陳則東，朱建平，郭書玉，盧 煒，劉 蕾

(1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院 寵物科技學(xué)院，江蘇 泰州 225300； 2.西華大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，四川 成都 610039)

近幾年，食品行業(yè)已步入功能性食品時代。其中，益生菌的開發(fā)和應(yīng)用占據(jù)了重要位置。聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織(WHO)將益生菌定義為活的微生物，當(dāng)給予宿主補充足夠數(shù)量時可對健康產(chǎn)生積極作用[1]。2013年，益生菌被重新定義，包括益生菌的3個主要方面：微生物、生物活性、有益健康[2]。益生菌在維持腸道菌群平衡、改善腸道功能、提高免疫力、增強機體免疫反應(yīng)、降低血清膽固醇等方面有著舉足輕重的地位[3-6]。全球益生菌市場主要集中在亞洲、北美和歐洲三大區(qū)域。預(yù)計到2021年亞太地區(qū)益生菌市場銷售額將達到314億美元。預(yù)計到2024年，全球市場上益生菌的價值將超過730億美元[7]。近年來國內(nèi)益生菌產(chǎn)業(yè)也迎來了井噴式發(fā)展。然而，與益生菌的龐大市場相比，對于益生菌的功能評價仍然不足。

目前，大多數(shù)益生菌的功能評價仍然采用小鼠、大鼠等實驗動物。但是，這些實驗動物與人類的飲食習(xí)慣、生活習(xí)慣等有很大的差異[8]。因此，實驗動物評價結(jié)果僅具有有限的指導(dǎo)意義。犬常與人類共享生活環(huán)境，甚至具有相似的飲食結(jié)構(gòu)和生活習(xí)慣[9]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，犬消化、代謝、神經(jīng)和腫瘤相關(guān)的基因與人類具有共同的進化趨勢[10-12]。與小鼠、豬等腸道菌群常用動物模型相比，犬的腸道微生物結(jié)構(gòu)和功能更為接近[13]。鑒于此，犬是研究人類腸道微生物菌群更為可靠的動物模型。近年來，在伴侶動物營養(yǎng)方面的研究成為熱點[14]。與人類益生菌市場類似，寵物犬的益生菌市場同樣具有巨大的潛力。然而，在犬中進行益生菌功能評價的相關(guān)研究還十分匱乏。鑒于此，以犬為實驗動物，評價益生菌的促生長作用及腸道調(diào)節(jié)作用，不僅為人類益生菌的研究和開發(fā)提供重要參考價值，也對寵物益生菌資源的開發(fā)和評價具有重要意義。

基于上述研究背景，以比格犬為試驗對象，飼喂1株從發(fā)酵泡菜中分離得到的植物乳桿菌LR-39，通過測定試驗犬平均日增質(zhì)量、料重比及營養(yǎng)物質(zhì)消化率，評價該株乳酸菌對宿主的促生長作用；通過高通量測序分析犬腸道菌群變化，并進一步采用PICRUSt解析腸道中微生物差異功能基因的表達情況，評價該菌株對宿主的腸道調(diào)節(jié)作用，并進一步對該菌株的全基因組序列進行測序，明確該菌株的基本遺傳背景，為今后益生菌的開發(fā)和評價奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum) LR-39保存在中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)，保藏編號為CICC No.24811。全基因組序列已提交至GenBank，登錄號為VRKS00000000。

1.1.2 培養(yǎng)基 MRS(DeMan-Rogosa-Sharpe)培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，檸檬酸二銨2 g/L，葡萄糖20 g/L，硫酸鎂0.58 g/L，牛肉浸膏10 g/L，磷酸氫二鉀2 g/L，乙酸鈉5 g/L，吐溫80 1 mL/L，硫酸錳0.25 g/L。

1.1.3 供試動物 3.5月齡比格犬(Beagle)10只，由揚州四方實驗動物科技有限公司提供，飼養(yǎng)于江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院實驗動物房，自由飲水，早晚各采食指定品牌犬糧1次，實驗動物使用許可證：SYXK(蘇)2012—0029。

