鄭鴻濤 劉子雄 魏 榮 謝國丹 董 海 譚貴良

(1. 中山市食品藥品檢驗(yàn)所，廣東 中山 528437；2. 電子科技大學(xué)中山學(xué)院，廣東 中山 528402)

油脂是人體必不可少的一種重要營養(yǎng)素。食用植物油經(jīng)精煉加工后，天然存在的抗氧化成分(如維生素E)會(huì)大量損失[1-2]；在貯藏、使用過程中，也極易與空氣中的氧氣發(fā)生氧化反應(yīng)，引起油脂酸敗變質(zhì)，從而產(chǎn)生對人體有毒有害物質(zhì)。油脂氧化是造成油脂變質(zhì)的主因，目前常用的阻止氧化反應(yīng)發(fā)生的方法是向油脂中添加抗氧化劑[3-4]，其中，合成抗氧化劑有2，6-二叔丁基對甲基苯酚(BHT)、叔丁基對羥基茴香醚(BHA)、叔丁基對苯二酚(TBHQ)、2，6-二叔丁基-4-羥甲基苯酚(Ionox-100)(其結(jié)構(gòu)式見圖1)等。動(dòng)物試驗(yàn)[5-7]表明，高劑量的苯酚類抗氧化劑會(huì)造成細(xì)胞凋亡、DNA裂解等潛在健康危害，隨著食品毒理學(xué)方法的發(fā)展，目前被認(rèn)為無害的食品添加劑可能存在慢性毒性和致畸、致突變、致癌性的危害。因此，國家衛(wèi)計(jì)委在GB 2760—2014中對抗氧化劑在食用植物油中的最大使用量作出了嚴(yán)格的限定。

GB 5009.32—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中9種抗氧化劑的測定》是檢驗(yàn)檢測機(jī)構(gòu)現(xiàn)行采用的抗氧化劑的國標(biāo)檢測方法。該標(biāo)準(zhǔn)的前處理凈化過程主要依賴于凝膠滲透色譜(GPC)，其操作繁瑣，有機(jī)溶劑消耗多，對環(huán)境污染大，一次性處理樣品量較少，無法實(shí)現(xiàn)高通量處理，而且GPC在各實(shí)驗(yàn)室中的應(yīng)用尚未普及。文獻(xiàn)[8-10]采用高效液相色譜(HPLC)法檢測食用油脂中的多種抗氧化劑，但其中涉及的前處理方法多采用液液分配直接進(jìn)樣，其過程需接觸大量有機(jī)溶劑；柱層析或固相萃取(SPE)凈化，需先對樣品進(jìn)行萃取和濃縮，再通過柱層析凈化，耗時(shí)較長。QuEChERS是一種快速、簡單、低成本的樣品前處理技術(shù)[11]。該技術(shù)很好地解決了傳統(tǒng)前處理方法操作繁瑣、環(huán)境污染大等問題，已被廣泛應(yīng)用于食品中農(nóng)藥殘留[12-13]和真菌毒素檢測[14-15]等方面，但應(yīng)用在同時(shí)測定花生油等多種油脂基質(zhì)中抗氧化劑的報(bào)道尚未見。景贊等[16]采用QuEChERS-氣相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜質(zhì)法(GC-MS/MS)檢測了花椒油中3種抗氧化劑(BHA、BHT、TBHQ)，結(jié)果表明樣品經(jīng)QuEChERS凈化后可有效去除干擾物質(zhì)，基質(zhì)效應(yīng)較小，但該方法中的串聯(lián)質(zhì)譜儀(MS/MS)設(shè)備昂貴，且檢測對象單一。研究擬采用QuEChERS前處理技術(shù)結(jié)合氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用(GC/MS)法開發(fā)一種快速檢測七大類食用植物油(花生油、菜籽油、玉米油、芝麻油、大豆油、葵花籽油和調(diào)和油)中4種合成抗氧化劑的方法，并對市售的21批次食用植物油進(jìn)行檢測，旨在為相關(guān)市場監(jiān)管部門對此類產(chǎn)品的監(jiān)管提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

花生油、菜籽油、玉米油、芝麻油、大豆油、葵花籽油、調(diào)和油7類食用植物油：市售；

乙腈：色譜純，德國Merck公司；

EMR-Lipid dSPE增強(qiáng)型脂質(zhì)去除凈化管(5982-1010)、EMR-Lipid polish反萃取管(5982-0101)：美國安捷倫科技有限公司；

