董利利 湯昱 李敏 陳超輝 王靜 張亞利 張磊

急性肺損傷（Acute lung injury，ALI）/急性呼吸窘迫綜合征（Acute respiratory distress syndrome，ARDS）是機(jī)體在各種致傷因素（如嚴(yán)重感染、休克、創(chuàng)傷等）作用下，肺內(nèi)大量炎癥細(xì)胞浸潤和滲出、肺泡上皮細(xì)胞及肺泡毛細(xì)血管內(nèi)皮屏障損傷造成的非心源性肺水腫，進(jìn)而出現(xiàn)進(jìn)行性低氧血癥和呼吸困難等癥狀[1，2]。ALI/ARDS是臨床常見的急危重癥，發(fā)病急驟，盡管呼吸支持技術(shù)不斷進(jìn)步、對分子機(jī)制了解逐步深入，病死率仍高達(dá)35%～46%[1，3]，且對本病目前尚無特異的治療方法，因此，探索新型藥物防治ALI/ARDS是臨床治療的迫切需要。

細(xì)菌感染是ALI/ARDS 最常見的致病因素，其中又以革蘭陰性細(xì)菌內(nèi)毒素為主導(dǎo)，脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）是內(nèi)毒素的主要活性成分，采用氣管注射LPS是目前常用的制備ALI/ARDS 動物模型的方法且已經(jīng)廣泛應(yīng)用于ALI 發(fā)病機(jī)理和藥物防治等臨床前研究[4]。

在生物體內(nèi)，LPS 首先被LPS 結(jié)合蛋白（LPS binding protein，LBP）識別并形成復(fù)合物，然后在輔助蛋白CD14 的幫助下轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞表面與Toll 樣受體4（TLR4）和髓樣分化蛋白2（Myeloid differentiated protein，MD-2）組成復(fù)合物，從而激活TLR4 依賴的炎癥信號通路[5，6]。在LPS 的識別和TLR4 跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，MD-2 起著至關(guān)重要的作用[5]。MD-2 含有一個容納LPS 中脂質(zhì)A 的疏水性口袋，LPS 一旦侵入，TLR4/MD-2復(fù)合物受體將迅速發(fā)生二聚化形成TLR4-MD-2-LPS 復(fù)合物，招募髓樣分化因子88（Myeloid differentiation factor，MyD88）以啟動炎癥信號通路，導(dǎo)致炎癥級聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)炎癥因子的釋放和表達(dá)[6]，如TNF-α、IL-6、 IL-1β 和COX-2 等均在ALI/ARDS 病程進(jìn)展中起重要作用[7]。

研究發(fā)現(xiàn)，MD-2 基因敲除的大鼠對LPS 無反應(yīng)且能耐受LPS誘導(dǎo)的膿毒性休克[8]。目前，與MD-2 直接結(jié)合并抑制其活性的天然產(chǎn)物有JSH、姜黃素、黃腐酚和異黃腐酚、葛杜寧等[9]，均含有查爾酮類似結(jié)構(gòu)。溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院化學(xué)生物學(xué)研究中心長期從事藥物化學(xué)和化學(xué)生物學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)在合成的查爾酮類化合物中DL32[（E）-2，3-Dimethoxy-30，40-dihydroxychalcone]具有良好的體外抗炎活性。本研究探討DL32 以ALI 大鼠為模型的體內(nèi)抗炎活性及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑化合物DL32 由溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院化學(xué)生物學(xué)研究中心合成。

LPS（Sigma，貨號L6386），動物組織蛋白抽提試劑（博士德生物技術(shù)有限公司，貨號AR0101），大鼠TNF-α ELISA 試劑盒（eBioscience，貨號85-88-7340-86），anti-TLR4 抗體（Santa Cruz Biotechnology，貨號sc-293072），anti-MD-2 抗體（Santa Cruz Biotechnology，貨號sc-80183），anti-CD68 抗體（Cell Signaling Technology，貨號76437S），實時熒光定量PCR 試劑（Invitrogen，貨號1708882AP），肺組織髓過氧化物酶（MPO）活性檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，貨號A044），瑞士-吉姆薩染色液（南京建成生物工程研究所，貨號D010），羥甲基纖維素鈉（中國醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司，貨號30036328）。

1.2 儀器SpectraMax M2 酶標(biāo)儀（美國 MD），電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀、曝光儀及PCR 擴(kuò)增儀（美國 Bio-rad），落地式離心機(jī)（美國 Beckman），倒置顯微鏡（日本Olympus），包埋機(jī)及切片機(jī)（德國Leica）。

1.3 動物健康雄性Sprague Dawley（SD）大鼠（6～8周齡，180～220g）購自上海斯萊克實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號 SCXK（滬）2012-0005。大鼠在恒室溫、12∶12h 晝夜節(jié)律條件下飼養(yǎng)，自由飲水并攝食。該動物實驗經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物管理委員會批準(zhǔn)并在溫州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心進(jìn)行[wydw2014-0001]。