1.1.4 基礎(chǔ)犬糧 比瑞吉品牌全價小型犬幼年期犬糧，符合美國飼料管理協(xié)會(AAFCO)營養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)，購自上海比瑞吉公司。犬糧成分分析保證值(以干物質(zhì)計)：粗蛋白≥30.0%、粗脂肪≥16.0%、粗纖維≤5.0%、粗灰分≤10.0%、賴氨酸≥1.0%、鈣≥1.2%、總碳≥1.0%、水分≤10.0%、水溶性氯化物(以CI計)≥0.45%。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)與凍干 將活化的LR-39按1∶100比例接種于MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃、 200 r/min培養(yǎng)36 h，5 000 r/min離心10 min收集菌體，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，凍干保護劑重懸菌體至終濃度1×109cfu/mL，分裝至西林瓶。-80 ℃冰箱內(nèi)預(yù)凍10 h后，置于真空冷凍干燥機中，-40 ℃、40 MPa冷凍干燥24 h，制備得凍干菌粉。

1.2.2 動物分組與處理 比格犬10只，隨機分為試驗組與對照組，每組各5只，犬只之間體質(zhì)量接近，每只犬單籠飼養(yǎng)。試驗組依次編號為A1—A5，灌飼LR-39菌液(1×109cfu/mL)1 mL；對照組依次編號為B1—B5，灌飼等體積PBS。于犬每日早上采食犬糧后灌飼，連續(xù)灌飼28 d。

1.2.3 體質(zhì)量測定及營養(yǎng)物質(zhì)消化率測定 在28 d的試驗期內(nèi)，每周按時測量犬體質(zhì)量。計算料重比，即飼料消耗/體質(zhì)量增加。同時，試驗結(jié)束時采集犬的新鮮糞便50 g，保存于-80 ℃條件下，送往青島科創(chuàng)質(zhì)量檢測有限公司檢測營養(yǎng)物質(zhì)的含量，包括水、粗蛋白、粗脂肪、粗纖維、鈣、總磷、灰分，計算消化率。消化率=(飼料中的營養(yǎng)質(zhì)量-糞便中的營養(yǎng)質(zhì)量)/飼料中的營養(yǎng)質(zhì)量×100%。

1.2.4 基因組提取及測序 收集灌飼第28天犬新鮮糞便樣本送往華大基因(深圳)有限公司，利用Illumina測序平臺分析16S rRNA V4 區(qū)。所有序列按操作分類單元(OTU)進行分類，相似度為97%。

1.2.5 生物信息學(xué)分析 使用Cutadapt軟件(V1.9.1)過濾原始讀數(shù)，利用短讀數(shù)的快速長度調(diào)整軟件V1.2.11(FLASH)調(diào)整干凈數(shù)據(jù)。應(yīng)用USEARCH(V7.0.1090)軟件將所有干凈的讀數(shù)聚集到具有代表性的OTU中，并使用RDP分類器(V2.2)進行注釋。利用gplots of R(V3.1.1)將微生物群的豐度聚類到熱圖中。采用效應(yīng)大小線性判別分析(LEfSe)評估結(jié)腸微生物群落的物種組成(https://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/)，用Wilcoxon秩和檢驗，用Spearman分析物種間的相關(guān)性。通過PICRUSt(基于16S rRNA擴增子測序結(jié)果預(yù)測微生物群落功能)對菌群功能基因進行預(yù)測(http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/)。用Wilcox試驗分析差異功能基因圖譜。

