榮 娜，簡思杰，孫 薇，康 超，陳 琛，劉 祥

(陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院 中德天然產(chǎn)物研究所，陜西 漢中 723001)

嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila，A.hydrophila)屬于弧菌科氣單胞菌屬，是導(dǎo)致水生動物感染細菌性疾病的主要病原菌，主要可誘發(fā)魚類感染敗血癥，死亡率高[1-3]，嚴重影響了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟發(fā)展。傳統(tǒng)上的抗生素防治見效快，但存在抗生素殘留及菌株耐藥性等副作用[4]。疫苗免疫因其無毒害、安全性高而備受關(guān)注，但目前應(yīng)用于商業(yè)養(yǎng)殖的滅活疫苗免疫效果不穩(wěn)定，且存在二次感染風險[5-6]。因此，有必要研制有效防治嗜水氣單胞菌的新型疫苗。而亞單位疫苗以純化的蛋白質(zhì)、多糖或核酸等免疫活性片段作為組分，安全穩(wěn)定且免疫持久[7]，成為當今的研究熱點。

外膜蛋白(Outer membrane protein，OMP)是嗜水氣單胞菌的毒力因子之一[8]，作為細菌免疫原具有安全性高、免疫原性強等優(yōu)點[9]。研究發(fā)現(xiàn)，嗜水氣單胞菌外膜蛋白OprM、OmpC、OmpF均具有良好的免疫原性，可有效抵抗嗜水氣單胞菌感染[10-12]，有望作為亞單位疫苗的候選成分。TolC蛋白是革蘭氏陰性菌細胞外膜上的通道蛋白，對該蛋白質(zhì)的研究大多聚焦于其在細菌體內(nèi)形成的ArcAB-TolC多藥外排系統(tǒng)[13-14]。然而，YANG等[15]發(fā)現(xiàn)，沙門氏菌的TolC蛋白具有較強的抗原性和免疫原性，可有效抵抗沙門氏菌的感染，張志強等[16]將遲緩愛德華菌外膜蛋白TolC免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠對遲緩愛德華菌具有較強的抵抗力，表明TolC是制備疫苗的潛在良好抗原。目前，有關(guān)嗜水氣單胞菌TolC蛋白免疫學(xué)功能研究尚未見報道。為此，選取嗜水氣單胞菌外膜蛋白TolC為研究對象，在線預(yù)測其理化性質(zhì)，分析其菌屬間同源性與進化關(guān)系，原核表達純化TolC蛋白并探討其最佳誘導(dǎo)表達條件，將純化的TolC蛋白免疫小鼠制備抗血清，體外模擬TolC蛋白抗血清與不同魚類致病菌的識別作用，進一步探究其抗原性，旨在為研制嗜水氣單胞菌亞單位疫苗提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 材料

嗜水氣單胞菌ATCC 7966，Escherichiacoli(E.coli) DH5α、BL21菌株及pET-32a質(zhì)粒由陜西理工大學(xué)中德天然產(chǎn)物研究所保存；DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ購自TaKaRa公司；質(zhì)粒提取、膠回收試劑盒購自上海生物工程公司；IPTG、TMB顯色液購自西安赫特生物科技有限公司；HRP標記山羊抗小鼠IgG購自Sigma公司；引物合成、基因測序由楊凌天潤奧科生物公司完成；4～5周齡昆明鼠購自西安交通大學(xué)實驗動物中心，試驗前飼養(yǎng)3 d，每日定量喂食供水。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析 從NCBI數(shù)據(jù)庫查找獲取嗜水氣單胞菌以及不同菌株來源的TolC蛋白序列，利用GeneDoc軟件進行同源性比對，通過MEGA軟件構(gòu)建TolC蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹；采用ProParam數(shù)據(jù)庫預(yù)測TolC蛋白的親水性、等電點、穩(wěn)定指數(shù)等理化指標，從ProScale Analysis數(shù)據(jù)庫中獲取親水性圖譜；采用TMHMM 2.0和SignalP 3.0軟件預(yù)測TolC蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽位置，利用SOPMA和SWISS-MODEL軟件分別進行二級結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)預(yù)測，通過STRING軟件在線獲取TolC蛋白與其他蛋白質(zhì)的相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。