圖1 4種合成抗氧化劑的結(jié)構(gòu)式Figure 1 Structural formula of 4 synthetic antioxidants

2，6-二叔丁基對甲基苯酚(BHT)標(biāo)準(zhǔn)品：純度98.8%，德國Dr.Ehrenstorfer公司；

叔丁基對羥基茴香醚(BHA)標(biāo)準(zhǔn)品：純度99.8%，德國Dr.Ehrenstorfer公司；

叔丁基對苯二酚(TBHQ)標(biāo)準(zhǔn)品：純度97.7%，德國Dr.Ehrenstorfer公司；

2，6-二叔丁基-4-羥甲基苯酚(Ionox-100)標(biāo)準(zhǔn)品：純度99.1%，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀：7890B/5977A型，配EI離子源，美國安捷倫科技有限公司；

冷凍離心機(jī)：3-18K型，德國Sigma公司；

數(shù)顯型渦旋混勻器：MS 3 digital型，德國IKA公司；

超聲儀：SCQ-7201E型，上海聲彥超聲波儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理

(1) 樣品提?。悍Q取1 g(精確至 0.001 g)食用植物油于50 mL離心管中，加入10 mL正己烷飽和的乙腈(或甲醇、無水乙醇、乙腈)，3 000 r/min渦旋震蕩2 min，超聲提取15 min，于3～8 ℃、10 000 r/min離心3 min，取上層液備用。

(2) 樣品凈化：移取5 mL上層液于EMR-Lipid dSPE凈化管(凈化管需先用1 mL純水活化)，3 000 r/min渦旋震蕩2 min，冷凍離心。

(3) 樣品反萃?。喝艋x心后的上層液(陰性樣液)3～4 mL分別加入到5982-0101、5982-0102兩種反萃取管中，3 000 r/min渦旋震蕩2 min，冷凍離心，上層液過0.22 μm 尼龍濾膜，收集濾液于樣品瓶中供GC/MS分析，考察不同組合QuEChERS對陰性樣品的凈化效果。

1.2.2 儀器分析條件

(1) 色譜條件：DB-35MS毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.250 mm×0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度280 ℃；不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣量1 μL；柱流速1.0 mL/min；載氣為高純氦氣(≥99.999%)；程序升溫：90 ℃，保持1 min，以20 ℃/min升溫至140 ℃，保持9 min，以30 ℃/min升溫至280 ℃，保持3 min。

(2) 質(zhì)譜條件：MSD傳輸線溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電離方式為EI；電子轟擊能量70 eV；溶劑延遲6 min；掃描方式為全掃描m/z50～550，掃描速率3.125 amu/s；數(shù)據(jù)采集類型為SIM，選擇離子峰面積外標(biāo)法進(jìn)行測定。

1.2.3 基質(zhì)效應(yīng)評價(jià) 參照蘇萌等[17-18]的方法。用乙腈溶劑配制標(biāo)液將花生油等7種空白食用植物油基質(zhì)在線性范圍內(nèi)配制成低、中、高不同濃度的基質(zhì)標(biāo)液進(jìn)行測試，評價(jià)4種合成抗氧化劑在各種食用植物油中產(chǎn)生的基質(zhì)效應(yīng)。

1.2.4 線性方程、檢出限與定量限測定 取7種食用植物油陰性樣品，采用基質(zhì)加標(biāo)曲線外標(biāo)法定量，按1.2.1的方法進(jìn)行前處理，制備0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0 μg/mL 的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，上機(jī)測定，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)、響應(yīng)值為縱坐標(biāo)繪制校準(zhǔn)曲線。以定量離子信噪比為3(S/N=3)和10(S/N=10)時(shí)的響應(yīng)定義4種抗氧化劑的方法檢出限(LOD)和定量限(LOQ)。

1.2.5 準(zhǔn)確度與精密度測定 采用菜籽油等7種不同類型空白食用植物油基質(zhì)，通過加標(biāo)測試計(jì)算各抗氧化劑在不同食用植物油中的回收率，以此驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確度；以5 μg低濃度添加水平在不同食用植物油基質(zhì)中進(jìn)行測試，計(jì)算各抗氧化劑在不同食用植物油基質(zhì)中6次平行測試結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，以此驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確度。