1.2.6 全基因組測序 將提取的LR-39基因組DNA進行文庫構(gòu)建、簇生成，于Illumina Hiseq 2000測序平臺進行高通量測序，測序深度為311×。所有 DNA 讀取短片段經(jīng)SOAPdenovo進行收集，以GenBank中LactobacillusplantarumWCFS1全基因組序列為參考基因組，經(jīng)SOAPGapCloser進行g(shù)ap彌合，獲得大片段(無gap)拼接的全基因組草圖。進一步對全基因組序列進行COG及CAZy注釋分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 21.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，試驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。平均日增質(zhì)量、料重比、營養(yǎng)物質(zhì)消化率等組間比較運用獨立樣本t檢驗程序分析，腸道菌群比較采用Mann-Whitney檢驗，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 LR-39菌株對犬生長性能的影響

由表1可知，在試驗開始時，試驗組與對照組初始體質(zhì)量無顯著(P>0.05)差異；在試驗結(jié)束時，與對照組相比試驗組平均體質(zhì)量提高0.54 kg，差異顯著(P<0.05)；在試驗周期內(nèi)，試驗組較對照組平均日增質(zhì)量極顯著(P<0.01)提高12.15 g，料重比顯著(P<0.05)降低3.17。以上結(jié)果表明，LR-39菌株對犬具有顯著的促生長作用。

2.2 LR-39菌株對犬消化率的影響

本研究就植物乳桿菌LR-39調(diào)整犬對營養(yǎng)物質(zhì)的消化率進行了比較，包括粗蛋白、粗脂肪、粗纖維、鈣、總磷、灰分。由表2可知，與對照組相比，試驗組粗蛋白、粗脂肪、鈣的消化率顯著(P<0.05)提升；粗纖維、磷、灰分的消化率有所提升，但不存在顯著(P>0.05)差異。結(jié)果表明，飼喂植物乳桿菌LR-39能促進犬對營養(yǎng)物質(zhì)的消化。

表2 LR-39菌株對犬營養(yǎng)物質(zhì)消化率的影響Tab.2 Effect of LR-39 strain on nutrient digestibility of dogs %

2.3 LR-39菌株對犬腸道菌群的影響

采用高通量測序?qū)υ囼灲M和對照組犬腸道菌群結(jié)構(gòu)進行分析。由圖1可知，試驗組、對照組犬的共有OTU數(shù)目為236個，試驗組特有OTU 20個，對照組特有OTU 13個(圖1A)。PLSDA分析結(jié)果表明，試驗組與對照組可以被明顯區(qū)分(圖1B)，飼喂植物乳桿菌LR-39對犬腸道菌群產(chǎn)生明顯的影響。

圖1 犬腸道微生物OTU數(shù)量的Venn圖(A)和偏最小二乘法判別分析(B)Fig.1 Venn map of OTU number in dog intestine(A)and partial least squares discrimination analysis(B)

由表3可知，門水平上主要檢測到梭桿菌門(Fusobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)5個門。試驗組梭桿菌門和擬桿菌門相對豐度顯著(P<0.05)提高，放線菌門相對豐度顯著(P<0.05)降低；變形菌門相對豐度上調(diào)(P>0.05)，厚壁菌門相對豐度下調(diào)(P>0.05)。上述結(jié)果說明，飼喂植物乳桿菌LR-39可以在門水平改變?nèi)c道菌群的組成。

表3 LR-39菌株對犬腸道主要菌群門水平相對豐度的影響Tab.3 Effect of LR-39 strain on relative abundance of intestinal flora in dog at phylum level %

為了進一步明確試驗組與對照組腸道菌群的特征微生物，開展LEfSe分析。從圖2A可以看出，在科水平，LEfSe共鑒定出4個科存在顯著差異，分別是紅蝽桿菌科(Coriobacteriaceae)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)、瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)、梭桿菌科(Fusobacteriaceae)。其中，對照組中的特征微生物科是紅蝽桿菌科(Coriobacteriaceae)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)、瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)，而飼喂LR-39后，特征微生物為梭桿菌科(Fusobacteriaceae)。從圖2B可以看出，對照組特征微生物菌屬分別是丹毒絲菌屬(Bulleidia)、鏈型桿菌屬(Catenibacterium)、真桿菌屬(Eubacterium)、布勞特氏菌屬(Blautia)、糞桿菌屬(Faecalibacterium)，而試驗組特征微生物菌屬是梭桿菌屬(Fusobacterium)。以上結(jié)果說明，飼喂LR-39會顯著改變宿主的腸道菌群結(jié)構(gòu)，并改變特征微生物科屬。

