張家華，方炳虎，王敏儒*

(1.佛山科學技術(shù)學院，廣東佛山 528000；2.華南農(nóng)業(yè)大學，廣東廣州 510642)

同化激素是一類具有強的蛋白質(zhì)同化作用，可抑制異化或氧化代謝，提高蛋白質(zhì)沉積的甾體類物質(zhì)，具有重要的殘留毒理學意義。在養(yǎng)殖業(yè)濫用最普遍的主要有睪酮、甲基睪酮、黃體酮、群勃龍、勃地龍、諾龍、美雄酮、康力龍、丙酸諾龍、丙酸睪酮及苯丙酸諾龍等[1-2]。由于它們能提高飼料轉(zhuǎn)化率和瘦肉生產(chǎn)率，一些從業(yè)者在利益驅(qū)使下將其用作畜禽的促生長劑[3]。雄性激素可損害人的肝功能，影響心血管系統(tǒng)，傷害人體的生殖系統(tǒng)，引起內(nèi)分泌功能障礙等，過量攝入性激素還可能對青少年的神經(jīng)系統(tǒng)和心理行為發(fā)展造成不可逆轉(zhuǎn)的損害[4-6]。原農(nóng)業(yè)部發(fā)布的第178號公告明確指出不得在動物飼料和飲食中添加苯丙酸諾龍等藥物[7]。但目前非法將這類藥物用于畜禽、水產(chǎn)養(yǎng)殖上的報道仍時有發(fā)生。

國內(nèi)外主要采用液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法、液相色譜-質(zhì)譜法檢測動物組織中的睪酮、甲睪酮、黃體酮、群勃龍、勃地龍、諾龍、美雄酮、司坦唑醇、丙酸諾龍、丙酸睪酮及苯丙酸諾龍等同化激素[8-13]。目前我國對于上述11種同化激素在豬肉、雞肉中的多殘留檢測報道相對較少，參考現(xiàn)有的行業(yè)標準(農(nóng)業(yè)部1031號公告-1-2008[14])，本研究在參考文獻基礎(chǔ)上對儀器參數(shù)和樣品前處理條件進行優(yōu)化，擬建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS),以期能夠同時測定雞肉、豬肉中睪酮等11種同化激素，為批量檢測樣品中睪酮等違禁藥物的殘留量提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物 睪酮、甲睪酮、群勃龍、諾龍、美雄酮、丙酸諾龍標準品，德國Dr．Ehrenstorfer公司產(chǎn)品；勃地龍，美國CATO公司產(chǎn)品；丙酸睪酮、康力龍、黃體酮，中國食品藥品檢定研究所產(chǎn)品；苯丙酸諾龍標準品，美國IL公司產(chǎn)品。

1.1.2 試劑 甲酸、乙腈、甲醇均為色譜純，德國Merk公司產(chǎn)品；乙酸乙酯、叔丁基甲醚、無水乙醇均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 儀器 Agilent 1290 Infinity Ⅱ超高效液相色譜系統(tǒng)，美國安捷倫公司產(chǎn)品；Triple QuadTM4500液質(zhì)聯(lián)用儀，AB SCIEX公司產(chǎn)品，配Analyst1.6.3軟件；CPA225D電子天平，賽多利斯科學技術(shù)儀器(北京)有限公司產(chǎn)品；ST16R高速冷凍離心機，賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品；JE1002電子天平，上海浦春計量儀器有限公司產(chǎn)品；R205B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海申生科技有限公司公司產(chǎn)品；N-VEVAP 24位氮吹儀，美國Organomation公司產(chǎn)品；MS3普通型旋渦混合器，廣州儀科實驗技術(shù)有限公司產(chǎn)品；Milli-Q Reference超純水系統(tǒng)，Merck Millipore公司產(chǎn)品；WAT200677固相萃取裝置，Waters公司產(chǎn)品；Agilent C18固相萃取小柱(200 mg，3 mL)，美國安捷倫公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 標準溶液配制

1.2.1.1 同化激素標準儲備溶液配制 準確稱取睪酮、甲睪酮、黃體酮、群勃龍、勃地龍、諾龍、美雄酮、康力龍、丙酸諾龍、丙酸睪酮、苯丙酸諾龍10 mg(按實際含量折算，精確至0.0001)置于10 mL容量瓶中，用純甲醇溶液溶解并稀釋，配成1 mg/mL標準儲備溶液，置-20℃下保存。

