賈艷艷，李 琦，王曉利，?？≥x，毛 靜，廖成水，張昊愷，張明亮,3

(1.河南科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院/洛陽市活載體生物材料與動(dòng)物疫病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 洛陽 471023；2.河南科技大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，河南 洛陽 471023； 3．安陽工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，河南 安陽 455000)

隨著毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，因管理不當(dāng)、生物安全措施弱等原因致使毛皮動(dòng)物疫病發(fā)生率提高，死亡率可達(dá)10%～20%，給毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)帶來了較大的經(jīng)濟(jì)損失，影響了我國毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。毛皮動(dòng)物疾病中因肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)引起的疾病越來越多[1]，2012—2013年，山東省毛皮動(dòng)物(狐、水貂、貉)肺炎克雷伯菌感染率高達(dá)37.58%[2]。

肺炎克雷伯菌是一類革蘭氏陰性桿菌，也是人獸共患條件致病菌[3-4]。該菌常存在于人類、動(dòng)物的呼吸道和腸道中，也廣泛存在于自然界土壤和水中，引發(fā)人和動(dòng)物子宮內(nèi)膜炎、肺炎、化膿性腦膜炎及泌尿道炎癥等疾病。現(xiàn)已從水貂、魚類、禽類、豬、牛等多種動(dòng)物體內(nèi)分離到這種細(xì)菌，發(fā)病率及死亡率極高[5-6]。

細(xì)菌分泌系統(tǒng)將分泌性蛋白質(zhì)或毒素轉(zhuǎn)運(yùn)到胞外是細(xì)菌實(shí)現(xiàn)致病性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。胞外分泌蛋白包含許多種酶類物質(zhì)，如核酸酶、膠原酶、蛋白酶、幾丁質(zhì)酶和透明質(zhì)酸酶等[7]。微生物胞外蛋白核酸酶在細(xì)菌和宿主之間的相互作用過程中發(fā)揮重要作用[8-9]。病原體感染宿主細(xì)胞的過程中，DNA和RNA可被核酸酶水解消化成寡核苷酸，以此作為微生物生存的營養(yǎng)物質(zhì)。同時(shí)，胞外核酸酶可降解宿主細(xì)胞表面的黏性分泌物，使得細(xì)菌更容易黏附到細(xì)胞表面，有助于細(xì)菌感染宿主[10]。因此，致病性病原體的胞外核酸酶是一種重要的毒力因子[11-12]。探究細(xì)菌胞外核酸酶有助于揭示微生物病原體的致病機(jī)制，但目前尚未見關(guān)于肺炎克雷伯菌胞外分泌蛋白核酸酶活性研究的報(bào)道。為此，對(duì)河南某養(yǎng)殖場患肺炎的水貂死亡病例進(jìn)行細(xì)菌的分離鑒定，并對(duì)分離菌株進(jìn)行胞外分泌蛋白提取，研究其胞外分泌蛋白的核酸酶活性，以期為進(jìn)一步研究肺炎克雷伯菌的致病性奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試劑

胰蛋白胨、酵母浸出物等購自英國OXOID公司；瓊脂粉購自博奧森生物股份有限公司；λDNA和BCA蛋白質(zhì)定量分析試劑盒均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；瓊脂糖、核酸染料、氯化鈉等購自北京索萊寶科技有限公司；DNase Ⅰ購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 病原菌的分離

無菌采集患肺炎水貂的淋巴結(jié)、腎臟、脾臟、肝臟、肺臟病料樣品，劃線接種于西蒙式枸櫞酸鹽瓊脂培養(yǎng)基(SCA)平板上，置于37 ℃培養(yǎng)16～24 h，觀察細(xì)菌生長狀況。

1.3 病原菌的鑒定

挑取純培養(yǎng)單菌落，制備菌懸液，利用肺炎克雷伯菌的16S rRNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測。反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 5.0 μL、dNTP(2.5 μmol/L)4.0 μL、上下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL、模板1.0 μL、TaqDNA聚合酶(5 U/μL) 0.5 μL,補(bǔ)去離子水至50 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性50 s，57 ℃退火50 s;72 ℃延伸50 s，30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取5～8 μL PCR產(chǎn)物用10 g/L的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。

1.4 肺炎克雷伯菌胞外分泌蛋白的收集

將肺炎克雷伯菌劃線接種于LB固體平板，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后挑取單個(gè)菌落于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃條件下 180 r/min振蕩培養(yǎng)18 h。將培養(yǎng)液按1∶10比例接種于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃條件下 180 r/min振蕩培養(yǎng)6 h,離心收取上清液。利用透析袋多次透析收集胞外分泌蛋白，經(jīng)BCA蛋白質(zhì)定量分析法測定蛋白質(zhì)濃度，置-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 胞外分泌蛋白核酸酶活性的測定

