聶鑫怡, 薛 楊, 王銀春, 丁霞飛, 汪世華

(1.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院；2.福建省病原真菌與真菌毒素重點實驗室，福建 福州 350002)

乳清酸核苷-5′-磷酸脫羧酶基因URA3/pyrG是一類常用的真菌遺傳轉(zhuǎn)化營養(yǎng)缺陷篩選標(biāo)記，其編碼產(chǎn)物是真菌尿嘧啶核苷酸合成過程中的關(guān)鍵酶，該基因突變或敲除會使乳清酸核苷-5′-磷酸脫羧酶失活或缺失，表現(xiàn)為尿嘧啶營養(yǎng)缺陷，只能通過外源添加尿嘧啶或尿嘧啶核苷(尿苷)才能在培養(yǎng)基上生長.URA3篩選標(biāo)記最早在釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)轉(zhuǎn)化中應(yīng)用，后來應(yīng)用范圍擴大到其他酵母科真菌，如白念珠菌(Candidaalbicans)[1-4].由于尿嘧啶生物合成途徑非常保守，在絲狀真菌中也有相似的合成過程.黃曲霉(Aspergillusflavus)、煙曲霉(A.fumigatus)、構(gòu)巢曲霉(A.nidulans)、黑曲霉(A.niger)、米曲霉(A.oryzae)和土曲霉(A.terreus)等真菌中的pyrG基因都與釀酒酵母URA3基因同源，在遺傳轉(zhuǎn)化中也得到了廣泛應(yīng)用[5-9].

除了URA3/pyrG篩選標(biāo)記外，還有一些常見的篩選標(biāo)記，如氮源和碳源營養(yǎng)缺陷標(biāo)記基因、藥物抗性標(biāo)記基因等.在比較菌株性狀時，攜帶不同的篩選標(biāo)記會造成菌株間遺傳背景的不同和性狀的差異，從而影響研究結(jié)果的準(zhǔn)確性.URA3/pyrG環(huán)出系統(tǒng)的出現(xiàn)解決了這一難題.該系統(tǒng)僅用URA3/pyrG一個篩選標(biāo)記，配合5-氟乳清酸(5-FOA)的負篩選，使URA3/pyrG篩選標(biāo)記插入真菌細胞的基因組-環(huán)出-再插入-再環(huán)出，如此循環(huán)，進行多次遺傳操作[10-11].但URA3/pyrG環(huán)出系統(tǒng)也存在缺陷，如使用該系統(tǒng)前必須要在URA3/pyrG基因兩端分別插入一段同向重復(fù)序列(direct repeat)，該操作過程繁瑣、耗時，且由于存在兩段同向重復(fù)序列，PCR擴增基因重組片段時特別容易造成引物的錯配，出現(xiàn)非特異條帶.此外，URA3/pyrG環(huán)出后會在基因組上殘留一段重復(fù)序列，該重復(fù)序列是否會影響菌株的性狀尚未可知.針對這些問題，本研究在黃曲霉中建立了一種新的pyrG篩選標(biāo)記循環(huán)利用的方法.

1 材料與方法

1.1 材料

黃曲霉WT(Δku70)菌株和CA14PTs(Δku70ΔpyrG)菌株由美國農(nóng)業(yè)部南方研究中心Perng-Kuang Chang教授惠贈，黃曲霉GHS(pyrG+)菌株由本研究構(gòu)建，構(gòu)巢曲霉FGSC A4菌株(ATCC 38163)和煙曲霉AF293菌株(ATCC MYA-4609)由福建省病原真菌與真菌毒素重點實驗室購買保存.

質(zhì)粒pUC18-HA-SumO上攜帶的639 bp的HA-sumOCDS-3′-UTR核苷酸片段由通用生物系統(tǒng)(安徽)公司全基因合成.