1.2.1.2 同化激素混合標準中間液的配制 從配制好的同化激素標準儲備液中，各自取1.0 mL的同化激素標準儲備液，甲醇定容至20 mL，配制成50 μg/mL的混標儲備液，置-20℃下保存。用甲醇稀釋備用。

1.2.2 色譜與質(zhì)譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-Aq(2.1 mm×150 mm，3.5 μm)；流動相：A相為0.1%甲酸乙腈，B相為0.1%甲酸水溶液；柱溫：37℃；進樣體積：5 μL；流速：0.25 mL/min；梯度洗脫程序:0 min～1 min,30%～55% A；1 min～3 min,55% A；3 min～6 min,55%～98% A；6 min～12 min,98% A；12 min～12.5 min,98%～30% A；12.5 min～15 min,30% A。質(zhì)譜條件：電噴霧電離(ESI)，正離子掃描，多反應監(jiān)測模式(MRM)；電噴霧電壓(IS)5500V，霧化氣壓力(GSl)65 psi，輔助器流速(GS2)60 L/rain，氣簾氣壓力(CUR)30 psi，離子源溫度(TEM)550℃，碰撞室壓力(CAD)8 psi。去簇電壓、碰撞能量及定量離子對、定性離子對等參數(shù)見表1。

表1目標化合物的多反應監(jiān)測質(zhì)譜參數(shù)

1.2.3 樣品測定

1.2.3.1 樣品制備 將雞肉、豬肉的可食用組織部分盡可能地去除筋膜和脂肪后，切成小塊，用絞肉機絞碎，置-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.2 樣品提取 精確稱取2 g(精確至0.001 g)勻漿好的組織于50 mL 聚丙烯離心管中，加入10 mL 甲醇-乙腈(1∶1，v/v)，渦旋混勻，超聲提取10 min，以6000 r/min 離心10 min。將上清液轉(zhuǎn)移至50 mL 聚丙烯離心管中，重復提取一次。合并提取液，置-20℃下，冷凍2 h。以10000 r/min，離心10 min。

1.2.3.3 樣品凈化 將“1.2.3.2”中提取的上清液于37℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸至近干，加4 mL 30%乙腈水溶解，備用。將上述溶液加到C18固相萃取柱凈化(3 mL甲醇、3 mL水活化，6 mL 30%甲醇水淋洗)，抽干后，加入4 mL乙腈洗脫，置-20℃下冷凍1 h。以15000 r/min，離心10 min。于37℃水浴下氮氣緩慢吹干。加入1 mL 30%乙腈復溶，渦旋2 min，上清液過0.22 μm濾膜，待測。

1.2.3.4 檢測限與定量限的測定 分別制備0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、1.5、2 μg/kg的添加樣品，每個濃度重復3次，前處理后。經(jīng)UPLC-MS/MS檢測，從基質(zhì)添加樣品中檢測待測物質(zhì)的最小濃度為檢測限(limit of detection，LOD)，被定義為信噪比S/N≥3。根據(jù)其檢測限以同樣的方法確定其定量限，基質(zhì)添加樣品中被測物能被定量測定的最低量為定量限(Limit of Quantitation，LOQ)，被定義為S/N≥10。

1.2.3.5 標準曲線的制作 準確稱取空白樣品7份，進行前處理，制備空白基質(zhì)液。將混合標準儲備液用初始流動相稀釋成1000、500、200、100、50、20、10 ng/mL的標準工作液。取空白基質(zhì)液對上述標準工作液進行稀釋，制得濃度為100、50、20、10、5、 2、1 μg/kg的空白基質(zhì)匹配標準溶液，每個濃度重復3次，共做3個批次。

1.2.3.6 回收率與精密度 準確稱取2 g(精確至 0.001 g)空白基質(zhì)，添加適當濃度的混合標準工作液 100 μL，制備成10 μg/kg、20 μg/kg、50 μg/kg的添加濃度。每個添加濃度做5個重復，連續(xù)做3個批次，添加提取劑進行提取，其他按照上述前處理方法進行處理。同時制得10 μg/kg、20 μg/kg、50 μg/kg的空白基質(zhì)匹配標準溶液，采用單點定量法，按照回收率計算公式計算各添加水平下的回收率。每組5個平行樣品回收率之間的相對標準偏差是批內(nèi)精密度(RSD)，3個批次的添加樣品回收率之間的相對標準偏差是批間精密度(RSD)。