按下列參數(shù)配制肺炎克雷伯菌胞外分泌蛋白降解DNA的50 μL酶切體系：磷酸鹽緩沖液(1 L中含量分別為NaCl 7.9 g、KCl 0.2 g、Na2HPO41.44 g、K2HPO41.8 g)5 μL、λDNA(0.1 g/L)1 μL、肺炎克雷伯菌胞外分泌蛋白5 μL，補(bǔ)充ddH2O至總體積為50 μL。于37 ℃水浴鍋中進(jìn)行酶切反應(yīng)，利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析酶切情況。

1.6 溫度對(duì)胞外蛋白核酸酶活性影響的測定

按照1.5中的方法觀察溫度對(duì)肺炎克雷伯菌胞外分泌蛋白降解λDNA的影響，溫度設(shè)置4、16、25、30、37、42、50、60 ℃。同時(shí)，按照同樣方法檢測胞外分泌蛋白核酸酶活性的熱穩(wěn)定性，胞外分泌蛋白分別經(jīng)65、70、75、80 ℃預(yù)處理20 min，并保持其他參數(shù)不變，凝膠成像系統(tǒng)分析酶切變化情況。

1.7 pH值對(duì)胞外分泌蛋白核酸酶活性影響的測定

按照1.5中的方法觀察pH值對(duì)肺炎克雷伯菌胞外分泌蛋白降解λDNA的影響，pH值設(shè)置3.0(乙酸鹽緩沖液)、4.0(甲苯酸鹽緩沖液)、5.0(醋酸鹽緩沖液)、6.0(檸檬酸鹽緩沖液)、7.0(磷酸鹽緩沖液)、8.0(Tris緩沖液)、9.0(硼酸鹽緩沖液)和10.0(甘氨酸緩沖液)，并保持其他參數(shù)不變，凝膠成像系統(tǒng)分析酶切變化情況。

1.8 金屬離子對(duì)胞外分泌蛋白核酸酶活性影響的測定

按照1.5中的方法觀察金屬離子(Na+、K+、Zn2+、Co2+、Mn2+、Ba2+、Ca2+、Cu2+、Fe3+、Mg2+和Ni2+)對(duì)肺炎克雷伯菌胞外分泌蛋白降解λDNA的影響，配制含終濃度分別為0.01、0.10、1.00、5.00、10.00 mmol/L金屬離子的50 μL反應(yīng)體系，并保持其他參數(shù)不變，凝膠成像系統(tǒng)分析酶切變化情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離與鑒定

無菌取患肺炎死亡水貂的淋巴結(jié)、腎臟、脾臟、肝臟、肺臟等樣品進(jìn)行細(xì)菌分離，經(jīng)純化得到1株菌株。分離菌株在西蒙式枸櫞酸鹽瓊脂培養(yǎng)基(SCA)上形成較小的藍(lán)色菌落，顯微鏡觀察分離菌為兩極濃染的革蘭氏陰性粗短桿菌。對(duì)菌落進(jìn)行16S rRNA PCR擴(kuò)增(圖1)，經(jīng)鑒定為肺炎克雷伯菌。

M：DL2000 Marker；1：目的基因；2：陰性對(duì)照M:DL2000 Marker;1:Objective gene; 2:Negative control圖1 肺炎克雷伯菌的PCR鑒定Fig.1 PCR indentification of Klebsiella pneumoniae

2.2 胞外分泌蛋白的核酸酶活性

為測定肺炎克雷伯菌胞外分泌蛋白的核酸酶活性，瓊脂糖凝膠電泳觀察不同濃度的胞外分泌蛋白降解λDNA情況。結(jié)果顯示，DNase Ⅰ陽性對(duì)照組的λDNA完全被降解，胞外分泌蛋白與λDNA孵育后同樣表現(xiàn)出降解現(xiàn)象，1 g/L的胞外分泌蛋白就可降解λDNA，并且隨著肺炎克雷伯菌胞外分泌蛋白質(zhì)量濃度的增加，λDNA的條帶逐漸變淡，而培養(yǎng)基陰性對(duì)照組的λDNA則未被降解(圖2)?？梢?肺炎克雷伯菌胞外分泌蛋白具有切割DNA的核酸酶活性。

1：λDNA；2：DNase Ⅰ+λDNA；3：培養(yǎng)基+λDNA；4—9：分別為1、2、3、4、5、6 g/L胞外分泌蛋白+λDNA1:λDNA;2:DNase Ⅰ+λDNA;3:Medium+λDNA;4—9:The extracellular proteins with concentration of 1,2,3,4,5,6 g/L +λDNA圖2 胞外分泌蛋白核酸酶活性的測定Fig.2 Determination of the nuclease activity of the extracellular proteins