高保真DNA聚合酶、rTaq DNA聚合酶和未染色蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)購自上海翊圣生物科技公司，DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)購自東盛生物科技公司，凝膠回收試劑盒為OMEGA公司產(chǎn)品，酵母提取物和瓊脂糖為奧賽公司產(chǎn)品，RIPA裂解液購自上海碧云天生物技術(shù)公司，預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)和HA標(biāo)簽抗體購自賽默飛公司，Actin抗體為CST公司產(chǎn)品，5-氟乳清酸、尿嘧啶和尿苷均購自上海生工公司.

1 000×微量元素母液(100 mL)：ZnSO4·7H2O 2.2 g，H3BO31.1 g，MnCl2·4H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.16 g，CoCl2·5H2O 0.16 g，CuSO4·5H2O 0.16 g， (NH4)6Mo7O24·4H2O 0.11 g，Na4EDTA 5 g，溶于去離子水，過濾除菌.

YGT固體培養(yǎng)基(1 L)：酵母提取物 5 g，葡萄糖 20 g，1 000×微量元素母液1 mL，瓊脂粉20 g.在YGT培養(yǎng)基中分別加入1 mg·L-1尿嘧啶和尿苷即為YGTUU液體培養(yǎng)基.

本研究所用引物見表1.

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.2 GHS(pyrG+)重組菌株的構(gòu)建

以尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型黃曲霉CA14PTs(Δku70ΔpyrG)菌株為出發(fā)菌，構(gòu)建GHS(pyrG+)重組菌株，構(gòu)建策略如圖1所示.步驟如下：以黃曲霉CA14PTs(Δku70ΔpyrG)菌株基因組DNA為模板，用引物P1和P2擴增長度為1 171 bp的sumO基因上游非轉(zhuǎn)錄區(qū)5′-UTR片段；利用引物P3和P4從煙曲霉AF293菌株基因組DNA中擴增長度為1 890 bp的pyrG表達元件；利用引物P5和P6從構(gòu)巢曲霉FGSC A4菌株基因組DNA中擴增長度為1 510 bp的3′-磷酸甘油醛脫氫酶基因啟動子gpdA(p)片段；利用引物P7和P8從質(zhì)粒pUC-18-HA-SumO中擴增長度為639 bp的片段HA-sumOCDS-3′-UTR；將上述各片段用重疊PCR法連接到一起，以巢式引物P9和P10擴增長度為5 146 bp的融合片段5′-UTR-pyrG-gpdA(p)-HA-sumOCDS-3′-UTR，轉(zhuǎn)化黃曲霉CA14PTs(Δku70ΔpyrG)菌株原生質(zhì)體，通過DNA同源重組使融合片段整合到基因組的sumO基因座上替換掉內(nèi)源的sumO基因，在不含尿嘧啶和尿苷的復(fù)蘇培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)3 d后篩選、鑒定，獲得GHS(pyrG+)重組菌株.

CA14PTs(Δku70ΔpyrG)為出發(fā)菌株，GHS(pyrG+)為按常規(guī)方法以pyrG作為遺傳篩選標(biāo)記對黃曲霉sumO基因位點改造后的重組菌株，GHS(pyrG-)為pyrG篩選標(biāo)記被剔除后的黃曲霉sumO基因位點改造重組菌株.“5′-UTR”表示黃曲霉sumO基因上游非轉(zhuǎn)錄區(qū)DNA片段，“pyrG”表示來源于煙曲霉的表達元件，“gpdA(p)”表示來源于構(gòu)巢曲霉的3′-磷酸甘油醛脫氫酶基因啟動子序列，“HA”表示來源于流感病毒的紅細胞凝集素表面抗原決定簇HA標(biāo)簽蛋白編碼序列，“sumO CDS”表示來源于黃曲霉的翻譯產(chǎn)物為SumO蛋白的編碼核苷酸序列，“3′-UTR”表示黃曲霉sumO基因下游非翻譯區(qū)DNA片段.圖1 GHS(pyrG+)和GHS(pyrG-)重組菌株構(gòu)建策略示意圖Fig.1 Schematic diagram of the strategy for the construction of GHS(pyrG+) and GHS(pyrG-) strains