2 結(jié)果

2.1 液相條件

試驗中采用0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水作為流動相，可實現(xiàn)對11種同化激素激素類藥物的分離，藥物的沒有拖尾現(xiàn)象，且峰形對稱，圖1為11種同化激素在豬肉中的MRM離子流色譜圖。

2.2 方法線性范圍、檢出限和定量限

在1 μg/kg～100 μg/kg濃度內(nèi)，豬肉和雞肉中各個藥物基質(zhì)匹配標準曲線線性關(guān)系良好(R2>0.99)。按照方法規(guī)定進行前處理，上機測定。在豬肉中，睪酮、甲睪酮、黃體酮、群勃龍、勃地龍、諾龍、美雄酮、康力龍、丙酸諾龍、丙酸睪酮、苯丙酸諾龍的檢測限和檢出限分別為0.1 μg/kg～0.5 μg/kg和0.3 μg/kg～1 μg/kg。雞肉中，睪酮、甲睪酮、黃體酮、群勃龍、勃地龍、諾龍、美雄酮、康力龍、丙酸諾龍、丙酸睪酮、苯丙酸諾龍的檢測限和檢出限分別為0.1 μg/kg～0.5 μg/kg和0.3 μg/kg～1 μg/kg。

圖111種同化激素在豬肉中的MRM色譜圖(10 μg/kg)

2.3 回收率和精密度

為消除或減少基質(zhì)效應的影響，按照“1.2.3.6”方法，采用空白樣品添加標準溶液進行檢測，豬肉中11種藥物平均回收率為74.3%～101.1%，批間變異系數(shù)為6.0%～13.7%。雞肉中11種藥物平均回收率為70.1%～97.4%，批間變異系數(shù)為5.0%～12.3%。

2.4 實際樣品檢測

將建立的方法應用于雞肉、豬肉各20個實際樣品的檢測，均未檢出睪酮等11種同化激素。

表2檢出限與定量限

3 討論

3.1 儀器條件選擇

3.1.1 MS/MS特征離子的選擇 對于動物肌肉組織中多種甾體激素的分析，采用串聯(lián)質(zhì)譜MRM模式采集信號。在ESI+電離方式下，11種甾體激素都可形成穩(wěn)定的[M+H]+準分子離子峰，然后進行相應的子離子全掃描,以確定MRM特征診斷離子，11種甾體激素選擇的特征離子見表1，每種藥物選擇兩個離子對。

3.1.2 液相條件的優(yōu)化 基于超高效液相色譜分離的特點和要求，在優(yōu)化的流動相條件下，11種甾體激素藥物在 15 min內(nèi)實現(xiàn)良好的分離，峰形對稱，不拖尾，圖1為11種激素在豬肉中的MRM離子流色譜圖?？紤]到同化激素容易受到內(nèi)源性干擾，選用的色譜柱不宜過短，因此選擇了長度為150 mm的色譜柱。11種同化激素在溫度高于45 ℃時易于分解，而色譜柱溫度較低時分離洗脫效果較低，且出峰較慢。流動相中加入適量的甲酸溶液有利于11種激素都可形成穩(wěn)定的[M+H]+準分子離子。試驗對比了有機溶劑乙腈/甲醇(A相)與水/0.1%甲酸水溶液(B相)分離目標化合物的效果。在0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈流動體系中，采用梯度洗脫，可實現(xiàn) 11種甾體激素藥物的快速分離，且峰形良好。

3.2 樣品前處理方法優(yōu)化

3.2.1 除脂 動物組織含有的脂肪會影響檢測方法的靈敏度，本研究對比了使用乙腈飽和的正己烷和低溫冷凍兩種方法以及兩種方法相結(jié)合的除脂效果。當使用乙腈飽和的正己烷進行除脂，結(jié)果表明丙酸睪酮和丙酸諾龍的回收率均低于30%，而苯丙酸諾龍幾乎檢測不到，且其余8種藥物的回收率相對于用冷凍除脂的方法也有所降低，因此選擇冷凍除脂。