C：紅蝽桿菌科；D：紅蝽桿菌目；E：紅蝽菌綱；F：毛螺菌科；G：瘤胃球菌科；H：梭菌目；I：梭菌綱；J：梭桿菌科；K：梭桿菌目；L：梭桿菌綱；M：α-變形菌綱C:Coriobacteriaceae;D:Coriobacteriales;E:Coriobacteriia;F:Lachnospiraceae;G:Ruminococcaceae;H:Clostridiales;I:Clostridia;J:Fusobacteriaceae;K:Fusobacteriales;L:Fusobacteriia;M:Alpha-proteobacteria圖2 組間差異犬腸道菌群的LEfSe進化分支圖(A)和LDA值分布柱狀圖(B)Fig.2 Evolutionary branch diagram of LEfSe(A)and histogram of LDA value distribution in dog intestinal flora between different groups

為比較LR-39在種水平上對腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響，對腸道相對豐度較高的前10位的菌種進行比較，結(jié)果如圖3所示。在種水平上，試驗組瑞士乳桿菌(Lactobacillushelveticus)相對豐度極顯著(P<0.01)升高；其他菌種相對豐度降低，其中柯林斯菌(Collinsellastercoris)、黏液真桿菌(Blautiaproducta)相對豐度顯著(P<0.05)降低。上述結(jié)果表明，在種水平，整體上植物乳桿菌LR-39對腸道菌群具有正向調(diào)節(jié)作用，可以顯著促進有益菌種相對豐度升高，降低有害菌種的相對豐度。植物乳桿菌LR-39可以降低動物雙歧桿菌(Bifidobacteriumanimals)的相對豐度，其原因有待進一步研究。

2.4 犬腸道菌群相關(guān)性分析

為了分析宿主腸道菌群之間的關(guān)聯(lián)，對菌群在種水平的相關(guān)性進行了進一步分析，結(jié)果如圖4所示。其中，瑞士乳桿菌(Lactobacillushelveticu)與柯林斯菌(Collinsellastercoris)、黏液真桿菌(Blautiaproducta)、瘤胃球菌(Ruminococcustorques)、白痢丁酸桿菌(Butyricicoccuspullicaecorucorum)呈負(fù)相關(guān)。大腸桿菌(Escherichiacoli)與梭形鯨蠟桿菌(Cetobacteriumsomerae)、白痢丁酸桿菌(Butyricicoccuspullicaecorucorum)呈正相關(guān)。非解乳糖鏈球菌(Streptococcusalactolyticus)與黃斑葡萄球菌(Prevotellacopri)呈顯著正相關(guān)，與動物雙歧桿菌(Bifidobacteriumanimal)和瘤胃球菌(Ruminococcustorques)呈負(fù)相關(guān)。

*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)* represents significant difference(P<0.05),** represents extremely significant difference(P<0.01)圖3 犬腸道種水平相對豐度前10位的菌種差異分析Fig.3 Analysis on the top 10 species in relative abundance in dog intestine

A:白痢丁酸桿菌；B:非解乳糖鏈球菌；C：瑞士乳桿菌；D：瘤胃球菌；E：Clostridium.hiranonis； F：動物雙歧桿菌；G：大腸桿菌；H：黏液真桿菌；I：梭形鯨蠟桿菌；J：普氏糞桿菌；K：科林斯菌；L：黃斑葡萄球菌；M：其他A:Butyricicoccus pullicaecorum；B:Streptococcus alactolyticus；C：Lactobacillus helveticus；D：Ruminococcus torques；E：Clostridium hiranonis；F：Bifidobacterium animals；G：Escherichia coli；H：Blautia producta；I：Cetobacterium somerae；J：Faecalibacterium prausnitzii；K：Collinsella stercoris；L：Prevotella copri；M：Others圖4 犬腸道菌群種水平相關(guān)性分析Fig.4 Correlation thermogram of intestinal flora at species level in dog

