□ 王海云

（馬鞍山師范高等專(zhuān)科學(xué)校，安徽 馬鞍山 243000）

目前植物活性成分的研究和天然產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)利用一直是食品行業(yè)研究的熱點(diǎn)。而紫蘇屬于唇形科紫蘇屬草本植物[1]，易于種植，在我國(guó)有著悠久的種植歷史，是國(guó)家衛(wèi)生部首批的60種藥食同源的植物之一[2]，其含有豐富的酚類(lèi)，被認(rèn)為是優(yōu)質(zhì)抗氧化物質(zhì)。目前對(duì)紫蘇的研究主要集中于其揮發(fā)油組成和含量測(cè)定，以及測(cè)定迷迭香酸和黃酮含量測(cè)定，提取方法的優(yōu)化也是基于提高迷迭香酸和黃酮含量，針對(duì)不同熱加工條件對(duì)紫蘇葉抗氧化活性及總酚含量影響的研究相對(duì)較少?？紤]到紫蘇葉中含有許總酚類(lèi)物質(zhì)，在熱加工條件下容易分解或揮發(fā)損失，而超聲波能夠在較低溫度下加快提取，保證物質(zhì)的穩(wěn)定。本試驗(yàn)抗氧化活性的測(cè)定采用超聲波提取法，以總酚、自由基清除率作為衡量指標(biāo)，以研究不同的熱加工條件對(duì)紫蘇提取物抗氧化活性及總酚含量的影響。在此基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)還比較了不同紫蘇樣品在相同提取方法下的總酚提取率，為紫蘇熱加工方式和加工條件的選擇提供理論基礎(chǔ)，對(duì)研究利用紫蘇總酚類(lèi)物質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、生理功能及人體健康的影響有一定指導(dǎo)意義。

一、材料與方法

（一）材料與試劑

新鮮的紫蘇葉、干紫蘇籽購(gòu)于黑龍江省。

福林酚，北京索萊寶科技有限公司；沒(méi)食子酸、亞硝酸鈉、無(wú)水乙醇，碳酸氫鈉，江陰市化學(xué)試劑有限公司；過(guò)硫酸鉀、ABTS，上海市拉丁生化科技股份有限公司，以上均為分析純。

（二）儀器與設(shè)備

SV105VE型超低溫冰箱、粉碎機(jī)、Modell680型酶標(biāo)儀、烘箱、Centrifuge5810R型臺(tái)式冷凍離心機(jī)、分析天平、SB-100DTN型超聲波清洗器、SBH130D/3型干浴器、df-101s恒溫磁力攪拌器、J09601型96孔全白酶標(biāo)板。

（三）方法

1. 酚類(lèi)物質(zhì)的提取

將新鮮的紫蘇葉、干紫蘇籽烘干磨碎，兩種樣本分別稱(chēng)取兩克，按照料液比1:20加入40mL70%乙醇，50℃超聲波輔助提取30min，在4500rpm離心15min，取上清液后，同樣方法再次提取殘?jiān)鼉纱?，合并提取液，加入提取溶劑?0ml，用于總酚及抗氧化能力的測(cè)定。

2. 總酚的測(cè)定

總酚的測(cè)定采用福林酚法，在此基礎(chǔ)上略加修改，具體方法如下：

（一）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

精確稱(chēng)量5 m g 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，用7 0%乙醇溶解，定容到50mL容量瓶，配制濃度為0.1mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液，-20℃低溫避光保存。移取標(biāo)準(zhǔn)沒(méi)食子酸溶液1ml，加入0.5 ml福林酚試劑、2ml10%碳酸鈉溶液，定容至10ml，室溫條件暗處放置2h。在500-800nm進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，確定最佳檢測(cè)波長(zhǎng)。取0.1mg/ml的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，配置0.02 mg/ml、0.04mg/ml、0.06mg/ml、0.08mg/ml、0.1mg/ml0的沒(méi)食子酸溶液。取不同濃度沒(méi)食子酸溶液1ml，按上述方法在最佳吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線得標(biāo)準(zhǔn)回歸方程。

（二）樣品總酚的測(cè)定

按照上述標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定方法，移取200μL反應(yīng)液打入96孔全白酶標(biāo)板，將載有反應(yīng)液的96孔全白酶標(biāo)板放入多功能微孔板讀數(shù)儀在660nm處測(cè)吸光度值。使用上述標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算提取液中相應(yīng)的總酚含量，進(jìn)行三次平行試驗(yàn)。按照下面公式進(jìn)行換算（總酚含量以沒(méi)食子酸當(dāng)量示）：W =（C×V×N）/M