3.2.2 提取溶劑的選擇 試驗對比了叔丁基甲醚、乙酸乙酯、甲醇、乙腈等溶劑或混合溶液的提取效果，發(fā)現(xiàn)叔丁基甲醚提取時，康力龍、丙酸睪酮、丙酸諾龍、苯丙酸諾龍的回收率低于30%。乙酸乙酯提取時，康力龍、苯丙酸諾龍的回收率低于55%。以甲醇-乙腈(1∶1，v/v)提取時各個藥物的回收率較高，且易于濃縮，最終選擇甲醇-乙腈(1∶1，v/v)作為提取液。

3.2.3 固相萃取法的優(yōu)化

3.2.3.1 固相萃取柱的選擇 考慮到經(jīng)有機試劑提取肌肉組織容易得到較多雜物，本試驗采用最常用的凈化方式固相萃取凈化。由于類物質(zhì)為中等極性或者弱極性，目前報道中[8-13]多采用MCX、HLB和C18固相萃取小柱。本試驗對比了11種同化激素在MCX、HLB和C18兩種固相萃取小柱上吸附效果，當使用 MCX 柱進行凈化時，大部分藥物的回收率低于30%。與HLB固相萃取柱相比，各個藥物在C18固相萃取柱上回收率均較高，同時考慮其成本相對較低，最終選擇C18柱。

3.2.3.2 淋洗液的選擇 在固相萃取過程中，需要盡可能地洗掉的干擾組分，且需保證所測目標化合物不被洗脫下來。本試驗所測目標化合物易溶于甲醇，選用的固相萃取柱的淋洗溶劑一般采用甲醇，因此，本研究采用加入含所測藥物混合標準溶液的空白樣品進行試驗，選擇不同濃度的甲醇水作為淋洗溶液，比較淋洗效果。試驗結(jié)果表明，當淋洗液為20%甲醇水淋洗的目標化合的回收率相對較高，30%甲醇水淋洗液的回收率稍偏高；另外，隨著甲醇的含量增加，即甲醇含量高于30%時，目標化合物未被固相萃取柱保留而導致回收率降低。主要原因由于目標化合物能溶解于有機試劑甲醇中，在淋洗過程中，隨著甲醇的含量的增加，其洗脫的能力也增加，因此，造成目標化合物在淋洗過程中被沖洗，造成了回收率的降低，最終選取30%甲醇作為淋洗溶液。

3.2.3.3 洗脫液的選擇 本試驗選用甲醇、乙腈及混合溶劑甲醇/乙腈(1∶1，v/v)對目標化合物進行洗脫。試驗結(jié)果表明，在洗脫劑用量不變的條件下，甲醇與乙腈的洗脫能力相當，乙腈稍高于甲醇的洗脫能力；而當選擇甲醇作為洗脫液時，群勃龍和勃地龍的回收率相對于乙腈洗脫時低，且雜質(zhì)增多；以混合溶劑甲醇/乙腈(1∶1，v/v)對目標化合物進行洗脫時，洗脫速度相對較慢，雜質(zhì)也相對較多，因此，最終選擇乙腈溶液作為最佳洗脫溶劑。

表3豬肉和雞肉中11種同化激素的線性方程

表4豬肉和雞肉中11種同化激素的回收率與精密度

本試驗對洗脫溶劑乙腈不同洗脫體積(2 mL，3 mL，4 mL，5 mL)對目標化合物的洗脫能力，試驗結(jié)果表明，當洗脫液體積為2 mL 時，整體目標化合物的回收率較低；當升高洗脫溶劑至3 mL 時，其回收率相對增加；當采用5 mL洗脫液體積時，回收率有降低的趨勢；洗脫液的體積與氮吹濃縮的時間有關(guān)，故在一定程度上影響了前處理的時間。因此，考慮回收率與經(jīng)濟實惠等因素，最終選定4 mL洗脫液體積為最佳選擇。

本研究建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定11種同化激素的方法，以豬肉、雞肉為檢測基質(zhì)，證明了方法的可應用性，為肉品中同化激素的檢測提供了可選擇的方法。