安飛飛, 崔夢佳, 楊 龍, 陳松筆

(1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所/農(nóng)業(yè)部木薯種質(zhì)資源保護與利用重點實驗室,海南 海口 571101；2.南京農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院,江蘇 南京 210000；3.貴州省亞熱帶作物研究所,貴州 興義 562400)

木薯(ManihotesculentaCrantz)是世界亞熱帶和熱帶地區(qū)近10億人的主要糧食作物，在世界糧食安全、生物質(zhì)能源和食品加工等領(lǐng)域扮演著不可替代的角色[1,2].然而木薯塊根采后24～72 h內(nèi)周邊部位出現(xiàn)褐色或藍黑色斑點，失去其加工價值，這種現(xiàn)象稱之為“采后生理性腐爛”(post-harvest physiological deterioration, PPD)[3-5].PPD現(xiàn)象極大影響了木薯的開發(fā)利用，成為制約木薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重大瓶頸.研究表明木薯塊根活性氧積累和快速迸發(fā)是產(chǎn)生PPD的主要原因[6-8]，影響PPD產(chǎn)生的代謝通路涉及氧化脅迫[9-11]、鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細胞凋亡[12]、乙烯和苯丙酸通路[13]、MAPK(胞外信號調(diào)節(jié)激酶)cascades[14]、蛋白質(zhì)N-糖基化修飾通路[15].但至今尚未有一種行之有效的方法可用于抑制木薯塊根PPD[16].因此，解析木薯PPD產(chǎn)生的分子機制，選育耐PPD的木薯品種，是今后木薯塊根綜合利用的研究熱點，也是全球木薯育種家面臨的挑戰(zhàn).

蛋白質(zhì)N-糖基化修飾是真核生物蛋白質(zhì)翻譯后修飾的一種重要手段，參與細胞識別、分化、發(fā)育、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和免疫應(yīng)答等多個重要的生命過程[1]〗.β-1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(Galt)是參與蛋白質(zhì)N-糖基化修飾過程的關(guān)鍵酶，Galt1是形成糖蛋白中Lewis a結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵酶，在植物應(yīng)對環(huán)境脅迫中起著重要作用[18]，但其在木薯塊根PPD中的功能尚未清晰.我們前期研究發(fā)現(xiàn)，隨著木薯塊根腐爛加重，Galt活性也隨之增高.為進一步研究MeGalt1在木薯PPD過程中的作用機制，本研究在克隆木薯MeGalt1基因的基礎(chǔ)上，分析MeGalt1基因在不同采后生理腐爛程度塊根中的表達變化，并構(gòu)建相關(guān)的植物表達載體，為進一步解析MeGalt1在木薯塊根采后生理腐爛中的分子作用機制提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

本研究選用的材料TMS 60444、華南9號(SC9)來自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所國家木薯種質(zhì)資源圃，于植后9個月收獲木薯塊根進行試驗.

1.2 方法

1.2.1 試驗處理 植后9個月收獲SC9塊根，置于26 ℃、相對溫度為55%～60%的恒溫培養(yǎng)箱中，于3、6、9 d對塊根PPD程度進行觀察并取樣，每次取3個重復(fù)，經(jīng)液氮速凍后，保存于-80 ℃?zhèn)溆?

1.2.2 RNA提取與cDNA合成 參照RNA提取試劑盒(DP441)提取木薯塊根總RNA，利用北京全式金公司生產(chǎn)的第一鏈cDNA合成試劑盒(AT311-02)將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20 ℃儲存?zhèn)溆?