3. ABTS自由基清除能力的測(cè)定

利用ABTS+清除能力指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)樣品的總抗氧化能力，采用參考文獻(xiàn)（Pellegrini et ah 1999[3]）的方法，并進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整。

（一）配制ABTS+ 儲(chǔ)備液

同體積的7mM的ABTS+與4.9mM的過(guò)硫酸鉀混合，將混合液放置在黑暗的室溫條件下反應(yīng)16h。測(cè)定前，將上述混合液用無(wú)水乙醇稀釋直至用比色皿在波長(zhǎng)734nm處測(cè)得其吸光度為0.7左右。

（二）樣品ABTS+ 自由基清除能力測(cè)定

先將樣品用超純水稀釋至適當(dāng)濃度，在0.1mL樣品稀釋液中加入ABTS+工作液3.9mL，以去超純水為參比溶液，吸取200μL反應(yīng)液吹入96孔全白酶標(biāo)板，將載有反應(yīng)液的96孔全白酶標(biāo)板放入多功能微孔板讀數(shù)儀在734 nm處測(cè)吸光度值。每個(gè)樣品進(jìn)行三次平行試驗(yàn)。按照下面公式計(jì)算樣品對(duì)ABTS+自由基的清除率。

S =1- (A1/A2)×100%

公式中 A1—測(cè)定的某濃度的樣品吸光度值

A2—用相同體積的無(wú)水乙醇代替上述樣品測(cè)定吸光度值

4. 紫蘇樣品熱處理

將提取后的紫蘇樣品注入玻璃試管中，加蓋子在干浴器進(jìn)行熱處理。熱處理的溫度分別為：60℃、80℃、100℃、120℃、140℃。熱處理的時(shí)間分別為：5min、10min、15min、20min。

（四）統(tǒng)計(jì)分析

采用鄧肯式多重比較方法，用prism8軟件作圖。

二、結(jié)果與分析

（一）不同提取次數(shù)對(duì)紫蘇葉和紫蘇籽總酚含量的影響

圖2-1可以得出，相同提取方法紫蘇葉和紫蘇籽中總酚含量差異顯著。三次提取中，紫蘇葉與紫蘇籽總酚含量均呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，紫蘇葉總酚含量始終高于紫蘇籽。

（二）不同提取次數(shù)對(duì)紫蘇葉和紫蘇籽總酚提取率的影響

圖2-2可以看出在三次提取中，紫蘇葉的提取率依次下降，第一次紫蘇葉提取率為44.65%達(dá)到最高，第二次紫蘇葉提取率是第一次提取的0.7倍；第三次紫蘇葉提取率最低為18.09%。紫蘇葉的第三次總酚提取率相比第二次的提取率顯著降低。在三次提取中，紫蘇籽的提取率也依次下降，第一次紫蘇籽提取率為19.92%達(dá)到最高，第二次紫蘇籽提取率是第一次提取的0.7倍；第三次紫蘇籽提取率最低為4.98%。紫蘇籽的第三次總酚提取率相比前兩次的提取率都有顯著降低。在三次提取中，紫蘇葉的總酚提取率均高于紫蘇籽。有研究表明[4]，紫蘇葉的最佳提取條件為70%的乙醇溶液，超聲時(shí)間為30.52min，溫度為50℃。在最佳條件下，紫蘇籽的平均提取率約為45.49%，與本實(shí)驗(yàn)紫蘇葉第一次提取的提取率偏差0.84%，而紫蘇籽的最佳提取條件為70%的乙醇溶液，超聲時(shí)間為35.66min，溫度為58.82℃，在最佳條件下，紫蘇籽的平均提取率約為23.67%，與本實(shí)驗(yàn)紫蘇籽第一次提取的提取率偏差2.75%，本實(shí)驗(yàn)提取條件與紫蘇葉的最佳提取條件更加吻合，因此在三次提取中紫蘇葉的總酚提取率均高于紫蘇籽。