1.2.2 重組菌株的構(gòu)建 從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲取嗜水氣單胞菌ATCC 7966菌株的全基因組序列，采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物擴增TolC基因。Primer-F:ATAGGATCCGTGCTGGGCTCGGCCCAG;Primer-R:GTTCTCGAGTCATGAATTCACCTCGAT(劃線位置為BamHⅠ和XohⅠ的酶切位點)。以提取的嗜水氣單胞菌全基因組為模板，利用rTaq聚合酶實現(xiàn)TolC擴增，PCR體系為50 μL，退火溫度設(shè)為55 ℃。PCR產(chǎn)物經(jīng)核酸電泳檢測并回收，BamH Ⅰ 和XohⅠ 雙酶切PCR產(chǎn)物與載體pET-32a，通過T4 DNA連接酶將TolC片段連接至質(zhì)粒pET-32a中，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，獲得重組質(zhì)粒。通過雙酶切和基因測序進一步鑒定重組質(zhì)粒，將鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliBL21中，構(gòu)建TolC蛋白原核表達菌株。

1.2.3 重組蛋白的表達及純化 挑取表達菌單菌落過夜培養(yǎng)，以1∶100轉(zhuǎn)接新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)至OD600為0.6，加入0.1 mmol/L的IPTG，低溫誘導(dǎo)過夜，取1 mL菌液收集菌體，加入300 μL 2×SDS Loading Buffer，沸水浴變性5 min，離心取上清10 μL進行SDS-PAGE電泳,檢測TolC表達情況，再通過包涵體洗滌和SDS-PAGE電泳切膠法純化TolC蛋白[9]。

1.2.4 重組蛋白表達條件的優(yōu)化 采用L9(34)試驗(表1)進行TolC蛋白最佳表達條件研究。簡要過程：過夜培養(yǎng)TolC表達菌至飽和，以1∶100轉(zhuǎn)接至600 mL培養(yǎng)液中，37 ℃條件下200 r/min培養(yǎng)至表中不同OD600值，按照組合要求加入不同濃度的IPTG并在設(shè)定條件下誘導(dǎo)，每組合進行3組重復(fù)。收取1 mL誘導(dǎo)菌液，沉淀加入300 μL 2×SDS Loading Buffer，沸水浴變性TolC蛋白5 min，通過SDS-PAGE電泳獲得不同誘導(dǎo)條件下TolC蛋白的表達圖譜。使用軟件Phoretix 1D和SPSS 13.0分別進行表達圖譜光密度和不同因子顯著性分析。

表1 TolC表達條件優(yōu)化試驗的因子與水平

1.2.5 TolC蛋白抗血清的制備及特異性與效價檢測 昆明鼠試驗組和對照組各10只。取純化的TolC蛋白100 μg混合100 μL弗氏完全佐劑，腹腔注射免疫小鼠。14 d后，等量蛋白混合100 μL弗氏不完全佐劑，再次免疫小鼠。21 d后，進行第3次免疫，對照組免疫PBS。7 d后小鼠經(jīng)眼球取血，4 ℃靜置待血清析出，3 000 r/min離心10 min，獲取抗血清于-80 ℃保存。采用Western blot檢測TolC蛋白抗血清特異性與效價，方法如下：SDS-PAGE電泳嗜水氣單胞菌全蛋白，200 mA轉(zhuǎn)PVDF膜40 min，PVDF膜充分封閉2 h后與不同稀釋倍數(shù)(1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200)的小鼠抗血清于37 ℃輕搖孵育40 min(對照為陰性抗血清)，再與1∶3 000倍稀釋的二抗于37 ℃輕搖孵育1 h，洗滌后通過DAB顯色法確定TolC蛋白抗血清的特異性。

1.2.6 體外模擬TolC蛋白抗血清與細菌的相互作用 采用ELISA[17]檢測TolC蛋白抗血清與3種魚類致病菌的相互作用：分別培養(yǎng)嗜水氣單胞菌、熒光假單胞菌和溶藻弧菌至OD600約1.0，菌體用1 %的甲醛生理鹽水80 ℃滅活，生理鹽水調(diào)整菌液OD600=0.2，分裝為1 mL/管(菌量108cfu)，小管菌分別與100 μL不同稀釋倍數(shù)的TolC蛋白抗血清(1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400)孵育90 min，對照為陰性血清。菌體洗滌后與200 μL 1∶3 000倍稀釋的二抗孵育1 h，洗滌菌體并混合20 μL PBS至酶標板中，加入200 μL TMB顯色液，室溫避光顯色10 min，加入50 μL 2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，450 nm處讀數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 TolC蛋白的生物信息學(xué)分析