1.2.3 引物設(shè)計與實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR) 用Primer 5.0設(shè)計MeGalt1全長擴增及定量PCR引物，由廣州艾基生物技術(shù)有限公司進行合成.引物序列如下表1所示.MeGalt1基因全長擴增正向、反向引物分別帶有KpnⅠ和SpeⅠ酶切位點及保護堿基，可用于植物表達載體的構(gòu)建.RT-PCR采用TaKaRa公司生產(chǎn)的SYBR試劑盒(RR820A)，按說明在Thermo Fisher Scientific公司生產(chǎn)的 Real-time Thermal Cycler上操作，反應(yīng)程序為:95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃ 10 s，55 ℃ 10 s，72 ℃ 20 s，40個循環(huán).每個樣品重復(fù)3次，相對表達量按ΔΔCT法進行計算.

表1 木薯MeGalt1的全長擴增及實時熒光定量PCR引物Table 1 Primers of the MeGalt1 gene for PCR and RT-PCR

1.2.4 N-糖基化修飾的Western Blot檢測 參照Carvalho et al[19]方法利用專一性識別糖蛋白中Lewis a結(jié)構(gòu)的JIM84抗體[18]對PPD過程中的N-糖基化修飾水平進行驗證.取1.5 g木薯塊根，經(jīng)丙酮沉淀后進行Western blot驗證.

1.2.5 生物信息學分析 采用Clustal X軟件進行序列比對；采用ExPASy ProtParam軟件分析蛋白質(zhì)的分子量和等電點；采用Mega 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.

1.2.6 植物表達載體構(gòu)建 用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和SpeⅠ分別對含有目的基因MeGalt1-1和MeGalt1-3的重組質(zhì)粒和植物表達載體pCAMBIA1300r進行雙酶切.酶切體系20.0 μL:dd H2O 14.0 μL，質(zhì)粒3.0 μL，10×Fast Digest Buffer 2.0 μL，KpnⅠ和SpeⅠ各0.5 μL，37 ℃反應(yīng)3 h，65 ℃ 10 min.反應(yīng)產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，分別回收MeGalt1-1和MeGalt1-3目的片段和pCAMBIA1300r載體片段，用T4連接酶將目的基因片段和植物表達載體片段進行連接，16 ℃過夜反應(yīng)；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10，篩選陽性克??；進行PCR及雙酶切驗證，測序，構(gòu)建植物表達載體pCAMBIA1300r-MeGalt1-1和pCAMBIA1300r-MeGalt1-3.

2 結(jié)果與分析

2.1 木薯塊根采后不同時間點PPD觀察

SC9木薯塊根置于26 ℃恒溫箱，分別在第0、3、6、9 d取樣觀察，其表型如圖1所示，采后第0天，木薯塊根水分含量充足有光澤，沒有PPD現(xiàn)象；采后第3天，塊根出現(xiàn)輕微變質(zhì)，橫切面上外圍出現(xiàn)了黑色斑塊；采后第6天，塊根出現(xiàn)了較大面積變質(zhì)，面積約占橫切面的1/3；采后第9天，塊根整個橫切大部分均出現(xiàn)PPD變質(zhì)現(xiàn)象，且塊根出現(xiàn)了裂縫.

A：0 d；B：3 d；C：6 d；D：9 d.圖1 SC9采后常溫不同時間點PPD情況Fig.1 PPD of cassava SC9 at different time periods

2.2 木薯MeGalt1基因的克隆

以擬南芥AtGalt1序列(At1g26810)為基礎(chǔ)，在木薯數(shù)據(jù)庫中尋找與其同源的序列(Manes.01G091600, Manes.01G036300, Manes.05G102300)，分別命名為MeGalt1-1、MeGalt1-2、MeGalt1-3.設(shè)計特異性引物,以木薯TMS 60444塊根cDNA為模板，進行PCR擴增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得1條約2 000 bp的單一條帶(圖2).回收PCR產(chǎn)物連接Blunt Zero載體，測序比對后發(fā)現(xiàn)MeGalt1-1與Phytozome數(shù)據(jù)庫木薯基因組(栽培品種：AM560)公布的Manes.01G091600序列一致，MeGalt1-2與Manes.01G036300有6個堿基的差異，同源性高達 99.7%，MeGalt1-3與Manes.05G102300只有1個堿基的差異，同源性高達99.9%.其編碼的氨基酸、預(yù)測的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量及理論等電點如表2所示.UniProt數(shù)據(jù)庫顯示MeGalt1-1、MeGalt1-2和MeGalt1-3編碼的蛋白均含有半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的保守結(jié)構(gòu)域(PF01762)，這進一步表明克隆到的基因為MeGalt1基因.