2.3 溫度對(duì)肺炎克雷伯菌胞外分泌蛋白核酸酶活性的影響

將胞外蛋白和λDNA共孵育，分別在4、16、25、30、37、42、50、60 ℃下進(jìn)行酶切反應(yīng)，然后采用瓊脂糖凝膠電泳檢測溫度對(duì)肺炎克雷伯菌分泌蛋白核酸酶活性的影響。結(jié)果顯示，不同孵育溫度下λDNA均可被胞外分泌蛋白降解，4、16、50、60℃時(shí)胞外分泌蛋白核酸酶的活性稍差，而25、30、37、42 ℃時(shí)胞外分泌蛋白核酸酶的活性較強(qiáng)，且30 ℃和37 ℃時(shí)胞外分泌蛋白具有很強(qiáng)的核酸酶活性(圖3A)。同時(shí)，胞外分泌蛋白的熱穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果顯示，胞外分泌蛋白經(jīng)65 ℃以上溫度處理后處于失活狀態(tài)(圖3B)。以上結(jié)果表明，30～37 ℃是肺炎克雷伯菌胞外分泌蛋白核酸酶活性的最適溫度。

2.4 pH值對(duì)肺炎克雷伯菌胞外分泌蛋白核酸酶活性的影響

將肺炎克雷伯菌胞外分泌蛋白和λDNA共孵育，分別在pH值3.0～10.0環(huán)境下進(jìn)行酶切反應(yīng)，然后采用瓊脂糖凝膠電泳檢測pH值對(duì)肺炎克雷伯菌胞外分泌蛋白核酸酶活性的影響。結(jié)果顯示，不同pH值反應(yīng)環(huán)境下λDNA均可被胞外分泌蛋白降解，pH值為7.0時(shí)胞外分泌蛋白切割λDNA的能力最強(qiáng)，在pH值4.0～7.0的酸性環(huán)境下具有良好的核酸酶活性，而在pH值8.0～10.0的堿性條件下胞外分泌蛋白核酸酶活性較差(圖4)。以上結(jié)果表明，pH值7.0是肺炎克雷伯菌胞外分泌蛋白核酸酶活性的最適pH值。

A:不同反應(yīng)溫度下胞外分泌蛋白核酸酶活性;B:胞外分泌蛋白核酸酶活性的耐熱性檢測A:Activity of extracellular secretory protein nuclease at different reaction temperatures;B:Detection of thermostability of exocrine protein nuclease activity圖3 溫度對(duì)胞外分泌蛋白核酸酶活性的影響Fig.3 Effect of temperature on the nuclease activity of the extracellular proteins

圖4 pH值對(duì)胞外分泌蛋白核酸酶活性的影響Fig.4 Effect of pH value on the nuclease activity of the extracellular proteins

2.5 金屬離子對(duì)肺炎克雷伯菌胞外分泌蛋白核酸酶活性的影響

將胞外分泌蛋白和λDNA共孵育，分別在酶切反應(yīng)體系中添加0.01、0.10、1.00、5.00、10.00 mmol/L的金屬離子(Na+、K+、Zn2+、Co2+、Mn2+、Ba2+、Ca2+、Cu2+、Fe3+、Mg2+和Ni2+)，然后采用瓊脂糖凝膠電泳檢測金屬離子對(duì)肺炎克雷伯菌胞外分泌蛋白降解λDNA的影響(圖5)。結(jié)果顯示，一價(jià)金屬離子方面，0.01～10.00 mmol/L的Na+和K+對(duì)胞外分泌蛋白的核酸酶活性無影響。整體上分析，0.01～10.00 mmol/L的大多數(shù)二價(jià)金屬離子(Ca2+、Ba2+、Ni2+、Zn2+和Cu2+)對(duì)胞外分泌蛋白的核酸酶活性無顯著影響；低濃度(0.01～1.00 mmol/L)的Co2+對(duì)胞外分泌蛋白的核酸酶活性無明顯影響，但高濃度(5.00～10.00 mmol/L)的Co2+可以促進(jìn)胞外核酸酶切割λDNA的活性；0.01～5.00 mmol/L的Mg2+和Mn2+對(duì)胞外分泌蛋白的核酸酶活性無明顯影響，但10.00 mmol/L的Mg2+和Mn2+可以促進(jìn)胞外核酸酶切割λDNA的活性。三價(jià)金屬離子Fe3+在0.01～1.00 mmol/L時(shí)對(duì)胞外分泌蛋白的核酸酶活性無明顯影響，但5.00～10.00 mmol/L的Fe3+可以促進(jìn)胞外核酸酶切割λDNA的活性。

