高 睿，李河林，焦鐵軍，羅 艷，仇薪鑫，裴黨帥

(1.楊凌職業(yè)技術學院,陜西楊凌 712100；2.榆林學院，陜西榆林 719000；3.楊凌綠方生物工程有限公司，陜西楊凌 712100；4.渭南市動物衛(wèi)生工作站，陜西渭南 714000)

國內(nèi)外對 PCV2 疫苗的研究主要是從滅活疫苗、亞單位疫苗、重組腺病毒基因工程疫苗、嵌合病毒疫苗以及核酸疫苗等方面進行。商品化的PCV2疫苗一般為全病毒滅活疫苗和亞單位疫苗。因亞單位疫苗價格相對昂貴，目前市場上使用范圍較廣的多為全病毒滅活疫苗。全病毒滅活疫苗的生產(chǎn)主要采用豬腎細胞系(PK-15細胞)培養(yǎng)，但PCV2在PK-15細胞系上增殖病毒滴度不高，一般僅為104～105TCID50/mL[1-2]，這成為了制約 PCV2全病毒滅活苗疫苗開發(fā)的技術瓶頸。因此，研究提高PCV2在細胞內(nèi)增殖滴度的方法成了PCV2全病毒滅活苗開發(fā)需要克服的最大困難。

促進PCV2在細胞中高效增殖的途徑有兩種，一種為刺激細胞促進PCV2增殖的方法，另一種為改造和篩選細胞促進PCV2增殖的方法[3]。本文以PCV2病毒不同轉瓶培養(yǎng)生產(chǎn)工藝為基礎，采用添加促進PK-15細胞孵育劑的方法，比較PCV2在轉瓶細胞培養(yǎng)中高效增殖的不同工藝，以期對豬圓環(huán)病毒滅活疫苗生產(chǎn)企業(yè)及對病毒與宿主相互作用機理的基礎研究具有一定的借鑒意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒種和細胞 豬圓環(huán)病毒2型DBN-SX07株，種毒滴度為105.5TCID50/mL，由楊凌綠方生物工程有限公司保存；貼壁依賴性 PK-15 細胞(豬腎細胞系) 購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.1.2 抗體 FITC標記的羊抗鼠IgG，KPL公司產(chǎn)品；鼠源抗PCV2衣殼蛋白單克隆抗體，JBT公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要試劑 MEM培養(yǎng)基，GBICO公司產(chǎn)品；D-氨基葡萄糖，Sigma公司產(chǎn)品；胰酶(進口分裝)，華美生物工程有限公司產(chǎn)品；無豬圓環(huán)病毒污染的新生牛血清購自上海洛神生物技術有限公司；甲醇、丙酮等，分析純。

1.1.4 儀器設備 倒置熒光顯微鏡， CO2培養(yǎng)箱， 吸管，96孔細胞培養(yǎng)板，細胞培養(yǎng)瓶，移液器等。

1.2 方法

用轉瓶工藝生產(chǎn)豬圓環(huán)病毒2型疫苗抗原時，在病毒增殖過程中，用不同的接毒與收獲方法。收獲病毒后按照“豬圓環(huán)病毒 2 型滅活疫苗(DBN-SX07株) 制造及檢驗試行規(guī)程”進行 PCV2 (DBN-SX07 )株毒液病毒滴度的測定，每個組別進行3次重復試驗。

1.2.1 病毒增殖 單層接毒組：將長成單層的PK-15細胞棄去生長液，按5%接毒量接種，37℃中吸附30 min，加入維持液，37℃下培養(yǎng)72 h，棄去維持液，加入1/10 PBS反復凍融3次，3 000 r/min離心取上清，凍存。

①單層接毒+氨糖組：將長成單層的PK-15細胞棄去生長液，按5%的接毒量接種，37℃中吸附30 min，加入含3 mmol/L D-氨基葡萄糖的維持液，37℃下培養(yǎng)72 h，棄去維持液，加入1/10 PBS反復凍融3次，3 000 r/min離心取上清，凍存。

②同步接毒組：將擴大培養(yǎng)的PK-15細胞，加入0.2 g/L EDTA；0.5 g/L胰酶消化液，37℃作用5 min～8 min，消化分散均勻，用含80 mL/L無豬圓環(huán)病毒污染的新生牛血清的MEM細胞生長液制備成每毫升約2×105個細胞的細胞懸液。按細胞生長液的5%(V/V)比例接種生產(chǎn)用毒種，置37℃、轉速為10 r/h～14 r/h的條件下進行轉瓶培養(yǎng)。接毒后每日觀察1～2次，培養(yǎng)至48 h棄營養(yǎng)液，加入含30 mL/L無豬圓環(huán)病毒污染的新生牛血清的細胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)36 h～48 h，凍融收獲細胞及培養(yǎng)液。