M:DL2000 marker;1:MeGalt1-1基因;2:MeGalt1-2基因;3:MeGalt1-3基因.圖2 MeGalt1基因PCR電泳結(jié)果Fig.2 Electrophoresis of PCR products of the MeGalt1 gene

表2 木薯MeGalt1的基本信息Table 2 Basic information of the MeGalt1 gene

2.3 基因MeGalt進化分析

以擬南芥中6個編碼Galt的蛋白序列為參考，在Phytozome木薯數(shù)據(jù)庫中進行比對，得到9個MeGalt基因，將其氨基酸序列與擬南芥編碼Galt的序列進行比對并進行進化分析(圖3).圖中可以看出在木薯中編碼MeGalt1的有3個基因(MeGalt1-1、MeGalt1-2、MeGalt1-3)，根據(jù)擬南芥中AtGalt1的功能，可推測木薯中這3個基因與蛋白質(zhì)N-糖基化修飾中Lewis a結(jié)構(gòu)形成密切相關(guān).

◆木薯中編碼MeGalt1的3個基因.圖3 MeGalt1基因系統(tǒng)進化分析Fig.3 Phylogenetic tree of the MeGalt1 gene

2.4 MeGalt1在木薯PPD過程中的表達分析

利用RT-PCR技術(shù)對MeGalt1基因在木薯塊根PPD過程中的表達情況進行分析(圖4).隨著時間的推移，MeGalt1-2基因無顯著變化，MeGalt1-1及MeGalt1-3基因表達顯著增強，且MeGalt1-3基因表達變化最顯著.基于上述結(jié)果，推測參與木薯塊根PPD調(diào)控過程的基因為MeGalt1-1和MeGalt1-3.

2.5 木薯塊根PPD過程中蛋白質(zhì)的N-糖基化修飾水平檢測

為進一步檢測木薯塊根PPD過程中蛋白質(zhì)是否存在N-糖基化修飾水平的變化，利用專一性識別糖基化蛋白的抗體JIM84檢測SC9木薯采后不同時間(0、3、6、9 d)塊根中N-糖基化修飾水平情況(圖5).在采后3～9 d，約25和35 ku的蛋白質(zhì)發(fā)生明顯的N-糖基化修飾，證明木薯塊根PPD過程受到蛋白質(zhì)N-糖基化修飾的調(diào)控.本研究結(jié)果可為開展后續(xù)研究提供依據(jù).

2.6 木薯MeGalt1表達載體的構(gòu)建

用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ、SpeⅠ分別對含有目的基因MeGalt1-1和MeGalt1-3的重組質(zhì)粒和植物表達載體pCAMBIA1300r質(zhì)粒進行雙酶切反應(yīng)，連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細胞，提取質(zhì)粒經(jīng)PCR檢測，電泳獲得約2 000 bp的條帶.同時，提取質(zhì)粒并進行雙酶切反應(yīng)，分別獲得約10 000 bp的載體和約2 000 bp的條帶(圖6)，2種驗證方法都獲得與目的基因片段長度一致的條帶.經(jīng)進一步測序驗證，明確為MeGalt1-1和MeGalt1-3基因，表明已成功構(gòu)建pCAMBIA1300r-MeGalt1-1和pCAMBIA1300r-MeGalt1-3植物過表達載體.