1.2.6 實(shí)際樣品驗(yàn)證 用試驗(yàn)建立的方法對市售的花生油、菜籽油、玉米油、芝麻油、大豆油、葵花籽油、調(diào)和油七大類食用植物油共21批次進(jìn)行上機(jī)檢測，驗(yàn)證試驗(yàn)方法的準(zhǔn)確性。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 使用安捷倫MSD ChemStation、Mass Hunter Workstatiom Software工作站軟件對研究的4種合成抗氧化劑的定量離子進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，峰面積外標(biāo)法定量，保留時(shí)間和定性離子進(jìn)行定性；用Excel軟件對樣品含量、精密度、回收率數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理過程優(yōu)化

試驗(yàn)的4種合成抗氧化劑均為極性物質(zhì)，極易溶于油脂及有機(jī)溶劑，如甲醇、無水乙醇、乙腈等。選用甲醇、無水乙醇、乙腈3種溶劑作為萃取劑，以加標(biāo)回收方式進(jìn)行比較，均獲得了不錯(cuò)的提取效果，但萃取凈化后甲醇萃取管壁上仍有掛壁油狀殘留物，說明乙醇和乙腈作為食用油中抗氧化劑的萃取劑其效果優(yōu)于甲醇，但由于乙醇極易揮發(fā)，不適合批量樣品的檢測，最終選擇不易揮發(fā)的乙腈作為研究抗氧化劑的萃取劑。參照GB 5009.32—2016以及Chattetjee等[19-20]的方法，由于正己烷和乙腈具有一定的互溶性，萃取前先將乙腈用正己烷進(jìn)行飽和處理，經(jīng)正己烷飽和的乙腈提取樣品中抗氧化劑時(shí)，可以減少萃取樣品中油脂等非極性的組分，從而達(dá)到更好的去脂效果，為后續(xù)EMR-Lipid dSPE凈化處理減負(fù)。由圖2 可知，5982-0101反萃取管的凈化效果較5982-0102反萃取管的更為顯著，因此采用5982-0101反萃取管進(jìn)一步除脂凈化。

2.2 基質(zhì)效應(yīng)評價(jià)

當(dāng)基質(zhì)效應(yīng)為80%～120%時(shí)，基質(zhì)效應(yīng)較弱，可忽略；當(dāng)基質(zhì)效應(yīng)<80%或>120%時(shí)，存在很強(qiáng)的基質(zhì)抑制或增強(qiáng)效應(yīng)，需用基質(zhì)匹配曲線進(jìn)行校正。由圖3可知，4種合成抗氧化劑在各食用植物油中的基質(zhì)效應(yīng)(增強(qiáng)或抑制)基本一致；各抗氧化劑濃度的變化對基質(zhì)效應(yīng)的影響不顯著；BHT、TBHQ、Ionox-100存在較強(qiáng)的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，BHA的基質(zhì)效應(yīng)并不明顯。為了盡可能地降低基質(zhì)效應(yīng)的干擾，采用空白基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)曲線對目標(biāo)物進(jìn)行定量分析。

圖2 經(jīng)兩種不同反萃取管凈化后的食用植物油總離子流色譜圖Figure 2 Chromatogram of total ion flow of edible vegetable oil purified by two different reverse extraction tubes

圖3 4種合成抗氧化劑的基質(zhì)效應(yīng)評價(jià)Figure 3 Matrix effect evaluation of 4 synthetic antioxidants

2.3 色譜條件優(yōu)化

分別選用HP-1MS、HP-5MS、DB-35MS 3種毛細(xì)管色譜柱(柱長均為30 m)進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明，3種色譜柱均能分離出4種抗氧化劑，但HP-1MS、HP-5MS毛細(xì)管色譜柱的響應(yīng)值較DB-35MS的低，且分離TBHQ時(shí)峰拖尾現(xiàn)象較為嚴(yán)重，影響低濃度目標(biāo)物的分析；采用DB-35MS分析4種抗氧化劑時(shí)，其響應(yīng)值、分離度和峰對稱性均較好，因此選用DB-35MS毛細(xì)管色譜柱進(jìn)行分析，并對色譜分離條件進(jìn)行優(yōu)化，測試分析得到4種合成抗氧化劑的標(biāo)準(zhǔn)離子流色譜圖如圖4所示。由圖4可知，DB-35MS毛細(xì)管色譜柱在17 min內(nèi)能有效分離4種合成抗氧化劑，其分離度好、分析時(shí)間短且能夠滿足方法要求。