2.1.1 同源性與系統(tǒng)發(fā)育分析 通過GeneDoc軟件獲取不同菌株TolC氨基酸序列多重比對結(jié)果(圖1)，不同菌屬間TolC蛋白同源性較差。利用MEGA軟件構(gòu)建TolC系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)，發(fā)現(xiàn)不同種類氣單胞菌間親緣關(guān)系相對于其他菌株更近，推測TolC蛋白可能為不同種類氣單胞菌提供交叉免疫保護作用。

2.1.2 理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)與功能預(yù)測 ProtParam數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，TolC蛋白含有452個氨基酸，等電點為5.85，半衰期大于10 h，不穩(wěn)定指數(shù)為34.43，屬于穩(wěn)定蛋白；親水性圖譜顯示，氨基酸最大分值為2.256，最小為-2.089，親水性平均值為-0.268，為親水性蛋白(圖3A)；跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測圖譜(圖3B)顯示，TolC蛋白具有跨膜結(jié)構(gòu)，但可信度較低；信號肽預(yù)測結(jié)果(圖3C)顯示，TolC蛋白無信號肽序列；SOPMA軟件二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示，α-螺旋占全序列61.1%，無規(guī)則卷曲占27.4%，延伸鏈占11.5%(圖3D)。SWISS-MODEL軟件三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，TolC蛋白的三維結(jié)構(gòu)呈孔狀(圖3E)；通過STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)有10種蛋白質(zhì)可與TolC蛋白相互作用，其中來源于嗜水氣單胞菌的蛋白AHA_3508、3507、3506與TolC蛋白作用關(guān)系最為緊密(圖3F)。

2.2 TolC重組質(zhì)粒的構(gòu)建及蛋白質(zhì)表達純化

利用引物Primer-F、Primer-R擴增TolC基因，電泳檢測顯示在約1 300 bp處存在單一條帶(圖4A)，大小與NCBI數(shù)據(jù)庫公布的TolC大小為1 359 bp一致。重組質(zhì)粒pET-32a-TolC經(jīng)BamHⅠ和XohⅠ 雙酶切，獲得約1 300 bp的目標條帶，大小符合理論值(圖4B)。目的基因測序鑒定結(jié)果顯示與 NCBI 數(shù)據(jù)庫所公布序列一致，證實成功構(gòu)建重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliBL21獲得TolC蛋白表達菌株，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，電泳結(jié)果顯示，在約70 ku處目標蛋白成功表達；采用包涵體洗滌和SDS-PAGE電泳切膠法獲得了較高純度的TolC蛋白(圖4C)。

2.3 TolC蛋白表達條件的優(yōu)化

收取不同組合條件下的誘導(dǎo)菌體，經(jīng)SDS-PAGE電泳獲得不同誘導(dǎo)條件下TolC蛋白的表達圖譜(圖5)，圖譜光密度值分析結(jié)果見表2，所得數(shù)據(jù)極差和方差分析如表3和表4所示。由表3可看出，在誘導(dǎo)TolC蛋白表達時，最佳條件組合為A3B1C2D3，即在菌液OD600為1.0時如入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG，37 ℃誘導(dǎo)8 h。表4結(jié)果顯示，誘導(dǎo)劑IPTG濃度達到顯著性，由此可知，誘導(dǎo)劑IPTG濃度對于TolC蛋白的高效表達影響較大。

2.4 TolC蛋白抗血清的特異性與效價檢測

Western blot結(jié)果顯示，TolC蛋白抗血清與TolC特異性結(jié)合，呈現(xiàn)出明顯的單一條帶，陰性對照無條帶。表明TolC蛋白具有良好的免疫原性，制備獲得特異性較好的TolC蛋白抗血清，抗血清效價達到1∶3 200(圖6)。

表2 TolC表達圖譜光密度分析Tab.2 Optical density analysis of TolC expression map

表3 TolC表達圖譜光密度數(shù)值的極差分析Tab.3 Range analysis of optical density of TolC expression map

表4 TolC表達圖譜光密度數(shù)值的方差分析Tab.4 Variance analysis of optical density of TolC expression map