1.3 pyrG遺傳篩選標(biāo)記的剔除

以GHS(pyrG+)重組菌株為受體菌，剔除pyrG篩選標(biāo)記，構(gòu)建GHS(pyrG-)重組菌株，構(gòu)建策略如圖1所示.步驟如下：利用引物P1和P11從黃曲霉GHS(pyrG+)重組菌株基因組中擴增長度為1 171 bp的sumO基因上游非轉(zhuǎn)錄區(qū)5′-UTR片段；利用P12和P6從黃曲霉GHS(pyrG+)重組菌株基因組中擴增長度為1 510 bp的3′-磷酸甘油醛脫氫酶基因啟動子gpdA(p)片段；將上述兩個片段用重疊PCR法連接到一起，用巢式引物P9和P13擴增長度為2 372 bp的融合片段5′-UTR-gpdA(p)，轉(zhuǎn)化黃曲霉GHS(pyrG+)重組菌株原生質(zhì)體，在含有2 mg·mL-15-氟乳清酸、1 mg·L-1尿苷和1 mg·L-1尿嘧啶的復(fù)蘇培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)3 d.抽提轉(zhuǎn)化子基因組DNA，用引物P3和P4擴增pyrG片段進行PCR鑒定，用引物P9和P13擴增5′-UTR-gpdA(p)片段并用引物P9進行測序分析.

1.4 營養(yǎng)缺陷表型觀察

取103個黃曲霉GHS(pyrG-)重組菌株陽性轉(zhuǎn)化子的新鮮孢子，分別接種于YGT和YGTUU固體培養(yǎng)基平板的中心點，37 ℃持續(xù)培養(yǎng)3 d，用佳能IXUS相機(16.1 MEGA PIXELS)觀察并拍照.

1.5 免疫雜交分析

黃曲霉總蛋白的提取、電泳和免疫雜交方法參考文獻[5].

2 結(jié)果與分析

2.1 表達HA-SumO的黃曲霉重組菌株GHS(pyrG+)的構(gòu)建

構(gòu)建GHS(pyrG+)重組菌株的過程如圖2A所示.將5′-UTR-pyrG-gpdA(p)-HA-sumOCDS-3′-UTR融合片段轉(zhuǎn)化黃曲霉CA14PTs(Δku70ΔpyrG)菌株原生質(zhì)體，并篩選、鑒定GHS(pyrG+)陽性轉(zhuǎn)化子，抽提總蛋白并用HA標(biāo)簽抗體和Actin抗體進行Western blot免疫雜交，分析黃曲霉GHS(pyrG+)重組菌株中的HA-SumO的表達水平和SUMO化修飾狀態(tài)，結(jié)果如圖2B所示.GHS(pyrG+)重組菌株中可以檢測到HA-SumO蛋白單體的條帶，被SUMO化修飾的多種靶標(biāo)蛋白條帶也能被檢測到，呈現(xiàn)階梯狀分布，而對照CA14PTs(Δku70ΔpyrG)菌株和WT(Δku70)菌株中都檢測不到特異性雜交條帶.

A.構(gòu)建5′-UTR-pyrG-gpdA(p)-HA-sumO CDS-3′-UTR融合片段的瓊脂糖凝膠電泳圖譜(M為DS10 000 DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，泳道1為長度約1.2 kb的sumO基因上游非轉(zhuǎn)錄區(qū)5′-UTR片段，泳道2為長度約1.9 kb的pyrG表達元件，泳道3為長度約1.5 kb的gpdA(p)片段，泳道4為長度約0.6 kb的HA-sumO CDS-3′-UTR片段，泳道5為長度約5.2 kb的5′-UTR-pyrG-gpdA(p)-HA-sumO CDS-3′-UTR融合片段)；B.免疫雜交檢測GHS(pyrG+)重組菌體內(nèi)的SUMO化修飾狀態(tài)[泳道1為CA14PTs(Δku70ΔpyrG)菌株總蛋白，泳道2為WT(Δku70)菌株總蛋白，泳道3為GHS(pyrG+)重組菌株總蛋白].圖2 GHS(pyrG+)重組菌株的構(gòu)建和驗證Fig.2 Construction and identification of the GHS(pyrG+) strain