③同步接毒+氨糖組：細胞傳代接毒基本同C組，在培養(yǎng)至48 h棄營養(yǎng)液后，加入含3 mmol/L D-氨基葡萄糖、30 mL/L無豬圓環(huán)病毒污染的新生牛血清的細胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)36 h～48 h，凍融收獲細胞及培養(yǎng)液。

④帶毒傳代組：將擴大培養(yǎng)的細胞，加入0.2 g/L EDTA、0.5 g/L胰酶消化液，37℃作用5 min～8 min，消化分散均勻。用含80 mL/L無豬圓環(huán)病毒污染的新生牛血清的MEM細胞生長液制備成每毫升約2×105個細胞的細胞懸液。按細胞生長液的5%比例接種生產(chǎn)用毒種，置37℃、轉速為10 r/h～14 r/h的條件下進行轉瓶培養(yǎng)。接種后每日觀察1～2次，培養(yǎng)48 h至長成單層。帶毒傳代的同時按1%比例接種生產(chǎn)用毒種，連續(xù)帶毒傳代培養(yǎng)至48 h。每代擬收獲病毒用無血清培養(yǎng)基替換生長液，繼續(xù)培養(yǎng)36 h～48 h，凍融收獲，其余則繼續(xù)傳代，直至細胞狀態(tài)不理想。

⑤帶毒傳代+氨糖組：基本操作同帶毒傳代組。區(qū)別在于，帶毒傳代后生長至48 h的細胞，每代擬收獲病毒用含3 mmol/L D-氨基葡萄糖無血清培養(yǎng)基替換生長液，繼續(xù)培養(yǎng)36 h～48 h，凍融收獲細胞及培養(yǎng)液，，其余則繼續(xù)傳代，直至細胞狀態(tài)不理想。

1.2.2 病毒滴度的測定 參照“豬圓環(huán)病毒 2 型滅活疫苗(DBN-SX07株)制造及檢驗試行規(guī)程”進行 PCV2 (DBN-SX07 )株毒液病毒滴度的測定(間接免疫熒光法)。采用間接免疫熒光試驗，將毒種用無血清的MEM培養(yǎng)液作10倍系列稀釋，取10-4、10-5、10-6、10-74個稀釋度的毒種，分別等體積加入到每孔含有100 μL PK-15細胞懸液(細胞濃度約為 2×105個/mL)的96孔細胞培養(yǎng)板。每個稀釋度接種6孔，同時設空白細胞對照4 孔和PCV2毒株陽性細胞對照4孔(細胞濃度約為 2×105個/mL)。接種后置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h。棄培養(yǎng)液，用PBS液洗滌，培養(yǎng)的細胞用冷甲醇/丙酮液固定后，首先與鼠源抗PCV2衣殼蛋白單克隆抗體孵育反應，PBS液洗滌后與FITC標記的羊抗鼠IgG孵育反應，PBS液洗滌后用倒置熒光顯微鏡觀察每個稀釋度的PCV2陽性細胞。根據(jù)每個稀釋度的陽性細胞孔數(shù)，按Reed-Muench法計算 TCID50。

2 結果

2.1 病毒滴度

采用A、B、C、D 4種生產(chǎn)工藝生產(chǎn)的PCV2抗原半成品均可達到規(guī)程所要求的105.5TCID50/mL，A組和C組病毒滴度均值為105.7TCID50/mL， B組和D組病毒滴度(TCID50/mL)均值分別為106.2TCID50/mL和106.1TCID50/mL。數(shù)據(jù)顯示，在維持液中添加D-氨基葡萄糖的B、D組分別比對應的A、C組病毒滴度高約3.16倍及2.51倍，說明D-氨基葡萄糖的添加對PCV2的單層接毒組和同步接毒組病毒滴度的提高具有增強效果(表1和表2)。在PK-15細胞使用連續(xù)帶毒傳代增殖PCV2時，細胞可傳至8代左右，細胞形態(tài)開始變化，出現(xiàn)細胞融合，單層細胞拉網(wǎng)、甚至脫落，其病毒滴度也顯著下降。

表1不同病毒增殖工藝組的病毒滴度

表2不同傳代次數(shù)細胞組的病毒滴度

PCV2帶毒傳代培養(yǎng)后檢測結果表明，不同代次細胞培養(yǎng)時的病毒滴度也呈現(xiàn)一定的規(guī)律，無論是單純帶毒傳代還是帶毒傳代+氨糖組，均是隨著傳代次數(shù)的增加，PCV2病毒滴度也逐漸上升，第5代時病毒滴度均達到峰值(圖1)。表明D-氨基葡萄糖的添加對帶毒傳代組各代次的PCV2病毒滴度均有增強效果。