2.5 TolC蛋白抗血清與嗜水氣單胞菌的相互作用

采用ELISA檢測TolC蛋白抗血清與3種魚類致病菌的體外相互作用，結(jié)果顯示，TolC蛋白抗血清與嗜水氣單胞菌、熒光假單胞菌以及溶藻弧菌在體外均存在相互作用，且隨著抗血清稀釋倍數(shù)的增大，兩者結(jié)合能力逐漸減弱(圖7)。其中TolC蛋白抗血清與嗜水氣單胞菌的相互識別最為緊密，當抗體滴度達到1∶6 400時，仍可檢測到兩者的相互作用。由此可見，TolC蛋白具有良好的抗原性，TolC蛋白抗血清可通過形成抗原(病原菌)-抗體復(fù)合物，再結(jié)合抗原呈遞作用，實現(xiàn)動物體內(nèi)病原菌的清除。

3 結(jié)論與討論

生物信息學(xué)可準確預(yù)測蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)與抗原表位，為蛋白質(zhì)功能研究提供參考價值[18]。本研究中，同源性和進化關(guān)系分析結(jié)果顯示，不同菌屬細菌間TolC蛋白同源性較差，說明不同細菌間TolC蛋白差異較大，而不同種類的氣單胞菌間親緣關(guān)系較近。據(jù)此推測，TolC蛋白作為免疫原產(chǎn)生的抗體可能在不同種類的氣單胞菌間存在交叉免疫保護作用。此外，TolC蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，無規(guī)則卷曲占比達27.4%，該結(jié)構(gòu)易扭曲盤旋，暴露在TolC蛋白外層，成為優(yōu)勢細胞抗原表位的可能性較大，這為抗原表位的預(yù)測提供了依據(jù)[18]。

多克隆抗體制備簡單、可結(jié)合靶蛋白的多個抗原表位，而外膜蛋白作為嗜水氣單胞菌的主要毒力因子之一，能夠激發(fā)機體產(chǎn)生高水平保護性抗體[9,19]。因此，利用原核表達純化的蛋白質(zhì)免疫動物是制備多克隆抗體的常見方法。李海賓等[20]利用鼠傷寒沙門菌SseB和SseL蛋白免疫小鼠制備了特異性多抗，呂莫然等[21]將純化的豬細小病毒7型cap蛋白免疫小鼠，制備了高效價的鼠源多克隆抗體。本研究將純化的嗜水氣單胞菌TolC蛋白免疫小鼠，獲得了特異性較好的TolC蛋白抗血清，效價達到1∶3 200。體外模擬試驗結(jié)果顯示，TolC抗血清與嗜水氣單胞菌、熒光假單胞菌、溶藻弧菌存在相互作用，進一步驗證了TolC蛋白具有良好的抗原性，這與YANG等[15]、張志強等[16]關(guān)于沙門氏菌和遲緩愛德華氏菌TolC蛋白的研究結(jié)果相似，均證實了TolC蛋白具有良好的免疫原性和抗原性。由此推測，嗜水氣單胞菌TolC蛋白也可能對一些其他的魚類致病菌具有良好的免疫原性，發(fā)揮交叉免疫保護功能。

蛋白質(zhì)表達由于受到表達宿主的影響，其往往具有最佳表達條件。本研究中，菌液OD600為1.0、IPTG終濃度為0.1 mmol/L、37 ℃誘導(dǎo)8 h時，TolC蛋白獲得最大表達量。ZHAO等[22]研究發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)劑TPTG具有一定毒性，且高濃度的 IPTG會導(dǎo)致大量包涵體產(chǎn)生，降低了可溶性蛋白的表達。伍娜娜等[23]研究發(fā)現(xiàn)，長時間誘導(dǎo)會導(dǎo)致蛋白質(zhì)被細菌蛋白酶降解，不利于蛋白質(zhì)的高效表達。本研究也發(fā)現(xiàn)，低濃度的IPTG、適度的誘導(dǎo)時間更利于TolC蛋白的高效表達，該結(jié)果為工業(yè)生產(chǎn)上大量制備TolC蛋白提供了理論依據(jù)。

綜上所述，嗜水氣單胞菌外膜蛋白TolC為孔狀蛋白，在氣單胞菌屬間進化保守，具有較強的免疫原性和抗原性，并可能對不同魚類致病菌存在交叉免疫保護作用，可成為防治嗜水氣單胞菌感染的疫苗候選抗原。