氧化活性，B-1 單菌發(fā)酵愈創(chuàng)木酚含量為2.5 mg/kg，B-2 單菌發(fā)酵愈創(chuàng)木酚含量為4.20 mg/kg，而混菌發(fā)酵產(chǎn)量分別提升至4.6 mg/kg，5.30 mg/kg，增香效果顯著。在酸類(lèi)方面，產(chǎn)乙酸能力混菌發(fā)酵表現(xiàn)為協(xié)同作用，其中B-1 從不產(chǎn)乙酸到產(chǎn)量提升為13.90 mg/kg，B-2 混菌發(fā)酵也更有益于乙酸的生成，酸類(lèi)物質(zhì)在白酒風(fēng)味中起調(diào)和、烘托作用，使酒體口感更為醇和。雜環(huán)類(lèi)化合物主要產(chǎn)物為2,3-二甲基吡嗪，2,3,5-三甲基吡嗪等吡嗪類(lèi)物質(zhì)，B-1 菌株共發(fā)酵菌株產(chǎn)量由8.5 mg/kg 提高至16.40 mg/kg，B-1 與釀酒酵母混菌發(fā)酵表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢(shì)，B-2 菌株則表現(xiàn)出更良好的生產(chǎn)性能，B-1 混菌發(fā)酵與單菌發(fā)酵相比，新產(chǎn)生了2,3-二甲基-5-乙基吡嗪等風(fēng)味物質(zhì)，且四甲基吡嗪含量有較大提升，其具有擴(kuò)張血管，改善血循環(huán)、護(hù)肝等功效，為白酒中的健康風(fēng)味成分[22-23]。固態(tài)發(fā)酵環(huán)境下，混菌發(fā)酵表現(xiàn)出更好的協(xié)同作用，促進(jìn)了乙酸乙酯、乙酸、2,3-二甲基-5-乙基吡嗪、麥芽醇、1-十五炔等27 種風(fēng)味物質(zhì)的生成，其中醇類(lèi)、酯類(lèi)、吡嗪類(lèi)物質(zhì)所占比例較大，可有效增加風(fēng)味成分豐富度，凸顯酒體主要呈香，使放香更為飽滿(mǎn)協(xié)調(diào)。愈創(chuàng)木酚、四甲基吡嗪等有益風(fēng)味成分的提升在改善酒質(zhì)，發(fā)掘其藥理作用方面具有積極影響。

3 結(jié)論

本研究是從川南某醬香型白酒廠高溫大曲中分離得到兩株蠟樣芽孢桿菌，檢測(cè)分析蠟樣芽孢桿菌與釀酒酵母生產(chǎn)性能，并模擬液態(tài)和固態(tài)發(fā)酵環(huán)境，探索混菌發(fā)酵與單菌發(fā)酵差異，為混菌發(fā)酵運(yùn)用于釀造生產(chǎn)提供理論參考。其中蠟樣芽孢桿菌對(duì)釀酒酵母的生長(zhǎng)有一定的抑制作用，但通過(guò)調(diào)節(jié)添加方式可以削弱這種抑制效應(yīng)。蠟樣芽孢桿菌和釀酒酵母協(xié)同固態(tài)發(fā)酵能夠促進(jìn)乙酸乙酯、乙酸、苯乙醇、2,3-二甲基-5-乙基吡嗪、麥芽醇、1-十五炔等27 種風(fēng)味物質(zhì)的生成，特別是能提高愈創(chuàng)木酚、四甲基吡嗪等有益風(fēng)味成分產(chǎn)量，這將有利于改善白酒酒質(zhì)，同時(shí)能發(fā)掘其藥理作用方面具有積極影響。

表5 混菌發(fā)酵與單菌發(fā)酵香味成分分析鑒定結(jié)果 (mg/kg)