2.5 犬腸道菌群功能差異基因分析

為了明確植物乳桿菌LR-39對犬腸道菌群功能基因及代謝途徑的影響，采用PICRUSt和Wilcox對兩者進行了預(yù)測，結(jié)果如圖5所示。預(yù)測的功能基因涉及20條代謝途徑，主要包括復(fù)制、重組和修復(fù)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄、碳水化合物運輸和代謝、氨基酸轉(zhuǎn)運和代謝等。與對照組相比，試驗組參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制、轉(zhuǎn)錄、碳水化合物運輸和代謝、次級代謝物合成的基因相對豐度發(fā)生下調(diào)，其余基因發(fā)生上調(diào)；其中差異最為明顯的是細胞內(nèi)運輸、細胞外結(jié)構(gòu)以及次級代謝物3條途徑的基因相對豐度，前兩者發(fā)生上調(diào)，后者發(fā)生下調(diào)。

2.6 基于全基因組序列分析LR-39菌株

通過二代測序技術(shù)對植物乳桿菌LR-39進行全基因組草圖測序，結(jié)果如圖6所示。LR-39菌株全長247 554 bp，無質(zhì)粒，GC含量為44.26%，與已經(jīng)公布序列的植物乳桿菌類似。進一步對LR-39菌株的序列進行COG及CAZy注釋分析，結(jié)果如圖7所示。從圖7A可以看出，LR-39菌株的基因主要分布于22個大類。LR-39菌株碳水化合物代謝相關(guān)基因豐度最高，氨基酸代謝基因其次，而脂代謝相關(guān)基因的豐度較低。此外，LR-39菌株與拮抗機制相關(guān)的基因占有一定比例，提示LR-39菌株在胃腸道環(huán)境及產(chǎn)品研發(fā)的不良環(huán)境中具有拮抗?jié)摿?。LR-39菌株的五大酶系主要分布在糖苷水解酶、糖基轉(zhuǎn)移酶、碳水化合物酯酶、碳水化合物結(jié)合分子、輔助性酶類(圖7B)。

圖5 犬腸道菌群的功能差異基因分析Fig.5 Functional differential gene analysis of dog intestinal flora

圖6 植物乳桿菌LR-39全基因組草圖Fig.6 Draft genome of L.plantarum LR-39

C：復(fù)制、重組和修復(fù)；D：氨基酸的運輸和代謝；E：細胞周期控制、細胞分裂、染色體分裂；F：RNA加工與修飾；G：能量代謝與轉(zhuǎn)換；H：信號傳導(dǎo)機制；I：核苷酸運輸和代謝；J：脂質(zhì)運輸和代謝；K：轉(zhuǎn)錄；L：輔酶的運輸與代謝；M：翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物合成；N：細胞壁/膜生物合成；O：翻譯后修飾、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換與伴侶；P：無機離子的轉(zhuǎn)運和代謝；Q：一般功能預(yù)測；R：碳水化合物的運輸和代謝；S：染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和動力學(xué)；T：細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運、分泌和囊泡運輸；U：細胞外結(jié)構(gòu)；V：次級代謝物的生物合成，運輸和分解代謝;W：細胞運動；X：未知功能；Y：防御機制；Z：可移動基因組、前噬菌體、轉(zhuǎn)座子；AA:輔助性酶類；CBM：碳水化合物結(jié)合分子；CE：碳水化合物脂酶；GH：糖苷水解酶；GT：糖基轉(zhuǎn)移酶