2.2 GHS(pyrG+)重組菌株中pyrG遺傳篩選標(biāo)記的剔除

分別從黃曲霉GHS(pyrG+)重組菌株基因組中擴增長度約1.2 kb的sumO基因上游非轉(zhuǎn)錄區(qū)5′-UTR片段和1.5 kb的3′-磷酸甘油醛脫氫酶基因啟動子gpdA(p)片段(圖3A)，并用重疊PCR法連接到一起，以巢式引物P9和P13擴增長度約2.4 kb的融合片段5′-UTR-gpdA(p)(圖3B)，轉(zhuǎn)化黃曲霉GHS(pyrG+)原生質(zhì)體，并篩選、鑒定GHS(pyrG-)重組菌株陽性轉(zhuǎn)化子.經(jīng)鑒定，挑取的12個轉(zhuǎn)化子中有3個為陽性轉(zhuǎn)化子，陽性率為25%.如圖3C所示，用引物P3和P4進行PCR擴增，GHS(pyrG+)基因組DNA中可擴增出約1.9 kb的pyrG片段，而T3#、T7#和T11#轉(zhuǎn)化子的基因組和陰性對照中則無法擴增pyrG片段；同時，利用引物P9對轉(zhuǎn)化子T3#、T7#和T11#中擴增出的5′-UTR-gpdA(p)片段進行測序分析表明，陽性轉(zhuǎn)化子的5′-UTR-gpdA(p)片段的實際序列與理論序列一致(圖3D).這些結(jié)果說明：GHS(pyrG+)基因組上整合的pyrG篩選標(biāo)記已被剔除，且剔除過程不依賴pyrG篩選標(biāo)記兩端的同向重復(fù)序列，剔除pyrG篩選標(biāo)記后GHS(pyrG-)陽性轉(zhuǎn)化子基因組上也未殘留重復(fù)序列；除了pyrG篩選標(biāo)記外，GHS(pyrG-)陽性轉(zhuǎn)化子與GHS(pyrG+)菌株的遺傳背景一致.

A.PCR擴增5′-UTR片段(泳道1)和gpdA(p)片段(泳道2)的瓊脂糖凝膠電泳圖譜(M為DS2 000 DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn))；B.重疊PCR擴增>5′-UTR-gpdA(p)融合片段(泳道1、2)的瓊脂糖凝膠電泳圖譜(M為DS5 000 DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn))；C.GHS(pyrG-)重組菌株陽性轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定[M為DS2 000 DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，泳道1的模板為蒸餾水，泳道2和3的模板為CA14PTs(Δku70ΔpyrG)菌株基因組，泳道4的模板為GHS(pyrG+)重組菌株基因組，泳道5、6和7的模板分別為GHS(pyrG-)重組菌株T3#、T7#和T11#轉(zhuǎn)化子基因組]；D.GHS(pyrG-)重組菌株陽性轉(zhuǎn)化子基因組擴增5′-UTR-gpdA(p)產(chǎn)物測序結(jié)果的序列比對.圖3 GHS(pyrG-)重組菌株的構(gòu)建和篩選Fig.3 Construction and identification of the GHS(pyrG-)strain

2.3 GHS(pyrG-)重組菌株的pyrG營養(yǎng)缺陷表型

轉(zhuǎn)化子T3#、T7#和T11#在YGTUU固體培養(yǎng)基上能夠正常生長出細密的菌絲，而在YGT固體培養(yǎng)基上則不能正常生長，呈現(xiàn)尿嘧啶營養(yǎng)缺陷表型(圖4A).這一結(jié)果證明，GHS(pyrG-)陽性轉(zhuǎn)化子T3#、T7#和T11#的營養(yǎng)缺陷型是正確的.