1：λDNA；2.DNase Ⅰ+DNA;3：胞外分泌蛋白+λDNA；4—8：分別為0.01、0.10、1.00、5.00、10.00 mmol/L金屬離子+胞外分泌蛋白+λDNA1:λDNA;2.DNase Ⅰ+DNA;3:The extracellular proteins +λDNA;4—8:The metal ions with concentration of 0.01,0.10,1.00,5.00,10.00 mmol/L + the extracellular proteins +λDNA圖5 金屬離子對(duì)胞外分泌蛋白核酸酶活性的影響Fig.5 Effect of metal ions on the nuclease activity of the extracellular proteins

3 結(jié)論與討論

肺炎克雷伯菌是一種條件致病性的人獸共患病原菌。近幾年，由該菌引起毛皮動(dòng)物(狐貍、水貂及貉)發(fā)病的案例逐漸增多，嚴(yán)重威脅著養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[13-14]。2019年4月，河南某水貂養(yǎng)殖場發(fā)生以采食量下降、呼吸困難為特征的急性傳染病。解剖發(fā)現(xiàn)，病亡水貂氣管內(nèi)輕微出血，肺臟大面積淤血、出血，肺門淋巴結(jié)腫大出血。通過病料涂片鏡檢、病原菌分離純化及PCR鑒定，表明分離菌株為肺炎克雷伯菌，并對(duì)該菌胞外分泌蛋白的核酸酶活性進(jìn)行研究。

病原微生物分泌的胞外蛋白是重要的致病因子之一，常被作為研究病原微生物致病機(jī)制的靶標(biāo)。本研究通過瓊脂糖凝膠電泳法證實(shí)了肺炎克雷伯菌分泌的胞外蛋白具有核酸酶活性，并探究了溫度、金屬離子和pH值對(duì)肺炎克雷伯菌胞外分泌蛋白核酸酶活性的影響。微生物產(chǎn)生的核酸酶通常在pH值介于6.0～10.0時(shí)具有較好活性，尤其在pH值為8.0～8.5時(shí)活性最高[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)，肺炎克雷伯菌胞外分泌蛋白在pH值為7.0的中性條件下核酸酶活性最強(qiáng)，而在pH值3.0～7.0的酸性環(huán)境中胞外蛋白的核酸酶活性較強(qiáng)，說明肺炎克雷伯菌胞外蛋白中含依賴堿性的核酸酶少。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)，肺炎克雷伯菌胞外分泌蛋白在25～42 ℃表現(xiàn)出較好的核酸酶活性，且30～37 ℃是肺炎克雷伯菌胞外分泌蛋白發(fā)揮核酸酶活性的最適溫度，這與文獻(xiàn)報(bào)道的常見微生物胞外核酸酶在35～44 ℃表現(xiàn)出較高活性基本一致[17]。

輔酶、輔基和激活劑等輔助因子是一些酶發(fā)揮活性所需要的非蛋白質(zhì)成分。金屬離子作為激活劑對(duì)酶促反應(yīng)影響的動(dòng)力學(xué)非常復(fù)雜[18]。在酶促反應(yīng)方面，Mg2+、Zn2+、Mn2+和Ca2+等是最常見的二價(jià)金屬離子。一般來說，金屬離子既能增強(qiáng)底物對(duì)序列或結(jié)構(gòu)特異性的核酸酶的親和力，也能直接參與磷酸鍵斷裂的催化作用[12]。Ca2+和Mg2+對(duì)于大多數(shù)核酸酶的活性是必需的[19]。本研究中，一價(jià)金屬離子(Na+和K+)和某些二價(jià)金屬離子(Ca2+、Ba2+、Ni2+、Zn2+和Cu2+)對(duì)肺炎克雷伯菌胞外分泌蛋白的核酸酶活性無明顯影響。一般情況下，適當(dāng)?shù)慕饘匐x子濃度有助于酶促反應(yīng)，但過量的離子濃度反而會(huì)抑制酶反應(yīng)速度。本研究中，5.00～10.00 mmol/L的Co2+和Fe3+以及10.00 mmol/L的Mg2+和Mn2+可以促進(jìn)胞外核酸酶切割λDNA的活性。綜上，肺炎克雷伯菌胞外分泌蛋白可能具有多種核酸酶。

前人研究發(fā)現(xiàn)，病原微生物分泌胞外核酸酶是逃避宿主免疫殺傷的主要途徑之一[20]。本研究也證實(shí)了肺炎克雷伯菌胞外蛋白的核酸酶活性，但推測肺炎克雷伯菌分泌的胞外蛋白可能包含多種核酸酶。基于此，下一步需要對(duì)肺炎克雷伯菌胞外蛋白核酸酶的種類及其特性和功能展開研究，從而有助于揭示胞外核酸酶在肺炎克雷伯菌的致病性和免疫逃逸中的確切作用。