陳秀蘭

吸入性肺炎（Aspiration pneumonia，AP）好發(fā)于長期臥床、留置鼻飼管的老年患者，由于老年患者咽部肌肉松弛，吞咽功能下降，咳嗽反射減弱，常合并多種基礎(chǔ)疾病，不重視日常護(hù)理很容易導(dǎo)致鼻腔分泌物、口腔分泌物、胃內(nèi)容物反流入氣道，往往會引發(fā)肺部感染，尤其是右肺病變明顯[1]。AP 治療難度較大、費用高，不及時控制很容易引發(fā)急性呼吸衰竭、重癥肺炎、急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）等嚴(yán)重的呼吸系統(tǒng)疾病，是導(dǎo)致老年患者死亡的常見原因之一。因此，在臨床中要注意保持患者呼吸道通暢，及時清除氣道分泌物，預(yù)防各種反流物吸入，以預(yù)防AP 發(fā)生[2]。本研究通過觀察AP患者肺泡灌洗液（BALF）中核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域2（Nucleotide binding oligomerization 2，NOD2）mRNA、核因子-κB（Nuclear factor kappa-B，NF-κB）mRNA表達(dá)情況，同時檢測下游炎癥因子白介素-6（IL-6）、超敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP）水平，進(jìn)一步探討NOD2和NF-κB 在AP患者致炎中的作用。

1 材料與方法

1.1 一般資料選擇2018年1月～2019年10月在我院住院的肺炎患者90例，分為吸入性肺炎組（AP組）和非吸入性肺炎組（非AP組），AP組患者40例，男23例，女17例，年齡56～89歲，平均（70.5±16.98）歲，病程1～12周，平均（7.93±1.72）周；非AP組患者50例，男28例，女22例，年齡52～84歲，平均（68.7±14.62）歲，病程5d～11周，平均（7.14±1.53）周。兩組基線資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①胸部CT提示片狀浸潤性陰影或間質(zhì)性改變，雙肺病變多見，大部分位于下葉，且以胸膜下為主；②有明確誤吸史或存在與誤吸相關(guān)的多個危險因素；③有以下臨床癥狀之一：白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞計數(shù)升高，發(fā)熱，咳嗽、咳痰，肺部啰音和（或）肺實變體征[3]。排除標(biāo)準(zhǔn)：①存在影響白細(xì)胞計數(shù)的非感染相關(guān)性疾?。虎诎l(fā)生肺部感染后生存時間≤24h；③合并其他系統(tǒng)感染。

1.2 標(biāo)本處理留取BALF 4ml，2 500r/min 離心10min，將BALF 轉(zhuǎn)移至新的EP 管，按Trizol 一步法提取總RNA，加20μl 無RNA 酶的水溶解，按照Takara 公司逆轉(zhuǎn)錄試劑說明書要求合成cDNA，標(biāo)本于-80℃條件下保存。

1.3 RT-PCR法檢測NOD2 mRNA 和NF-κB mRNA表達(dá)每組取1ml BALF 懸液，加入200μl 的Trizol裂解液中，提取總RNA，并按照逆轉(zhuǎn)錄試劑說明書逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，NOD2、NF-κB 和β-actin 引物序列見表1。

擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性1min30s；94℃變性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，循環(huán)40次；最后72℃延伸5min。每份標(biāo)本3個復(fù)孔，復(fù)孔間CT值差異小于0.5，以β-actin 為內(nèi)參，CT值減去內(nèi)參的CT值作為△CT，以2-△△CT表示目的基因的表達(dá)量。所有標(biāo)本重復(fù)3次，并計算各組均值。

表1 依據(jù)GenBank 序列設(shè)計引物

1.4 ELISA法檢測hs-CRP 和IL-6水平嚴(yán)格按照人hs-CRP 和IL-6 的ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行操作，取OD值作為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品作為橫坐標(biāo)，根據(jù)檢測結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)各孔測定的OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線中得出hs-CRP 與IL-6 水平。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用t檢驗。采用ROC曲線分析NOD2、NF-κB 用于診斷AP的敏感度和特異度。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組NOD2 mRNA、NF-κB mRNA表達(dá)水平比較AP組NOD2 mRNA、NF-κB mRNA表達(dá)水平（7.46±1.82、39.12±9.53）明顯高于非AP組（3.38±0.65、12.13±3.76），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=11.252、9.734，P=0.013、0.024）。