3 結(jié)論與討論

目前，已有越來越多的證據(jù)表明,益生菌對于宿主的健康具有諸多不同的益生功效，其中調(diào)節(jié)腸道菌群是較為明確的功效之一[15-16]。腸道菌群紊亂與很多疾病相關(guān)，目前的主要療法仍是抗生素或其他化學(xué)物質(zhì)的使用，但是這可能會加重宿主的腸道失調(diào)[17]。同時，抗生素耐藥性是更為嚴(yán)重的問題。因此，開發(fā)益生菌制劑具有廣闊的市場前景[18]。雖然已有研究充分表明益生菌對宿主腸道有積極作用[19]，益生菌制劑也廣泛地應(yīng)用于經(jīng)濟動物及伴侶動物中，但是關(guān)于其在犬中的科學(xué)研究還較為匱乏。

本研究首先評價了植物乳桿菌LR-39對犬體質(zhì)量和營養(yǎng)物質(zhì)消化率的影響。有研究發(fā)現(xiàn)，益生菌能夠促進多種動物的體質(zhì)量增長，例如火雞、雞、羊、豬等[20-23]，這與本試驗研究結(jié)果一致。益生乳桿菌LR-39能夠極顯著提高犬的平均日增質(zhì)量、顯著降低料重比。本研究對腸道菌群進行分析發(fā)現(xiàn)，主要微生物門有厚壁菌門、梭桿菌門、擬桿菌門、變形菌門和放線菌門。與人類和其他動物相比，犬的梭桿菌門相對豐度更高。在門水平上，試驗組梭桿菌門相對豐度顯著上調(diào)，放線菌門相對豐度顯著下調(diào)。LEfSe分析結(jié)果顯示，對照組特征微生物菌屬分別是丹毒絲菌屬(Bulleidia)、鏈型桿菌屬(Catenibacterium)、真桿菌屬(Eubacterium)、布勞特氏菌屬(Blautia)、糞桿菌屬(Faecalibacterium)，而試驗組特征微生物菌屬是梭桿菌屬(Fusobacterium)。梭桿菌屬(Fusobacterium)成為試驗組的特征菌屬與試驗預(yù)期不符，具體原因還有待進一步研究。在種水平上，試驗組瑞士乳桿菌(Lactobacillushelveticus)相對豐度極顯著提高，腸道有害菌群相對豐度降低，表明植物乳桿菌LR-39對犬的腸道健康具有正向調(diào)節(jié)作用。然而補飼植物乳桿菌LR-39后，具有益生作用的動物雙歧桿菌相對豐度發(fā)生降低，這可能與腸道pH值較大幅度降低有關(guān)。PICRUSt是一種基于16S RNA測序數(shù)據(jù)進行功能基因和代謝通路預(yù)測的新方法[24]。目前，采用該方法對犬腸道菌群功能基因及代謝途徑進行預(yù)測的研究還非常少見。最近研究發(fā)現(xiàn)，益生菌的飼喂會使得腸道中涉及細胞運動、碳水化合物轉(zhuǎn)運及代謝、轉(zhuǎn)錄等功能基因的相對豐度發(fā)生顯著變化[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，飼喂益生菌后，犬腸道中復(fù)制、重組和修復(fù)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄、碳水化合物運輸和代謝、氨基酸轉(zhuǎn)運和代謝等基因發(fā)生變化。本研究有助于進一步拓展對益生菌調(diào)節(jié)犬腸道菌群的作用及機制的理解，為今后的相關(guān)研究提供參考。

綜上所述，飼喂植物乳桿菌LR-39能提高犬營養(yǎng)物質(zhì)消化率，促進犬生長，正向調(diào)節(jié)犬腸道菌群結(jié)構(gòu)；補飼LR-39還能夠影響腸道菌群功能基因及代謝途徑，使參與細胞內(nèi)運輸、細胞外結(jié)構(gòu)的基因相對豐度顯著升高。此外，本研究進一步對該菌株的全基因組序列進行了測序，明確了該菌株的基本遺傳背景，為今后益生菌的開發(fā)和評價奠定了理論基礎(chǔ)。