圖1E、F組不同代次細胞培養(yǎng)病毒滴度

2.2 不同工藝結果分析

將單層接毒、同步接毒組病毒滴度與帶毒傳代病毒滴度峰值(第5代)相比較，E組第5代時PCV2病毒滴度均值為106.6(TCID50/mL)，F(xiàn)組第5代時病毒滴度均值為106.8(TCID50/mL)，兩者相比較，F(xiàn)組病毒滴度高于E組病毒滴度約1.6倍，兩者之間存在顯著差異(P<0.05)(圖2)，說明D-氨基葡萄糖的添加對同類工藝下PCV2的生產(chǎn)具有提高病毒滴度的效果，與A、B、C、D組的試驗結果一致。E組第5代病毒滴度(TCID50/mL)均值106.6與A組、C組病毒滴度(TCID50/mL)均值105.7相比較，病毒滴度高出7.94倍(P<0.01)，說明帶毒傳代組傳代至第5代時，工藝生產(chǎn)效益顯著優(yōu)于單層接毒組和同步接毒組。

F組5代病毒滴度(TCID50/mL)均值為106.8，與B組、D組病毒滴度(TCID50/mL)均值106.2和106.1相比較，病毒滴度高出3.98及5.01倍，差異顯著(P<0.01)，說明在同等添加氨糖的培養(yǎng)條件下，帶毒傳代的工藝生產(chǎn)效益優(yōu)于單層接毒組和同步接毒組。

*P<0.05， **P<0.01,***P<0.001

3 討論

3.1 3種工藝比較

當前國內(nèi)使用貼壁細胞增殖病毒工藝主要細胞單層接毒、同步接毒以及帶毒傳代3種方式。大多數(shù)種類的病毒疫苗使用的均是細胞長成單層后接毒增殖抗原，同步接毒方法在細小病毒增殖中使用[4]，而帶毒傳代工藝則在豬瘟疫苗[5]、狂犬疫苗[6]生產(chǎn)中有應用。3種工藝均可達到生產(chǎn)目的，但根據(jù)病毒各自的生物學特性及生產(chǎn)實踐中可實現(xiàn)的生產(chǎn)條件決定了其工藝選擇略有不同。

PCV2在傳代細胞上增殖特點與豬瘟病毒、狂犬病病毒類似，病毒在細胞中增殖時，對細胞的破壞性不明顯，均不產(chǎn)生細胞病變[7]，故借鑒豬瘟病毒、狂犬病病毒生產(chǎn)工藝，可在PCV2疫苗生產(chǎn)中采用帶毒傳代工藝方式。本試驗結果表明，細胞單層接毒、同步接毒以及帶毒傳代工藝生產(chǎn)的PCV2，病毒滴度均符合規(guī)程要求(TCID50/mL>105.5)，但帶毒傳代(第5代)生產(chǎn)效果顯著優(yōu)于前兩種工藝。

3.2 第3種工藝不同代次之間的比較

在帶毒傳代培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，隨著傳代次數(shù)的增加，病毒滴度也隨之而升高，第5代次時，無論添加D-氨基葡萄糖與否，其病毒滴度均達到頂峰。同時在生產(chǎn)過程中也觀察到，帶毒傳代至8代，細胞狀態(tài)下滑開始，滴度將至標準之下，其原因是病毒掠奪了更多的營養(yǎng)造成細胞營養(yǎng)不足，還是病毒在PK-15細胞上連續(xù)擴增對細胞潛在損害累加造成的，有待進一步研究。

3.3 工藝中添加D-氨基葡萄糖效果的比較

在PK-15細胞培養(yǎng)物中添加孵育劑D-氨基葡萄糖，同工藝下病毒滴度可提高1.6～3.2倍，由于D-氨基葡萄糖對細胞有很大的毒性，用它處理的細胞會出現(xiàn)退行性變化，為了避免毒性，參照文獻[8]，將D-氨基葡萄糖直接添加到維持液中，試驗結果表明300 mmol/L D-氨基葡萄糖對細胞形態(tài)影響不大。為確保產(chǎn)品的質(zhì)量，增加工作效率，建議在PCV2抗原生產(chǎn)中使用工藝為：PK-15細胞擴傳時同步接毒(5%)，每次傳代時補加1%的PCV2種毒，37℃培養(yǎng)，連續(xù)帶毒傳5代，收獲時，棄去已長成單層細胞的培養(yǎng)液，換為含有300 mmol/L D-氨基葡萄糖的維持液繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收獲。