M:DL15000 marker;1:pCAMBIA1300r-MeGalt1-1雙酶切;2:pCAMBIA1300r-MeGalt1-3雙酶切.圖6 植物表達載體pCAMBIA1300r-MeGalt1-1和pCAMBIA1300r-MeGalt1-3示意圖(A)及雙酶切驗證(B)Fig.6 Schematic diagram of pCAMBIA1300r-MeGalt1-1 and pCAMBIA1300r-MeGalt1-3 (A) and verification by restriction enzyme digestion (B)

3 討論

β-1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(Galt)是參與N-聚糖加工及蛋白質(zhì)糖基化修飾的關(guān)鍵酶.目前已經(jīng)從多個物種中克隆了Galt基因[20,21]，然而在熱帶作物木薯中還沒有關(guān)于Galt基因克隆的報道.本研究從木薯TMS 60444中克隆了3個Galt1基因MeGalt1-1，MeGalt1-2和MeGalt1-3，分別具有1 890、1 893和1 902 bp的開放閱讀框，編碼629、629和633個氨基酸，與其他物種中的Galt1大小基本一致.

構(gòu)建植物表達載體是基因功能驗證的主要手段之一.通過構(gòu)建N-糖基化修飾過程中不同基因的植物表達載體，可驗證這些基因的生物學功能.Strasser et al[18]通過構(gòu)建AtGalt1過表達載體，驗證AtGalt1與N-糖中Lewis a結(jié)構(gòu)形成密切相關(guān).Ghosh et al[22]與Meli et al[23]通過構(gòu)建RNAi干擾載體，驗證抑制N-糖加工酶活性可延緩果實成熟.Liebminger et al[24]研究表明，N-聚糖加工酶MNS在擬南芥根系形成發(fā)育過程中起到重要作用[24].

木薯PPD現(xiàn)象是一種生理性病害，其產(chǎn)生是一個復(fù)雜的生物學過程，涉及到多個代謝通路[10].利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)過量表達活性氧清除基因MeCu/ZnSOD和MeCAT1，轉(zhuǎn)基因植株塊根的丙二醛、葉綠素降解、脂質(zhì)過氧化和H2O2積累水平與對照相比顯著降低，達到延緩PPD超過10 d的效果[25].Zidenga et al[26]采用轉(zhuǎn)基因方法過量表達AOX1A基因，顯示轉(zhuǎn)基因植株活性氧積累水平比對照降低10倍，從而使采后塊根的PPD發(fā)生延緩了14～21 d.Vanderschuren et al[13]通過轉(zhuǎn)基因方法過量表達胞質(zhì)谷胱甘肽過氧化物酶基因，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株塊根能延緩PPD產(chǎn)生，減少脂質(zhì)過氧化和H2O2積累.Beyene et al[27]通過DXS和crtB共表達提高β-胡蘿卜素在木薯塊根的積累，與非轉(zhuǎn)基因植株對照相比，置于常溫10 d沒有PPD現(xiàn)象，而對照腐爛變質(zhì)程度達到50%.前期研究表明N-聚糖加工酶α-甘露糖苷酶(MeMNSs)與木薯PPD過程存在相關(guān)性[15]，且N-糖基化修飾參與了木薯PPD調(diào)控過程，但其具體的分子調(diào)控機理尚待進一步明確.我們前期研究發(fā)現(xiàn)，隨著木薯塊根腐爛加重，Galt活性隨之增高.本研究表明MeGalt1-1及MeGalt1-3基因表達隨著采后生理腐爛程度的加深而顯著增強，進一步證實MeGalt表達與木薯PPD過程存在相關(guān)性.在此基礎(chǔ)上成功構(gòu)建木薯Galt1-1和Galt1-3基因表達載體pCAMBIA1300r-MeGalt1-1和pCAMBIA1300r-MeGalt1-3，為進一步研究該基因以及蛋白質(zhì)N-糖基化修飾在木薯采后生理腐爛過程中的生物學功能奠定了基礎(chǔ).