楊 帆, 李優(yōu)佳, SHAMEER K S, 閻 偉, 呂寶乾, 蔣方一丁, 章雨璐, 涂 艷, 齊可欣

(1.海南大學林學院，海南 ?？?570228；2.熱帶特色林木花卉遺傳與種質創(chuàng)新教育部重點實驗室,海南海口 570228；3.Insect Ecology & Ethology Laboratory, Department of Zoology, University of Calicut,Calicut 673635, India; 4.中國熱帶農業(yè)科學院椰子研究所，海南 文昌 571339；5.中國熱帶農業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所，海南 海口 571101)

我國高溫、高濕的熱帶地區(qū)自然氣候條件十分優(yōu)越，生物資源多種多樣，為外來入侵物種的定殖、擴散和暴發(fā)提供了適宜的氣候和食物條件[1-2].椰子織蛾(OpisinaarenosellaWalker)來源于印度和斯里蘭卡，是近年來發(fā)現(xiàn)危害熱帶棕櫚科植物的重要入侵食葉害蟲.該蟲最早于19世紀中期被發(fā)現(xiàn)，此后相繼在緬甸、印度、孟加拉、印度尼西亞、泰國、馬來西亞、巴基斯坦等地發(fā)現(xiàn)其危害[3-5]；2013年入侵我國，現(xiàn)已擴散至海南、廣西、福建和廣東等地[6-8],嚴重影響椰子種植業(yè)的發(fā)展以及城市公共綠地的美觀.鑒于其危害性，中華人民共和國國家林業(yè)局2014年正式把椰子織蛾列為危險性有害生物[9]，2019年該蟲被認定為三級危害性林業(yè)有害生物[10].國內外學者對椰子織蛾的研究主要集中在防治方面，有關其發(fā)生趨勢的有效監(jiān)測報道較少.明確椰子織蛾的入侵信息可有針對性地進行監(jiān)測預警,從而有利于綜合防控措施的實施[11]，因此，準確把握該蟲入侵來源是對其防控技術研發(fā)與應用的科學基礎[12].

線粒體DNA因具有缺乏重組、突變率高、單倍體母系遺傳等特點，被作為分子標記廣泛應用于昆蟲種群遺傳變異和系統(tǒng)地理學的研究[13-14].學者已基于COⅠ基因分析了椰子織蛾不同地理種群的單倍型特征，其原產地與入侵地的單倍型存在一定的差異[15]，但未系統(tǒng)深入分析.本研究利用COⅠ、COⅡ和COⅢ 3個基因片段分析原產地與入侵地椰子織蛾種群的遺傳分化特征，以期為實施有效的檢驗檢疫措施和監(jiān)測其入侵動態(tài)提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 樣本來源

于2018—2019年在原產地(印度)和入侵地(中國、馬來西亞、泰國和印度尼西亞)采集椰子織蛾樣品，將采集的新鮮樣品儲存于無水乙醇中，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?選取其中107份樣品進行試驗，其來源地見表1.

表1 原產地和入侵地椰子織蛾樣品信息Table 1 Information of O.arenosella samples from the place of origin and invasive areas

1.2 基因組DNA提取及PCR擴增和測序

根據(jù)MagBeads Tissues Gen DNA Extraction Kit試劑盒說明書提取基因組DNA.所有樣品的DNA質量在超微量紫外分光光度計下測定，D260 nm/D280 nm值均在1.7～2.0之間，將提取的DNA稀釋至500 ng·μL-1后保存在-20 ℃冰箱備用.

根據(jù)椰子織蛾線粒體基因組的序列[16]，分別設計COⅠ、COⅡ和COⅢ基因擴增片段的特異性引物，引物序列詳見表2.各基因PCR反應體系為20 μL，包括2×Taq Plus Master Mix 10.0 μL、上游引物0.8 μL、下游引物0.8 μL、Template 1.0 μL (0.1 μg)、ddH2O 7.4 μL.PCR反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，15個循環(huán)(每個循環(huán)降1 ℃)之后95 ℃預變性30 s，50 ℃變性30 s，72 ℃退火60 s，28個循環(huán)，72 ℃延伸10 min，最后修復延伸10 min.PCR產物測序委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成.

表2 椰子織蛾mtDNA-COⅠ、COⅡ和COⅢ基因片段引物Table 2 Primers for mtDNA-COⅠ、COⅡ and COⅢ gene fragments of O.arenosella

1.3 系統(tǒng)發(fā)育樹的構建

利用BioEdit軟件對3個基因序列進行比對和人工修正，去除兩端低質量序列并區(qū)分雜合位點，以獲得準確的基因片段序列[17].使用MEGA 6.0軟件[18]分析序列的堿基組成和多態(tài)位點，并選取Kimura-2參數(shù)模型，以鄰接(neighbor joining, NJ)法構建不同地理種群的系統(tǒng)進化樹，系統(tǒng)樹各分支的置信度用自舉檢驗法(bootstrap)檢驗，共進行1 000次循環(huán).利用PhyloSuite中的MrBayes[19]構建BI(Bayesian inference)樹，依據(jù)ModelFinder[20]選擇最佳替換模型為GTR+F.