A.GHS(pyrG-)重組菌株陽性轉(zhuǎn)化子的尿嘧啶營養(yǎng)缺陷表型鑒定；B.免疫雜交分析GHS(pyrG-)重組菌株陽性轉(zhuǎn)化子的SUMO化修飾狀態(tài)[泳道1為蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，泳道2為GHS(pyrG+)重組菌株總蛋白，泳道3為WT(Δku70)菌株總蛋白，泳道4、5和6分別為GHS(pyrG-)重組菌株轉(zhuǎn)化子T3#、T7#和T11#的總蛋白].圖4 GHS(pyrG-)重組菌株的性狀表型和SUMO化修飾狀態(tài)Fig.4 Phenotype and SUMO modification status of the GHS(pyrG-) strain

2.4 GHS(pyrG-)重組菌株的HA-SumO的表達水平

分別提取WT(Δku70)菌株、GHS(pyrG+)重組菌株以及GHS(pyrG-)陽性轉(zhuǎn)化子T3#、T7#和T11#的總蛋白，利用HA標(biāo)簽抗體進行免疫雜交分析，從蛋白水平上比較pyrG篩選標(biāo)記剔除前后SUMO化修飾狀態(tài)是否有差異，并以SDS-PAGE考馬斯亮藍染色結(jié)果作為上樣量對照.從試驗結(jié)果來看，WT(Δku70)菌株檢測不到特異性雜交條帶，而GHS(pyrG+)重組菌株和GHS(pyrG-)陽性轉(zhuǎn)化子T3#、T7#和T11#都特異性地表達了HA-SumO單體蛋白，體內(nèi)還有許多被SUMO化修飾的不同分子質(zhì)量的靶標(biāo)蛋白，呈現(xiàn)階梯式的分布，且GHS(pyrG+)重組菌株和GHS(pyrG-)各個陽性轉(zhuǎn)化子SumO的表達量和表達模式之間沒有差異(圖4B).這些結(jié)果說明，按本研究的方法剔除pyrG篩選標(biāo)記不影響菌株的蛋白表達模式.

3 討論

本研究建立了一種新的乳清酸核苷-5′-磷酸脫羧酶基因pyrG遺傳篩選標(biāo)記循環(huán)利用的方法，僅需一個pyrG遺傳篩選標(biāo)記的循環(huán)利用即可實現(xiàn)多次遺傳轉(zhuǎn)化操作，避免了不同遺傳篩選標(biāo)記的差異對真菌遺傳背景和性狀的影響；同時，該方法在剔除基因組中的pyrG遺傳篩選標(biāo)記時不需要依賴同向重復(fù)序列和在URA/pyrG兩端插入重復(fù)序列，操作簡單易行，且剔除pyrG篩選標(biāo)記后在基因組上不會殘留重復(fù)序列.

由于許多真菌都以URA3/pyrG作為遺傳篩選標(biāo)記，本方法除了用于黃曲霉外，也可應(yīng)用到以乳清酸核苷-5′-磷酸脫羧酶基因URA3/pyrG表達元件作為遺傳篩選標(biāo)記的其他真菌中(應(yīng)用方法如圖5所示)，使得重組菌株重新獲得尿嘧啶營養(yǎng)缺陷，再次作為出發(fā)菌株循環(huán)利用URA3/pyrG篩選標(biāo)記進行遺傳轉(zhuǎn)化，為多基因、多位點的真菌遺傳改造提供支持.

“X DNA”表示真菌基因組上需要利用pyrG進行改造的任一DNA片段，“up”和“down”分別表示pyrG整合位點上游和下游DNA片段.圖5 pyrG篩選標(biāo)記循環(huán)利用示意圖Fig.5 Schematic diagram for the pyrG selectable marker recycling system