2.2 兩組炎癥因子水平比較AP組IL-6、hs-CRP水平[（23.72±6.54）ng/ml、（17.38±4.42）mg/L] 高于非AP組[（14.37±4.67）ng/ml、（7.35±2.86）mg/L]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=13.522、12.038，P=0.009、0.015）。

2.3 NOD2和NF-κB診斷AP的ROC曲線分析NOD2和NF-κB 診斷AP的ROC曲線下面積分別為0.734、0.789，二者對AP 均具有診斷價值（P＜0.05），見表2，圖1。

表2 NOD2 和NF-κB 診斷AP的ROC曲線分析

圖1 NOD2 和NF-κB 診斷AP的ROC曲線

3 討論

NOD2是一種經(jīng)典的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)識別受體，在機(jī)體中起著重要的橋接作用，介導(dǎo)各種呼吸道炎癥疾病的致炎過程[4]。NF-κB 由P50 蛋白亞基與P60蛋白亞基共同構(gòu)成，屬于一種多向性調(diào)節(jié)功能的核轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞中起著承上啟下的致炎作用，尤其在炎癥性疾病中的表達(dá)更為突出；NOD2 作為模式受體，也是上游細(xì)胞因子，在整個致炎通路中可激活NF-κB，促進(jìn)炎癥介質(zhì)在肺間質(zhì)內(nèi)的滯留蓄積、轉(zhuǎn)運及活化，NOD2 還可以通過氧化應(yīng)激反應(yīng)來調(diào)控NF-κB的分泌[5]。

NOD是核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域家族成員中的一個分支，其主要包括NOD1 和NOD2，均屬于細(xì)胞內(nèi)蛋白。該受體主要介導(dǎo)參與機(jī)體的固有免疫，與機(jī)體炎性疾病關(guān)系較密切，在各種免疫炎性反應(yīng)中發(fā)揮重要的調(diào)控作用；尤其是被活化的NOD2，活化后可介導(dǎo)炎癥通路的多種信號途徑，并且可以釋放一系列的促炎細(xì)胞因子[6]。激活后的NOD2 可定位于細(xì)胞質(zhì)外膜，從而啟動炎癥通路中下游因子NF-κB 活化，促進(jìn)IL-6、PCT、TNF 及干擾素等多種炎癥因子分泌，還具有增強血小板粘附、趨化、聚集等功能，特別是在血栓性疾病中也起著重要作用[7]。賈欽堯等[8]發(fā)現(xiàn)慢性阻塞性肺疾?。–OPD）患者外周血NOD2 mRNA 和NF-κB mRNA 水平明顯高于對照組，證實NOD2、NF-κB 參與COPD 的致炎過程。NF-κB 主要的生物學(xué)功能是基因調(diào)控，特別是炎癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，正常情況下NF-κB 與IκB 結(jié)合，以非活性形式存在于組織的巨噬細(xì)胞漿中，在炎癥刺激后IκB 開始發(fā)生磷酸化，進(jìn)而NF-κB 與其解離并激活相應(yīng)基因，從而參與AP的免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)[9]。本研究顯示AP組患者BALF 中NOD2 mRNA、NF-κB mRNA表達(dá)水平明顯高于非AP組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

NOD2 在應(yīng)激、炎癥和免疫等異常反應(yīng)狀態(tài)下可表達(dá)于外周血中，參與固有免疫的細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)[10]。NOD2 介導(dǎo)的信號通路可激活NF-κB，啟動調(diào)節(jié)急性應(yīng)激反應(yīng)，誘導(dǎo)下游炎癥因子（如TNF-α、IL-6 與hs-CRP 等）分泌，加重組織損傷，其表達(dá)量與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)[11]。IL-6、hs-CRP是機(jī)體重要的炎癥因子，可用于疾病診斷、病情判斷及預(yù)后評估，本研究結(jié)果顯示AP組炎癥指標(biāo)IL-6、hs-CRP水平與非AP組比較均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。急性炎癥狀態(tài)下的AP患者IL-6 與hs-CRP水平高于非AP患者，說明炎癥因子增加是AP的病理因素。

本研究采用ROC曲線分析NOD2 和NF-κB 診斷AP的價值，曲線下面積分別為0.734、0.789，二者對AP 均具有診斷價值，將NOD2受體定量水平及下游炎癥因子NF-κB水平作為預(yù)測指標(biāo)具有一定的臨床價值。但本研究樣本量較小，需要更大樣本量的研究進(jìn)一步證實。AP患者NOD2、NF-κB水平與炎癥活化指標(biāo)之間的量化關(guān)系及機(jī)制值得深入探討。