2 結果與分析

通過基因序列比對分析，獲得12個不同地理種群的107條COⅠ、COⅡ和COⅢ基因序列.經過拼接和引物刪除，COⅠ、COⅡ和COⅢ基因序列片段長度分別為1 362、623和687 bp.從COⅠ基因序列鑒定出4種基因型(圖1A)，從COⅡ和COⅢ基因序列分別鑒定出3種基因型(圖1B、1C).來自中國、馬來西亞、泰國和印度尼西亞的椰子織蛾種群均為同一種基因型.

將COⅠ、COⅡ和COⅢ 3個基因片段序列拼接，序列比對顯示其共包含35個變異位點，其中97%為堿基轉換，3%為堿基顛換.在核苷酸組成上，原產地與入侵地種群的A、T、C和G的平均含量均分別為31.3%、41.7%、14.5%和12.5%，共存在34個變異位點，38%為嘌呤轉換，62%為嘧啶轉換.

將本研究測定的3個線粒體基因序列進行拼接，并以白胸織蛾(Endrosissarcitrella)COⅠ+COⅡ+COⅢ序列為外群，分別構建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹和貝葉斯樹(圖2).結果表明：所有入侵地的椰子織蛾基因序列聚成一支，支持率為100%；入侵地與原產地椰子織蛾種群形成兩個明顯的分支，遺傳距離為1.3%(表3).

3 討論

COⅠ、COⅡ、COⅢ是線粒體中最為保守的基因, 同源性為80%左右,所以其序列可作為研究物種系統(tǒng)進化和分類的有效分子標記[21].本研究選取COⅠ、COⅡ和COⅢ基因對原產地與入侵地椰子織蛾種群進行檢測，A、T、C、G核苷酸的分布呈現(xiàn)非均一性，原產地與入侵地種群的各堿基占比相同.在35個核苷酸變異位點中，堿基轉換發(fā)生的頻率遠高于顛換，該結果符合線粒體基因組進化規(guī)律.

本研究表明，入侵地區(qū)的椰子織蛾線粒體COⅠ、COⅡ和COⅢ基因與原產地種群基因的遺傳距離為1.3%，低于普遍接受的種間遺傳距離[13,22-24].系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，椰子織蛾存在兩個遺傳支系，即原產地支系與入侵地支系，表明椰子織蛾種群已出現(xiàn)明顯的遺傳分化.如果這兩個支系在形態(tài)和行為上出現(xiàn)差異，從進化的角度來說，可能發(fā)展為兩個亞種.例如：與此類似的入侵害蟲美國白蛾(Hyphantriacunea)，在其原產地存在兩種幼蟲頭殼色型[25]；草地貪蛾(Spodopterafrugiperda)在原產地美洲長期進化過程中分化成兩種生態(tài)型[26-27].

入侵地區(qū)椰子織蛾線粒體單倍型的多樣性較低，而原產地種群則不然.這種低遺傳多樣性通常是由初始的少數(shù)個體直接造成的，這些初始種群在入侵的早期階段會受到強烈的遺傳漂變或奠基者效應的影響[28]，種群經歷的奠基者效應越多，其遺傳多樣性喪失越多[29].有研究認為該過程并非是不利的：一方面，通過遺傳漂變和小種群中的非隨機交配可以清除種群中的有害等位基因[30]；另一方面，入侵地種群受環(huán)境選擇壓力的影響在新棲息地產生新的突變或雜交，可能預示這個物種侵占新領地的進化潛力.從寄主范圍來看，椰子織蛾在其原產地主要危害椰子、海棗、董棕、油棕、野生棗椰、甘藍椰子[31-32]，入侵后，該蟲還可危害多種景觀樹木，如酒瓶椰子、大王棕、銀海棗、檳榔等[33-34]，寄主范圍進一步擴大.可見，椰子織蛾在與新環(huán)境中寄主植物的互作過程中產生了遺傳變異和分化，以適應不同的環(huán)境，進而擴大了其分布范圍.

入侵我國不同地區(qū)的椰子織蛾種群在線粒體基因組水平上未出現(xiàn)堿基變異，可能是由于其傳入時間較短，尚未產生遺傳分化.入侵我國的椰子織蛾與馬來西亞、泰國以及印度尼西亞種群聚為一支，且它們具有完全一樣的基因型，而該蟲入侵馬來西亞、泰國以及印度尼西亞的時間較我國早，推測入侵我國的椰子織蛾種群可能來源于這些國家.