（三）不同熱加工條件對(duì)紫蘇總酚含量的影響

從圖2-3中可以看出，在整個(gè)加熱過(guò)程中，紫蘇提取物的總酚含量隨加熱時(shí)間的延長(zhǎng)、溫度的升高呈下降趨勢(shì)。未經(jīng)加工的紫蘇提取物中總酚含量為2.2325mg/g。在加熱相同時(shí)間的條件下，隨著加熱溫度的升高（60℃、80℃、100℃、120℃），紫蘇提取物總酚含量連續(xù)降低。加熱溫度為60℃時(shí)，隨著加熱時(shí)間從0min到20min，總酚含量始終呈下降趨勢(shì)。其中15-20min下降最為明顯，下降了0.269mg/g。紫蘇葉樣品在60℃加熱時(shí)，隨著時(shí)間延長(zhǎng)總酚含量和自由基清除率下降，其中5min最高，20min最低，與未加熱對(duì)比，幾乎不存在顯著差異。加熱溫度為80℃時(shí)，隨著加熱時(shí)間從0min到20min，總酚含量也連續(xù)下降。其中15-20min下降最為明顯，下降了0.2224mg/g，與未加熱對(duì)比，和5min間存在顯著差異。加熱溫度為100℃時(shí)，隨著加熱時(shí)間從0min到20min延長(zhǎng)，總酚含量連續(xù)下降。其中15-20min下降較不明顯為0.0405mg/g，與未加熱對(duì)比，和5min、10min間存在顯著差異。加熱溫度為120℃時(shí)，隨著加熱時(shí)間從0min到20min延長(zhǎng)，總酚含量連續(xù)下降，但變化趨勢(shì)相比60、80、100℃較不明顯與未加熱對(duì)比，和5min、10min間存在顯著差異。在0-5min內(nèi)隨著加熱溫度的升高，總酚含量降低的最為明顯，分別降低了0.0736、0.3406、0.4844、0.6463mg/g。加熱20min時(shí)，隨著加熱溫度的升高，總酚物質(zhì)含量有少量的降低。本研究表明，熱處理對(duì)紫蘇總酚的影響是隨著加熱溫度升高、加熱時(shí)間延長(zhǎng)，紫蘇總酚含量呈下降趨勢(shì)。另一可能的原因是由于酶促褐變反應(yīng)造成了酚類(lèi)物質(zhì)含量的下降。還有一種原因可能是紫蘇中的酚類(lèi)物質(zhì)主要以游離態(tài)形式存在，研究表明游離態(tài)酚類(lèi)物質(zhì)隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)、加熱溫度的升高呈下降的趨勢(shì)顯著，而結(jié)合態(tài)的酚類(lèi)物質(zhì)其含量的變化規(guī)律不明顯，因此總體呈下降趨勢(shì)。在熱加工過(guò)程中，應(yīng)盡可能避免因蒸煮、油炸等需要耗費(fèi)長(zhǎng)時(shí)間處理導(dǎo)致的加熱處理過(guò)長(zhǎng)而造成酚類(lèi)物質(zhì)損失。

（四）不同熱加工條件對(duì)紫蘇總酚抗氧化性的影響

從圖2-4中可以看出，在整個(gè)加熱過(guò)程中，紫蘇提取物的ABTS自由基清除能力隨加熱溫度的升高呈下降趨勢(shì)。未經(jīng)加工處理的紫蘇提取物的ABTS自由基清除率最高，其值為65.02%。在加熱相同時(shí)間的條件下，隨著加熱溫度的升高（60℃、80℃、100℃、120℃、140℃），紫蘇提取物ABTS自由基清除率連續(xù)降低。樣品在140℃加熱20min時(shí)的ABTS+清除能力最低為39.04%，其值約為原始提取物的0.6。在同一加熱溫度下，加熱時(shí)間為0min-20min時(shí)，自由基清除能力變化極顯著。在加熱5min時(shí)，60℃自由基清除率存在顯著差異，加熱10min、15min、20min是同樣趨勢(shì)。

本研究結(jié)果表明紫蘇經(jīng)過(guò)熱加工后，ABTS自由基清除能力有明顯下降的趨勢(shì)。ABTS自由基清除率變化趨勢(shì)與總酚含量的變化趨勢(shì)相似，因此熱加工過(guò)程中影響抗氧化活性改變的因素可能是酚類(lèi)物質(zhì)的含量的下降，使抗氧化能力降低。推測(cè)降低的原因：①酚類(lèi)物質(zhì)在熱加工過(guò)程當(dāng)中發(fā)生熱分解、氧化或著聚合反應(yīng)；②樣品中大分子總酚解離；③樣品中酚類(lèi)物質(zhì)在溶劑中發(fā)生自溶；④酚類(lèi)物質(zhì)與蛋白質(zhì)等大分子產(chǎn)生交聯(lián)結(jié)構(gòu)[5]。

三、結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)紫蘇葉、紫蘇籽的提取率進(jìn)行了比較，并對(duì)不同熱加工條件下的紫蘇葉粗提物的總酚含量及抗氧化能力變化進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在相同條件下紫蘇葉的總酚提取率均高于紫蘇籽，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)、溫度的升高，紫蘇中的酚類(lèi)物質(zhì)含量逐漸降低，抗氧化能力有一定程度降低。