2.4 質(zhì)譜條件優(yōu)化

根據(jù)質(zhì)譜圖上各碎片離子的響應(yīng)豐度，選擇3～5個(gè)豐度較高、質(zhì)荷較大的離子進(jìn)行SIM檢測以保證檢測結(jié)果的靈敏度和準(zhǔn)確性。圖5為BHT、BHA、TBHQ、Ionox-100 4種合成抗氧化劑全掃描得到的離子碎片圖，由圖5可知，離子205.1、165.1、166.1、221.1具有較高的響應(yīng)豐度和較大的質(zhì)荷比，可作為定量離子，220.2、206.2、180.1、137.0、123.0、151.1、236.1、222.2響應(yīng)豐度也較高，可作為定性離子；駐留時(shí)間的設(shè)定要確保每個(gè)目標(biāo)峰輪廓光滑，峰面積穩(wěn)定，最終確定如表1的質(zhì)譜參數(shù)為研究試驗(yàn)的質(zhì)譜參數(shù)。

圖4 4種合成抗氧化劑選擇離子TIC疊加圖Figure 4 Stack of four synthetic antioxidants selected by ion TIC

圖5 4種合成抗氧化劑離子碎片圖Figure 5 Four synthetic antioxidant ion fragments

表1 4種合成抗氧化劑的質(zhì)譜參數(shù)表

2.5 線性方程、檢出限與定量限

由表2可知，4種合成抗氧化劑在0.5～20.0 μg/mL內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2均>0.999；4種抗氧化劑的檢出限為0.05 mg/kg，定量限為0.2 mg/kg，符合分析技術(shù)要求。

2.6 準(zhǔn)確度與精密度

由表3可知，4種合成抗氧化劑在低、中、高各添加水平的加標(biāo)回收率為84.1%～108.0%。由表4可知，各種食用植物油的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.4%～4.5%，說明試驗(yàn)方法具有較高的準(zhǔn)確度和精密度。

表2 4種合成抗氧化劑的檢出限、定量限、線性范圍及相關(guān)系數(shù)

表3 4種合成抗氧化劑在不同食用植物油基質(zhì)中的加標(biāo)回收率

表4 4種合成抗氧化劑在不同食用植物油基質(zhì)中的精密度

2.7 實(shí)際樣品分析

實(shí)際樣品檢測發(fā)現(xiàn)，BHT和BHA各檢出1批次，TBHQ檢出9批次，其含量為50～120 mg/kg，低于GB 2760—2014允許的最大添加量200 mg/kg，說明中國食用植物油所添加的抗氧化劑中，毒性偏強(qiáng)的BHA、BHT、Ionox-100正逐漸被毒性較小的TBHQ所替代。同時(shí)對購自廣州譜恩科學(xué)儀器有限公司的食用油質(zhì)控樣品進(jìn)行了驗(yàn)證，并與GB 5009.32—2016中涉及的凝膠滲透色譜(GPC)-GC/MS方法進(jìn)行了比較，其結(jié)果見表5。由表5可知，試驗(yàn)開發(fā)的方法與GPC-GC/MS的檢測結(jié)果均落在質(zhì)控樣品測試結(jié)果滿意區(qū)間內(nèi)，且無明顯差異，表明開發(fā)的檢測方法獲得的檢測數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠，且新方法的工作效率較國標(biāo)法有明顯的提升。

表5 采用不同方法得到的質(zhì)控樣品分析結(jié)果

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明，運(yùn)用QuEChERS前處理技術(shù)對食用植物油基質(zhì)進(jìn)行提取和凈化，可以很好地解決脂質(zhì)去除和分析物回收之間兩難的問題，所建方法與采用固相萃取、凝膠滲透色譜凈化效果相同；且可以實(shí)現(xiàn)高通量處理，其工作效率更高；此外研究對各類食用油脂中的抗氧化劑進(jìn)行了檢測方法分析，其檢測類別廣、覆蓋面全。研究方法的自動(dòng)化程度高，操作簡單、有機(jī)溶劑使用量少、對環(huán)境友好、油脂去除效果顯著、靈敏度、精密度及回收率均可滿足國內(nèi)外相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)對食用植物油中抗氧化劑的限量要求。在QuEChERS樣品前處理過程中，試驗(yàn)僅對商品化的EMR-Lipid dSPE增強(qiáng)型脂質(zhì)去除凈化管、EMR-Lipid polish反萃取管進(jìn)行研究，未對其內(nèi)在各成分展開深入探討，后續(xù)可通過改良QuEChERS組合中的成分尋求更佳試驗(yàn)方案。