1.4 方法

1.4.1 實驗分組及急性肺損傷模型建立 將SD 大鼠隨機(jī)分為空白對照組、LPS 模型組、DL32 單純給藥組、DL32 預(yù)防組4組，每組8只，連續(xù)7 天灌胃給予DL32 20mg/kg 或等量0.5%羧甲基纖維素鈉（CMCNa），各組大鼠吸入乙醚麻醉后，鈍性分離暴露氣管，LPS 模型組和DL32 預(yù)防組采用氣管滴注5mg/kg LPS 建立急性肺損傷模型，空白對照組和DL32 單純給藥組滴入等量的生理鹽水，逐層縫合傷口，24h后收取樣本。

1.4.2 支氣管肺泡灌洗液（BALF）的收集 ALI 動物模型建立24h后，大鼠腹腔注射10%的水合氯醛（5ml/kg）進(jìn)行麻醉并結(jié)扎右肺，暴露氣管行氣管插管，左肺用1ml 生理鹽水進(jìn)行支氣管肺泡灌洗，收集灌洗液，重復(fù)3次。

1.4.3 BALF 的蛋白濃度測定及細(xì)胞計數(shù) 將收集的BALF 4℃ 1000rpm 離心5min，取上清液檢測蛋白濃度，用50μl 生理鹽水重懸沉淀，混勻后取20μl 用細(xì)胞計數(shù)儀Standard 計數(shù)肺泡灌洗液中的總細(xì)胞數(shù)，并取10μl 做成涂片用Wright-Gimesa 染色法（按試劑盒說明書操作）計數(shù)BALF 中中性粒細(xì)胞計數(shù)。

1.4.4 肺濕重/干重比（W/D）的測定 ALI 動物模型建立24h后，取右肺上葉，濾紙吸去組織上的水分后稱取濕重，放入60℃烘箱中72h 以上，直至恒重，稱取干重，計算肺組織W/D，判斷肺水腫程度。

1.4.5 MPO 活性測定 按MPO 活性檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.4.6 BALF 中TNF-α 蛋白含量檢測 按ELISA 試劑盒檢測說明書測定BALF 上清液中TNF-α 蛋白含量。

1.4.7 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測肺組織中IL-6 及TNF-αmRNA的表達(dá) 按試劑盒說明書進(jìn)行：①提取大鼠肺組織中總RNA；②將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；③RT-qPCR 擴(kuò)增儀檢測CT值，并計算相對值。所用引物序列如下：大鼠β-actin 正義鏈5'-AAGTCCCTCACCCTCCCAAAAG-3'，大鼠β-actin 反 義鏈 5'- AAGCAATGCTGTCACCTTCCC-3'；大鼠TNF-α 正義鏈5'-TACTCCCAGGTTCTCT TCAAGG-3',大鼠TNF-α 反義鏈5'-TACTCCCAGG TTCTCTTCAAGG-3';大鼠IL-6 正義鏈5'-GAGTTG TGCAATGGCAATTC-3'，大鼠IL-6 反義鏈5'-ACTC CAGAAGACCAGAGCAG -3'。

1.4.8 蘇木素-伊紅（HE）染色 4%多聚甲醇溶液中固定肺組織，經(jīng)乙醇脫水，用石蠟包埋，切成5μm薄片于載玻片上進(jìn)行HE 染色。染色完成后在光學(xué)顯微鏡（200×，Nikon，Japan）下行組織病理評分。組織損傷程度評分：0分（正常）～4 分（嚴(yán)重），包括間質(zhì)性炎癥、中性粒細(xì)胞浸潤、充血、組織間隙變窄和水腫[10]。

1.4.9 免疫組織化學(xué)染色檢測CD-68 肺組織經(jīng)固定、脫水、包埋、切片、脫蠟和水化后，1% BSA 室溫封閉30min，滴加CD68 抗體一抗于4℃過夜，PBS洗滌3次后加入辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1h，加DAB 顯色并用蘇木素復(fù)染，中性樹脂封片，鏡檢。

1.4.10 組織免疫共沉淀 用動物組織蛋白抽提試劑提取大鼠肺組織蛋白，向300μg 蛋白中加入MD-2抗體，4℃搖床孵育過夜，然后每個樣品中分別加入20μl 蛋白A+G 磁珠收取免疫復(fù)合物并用冷的PBS洗去未被結(jié)合的蛋白，重復(fù)5次；樣品中加入緩沖液煮沸并離心后取等量樣品進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜，用5%的脫脂牛奶室溫封閉1.5h，加入抗TLR4 抗體于4℃搖床過夜；0.1% TBST溶液洗膜3次后加入辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1h，經(jīng)ECL 孵育顯影并用化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)成像。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組比較采用t檢驗，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 化合物DL32緩解LPS誘導(dǎo)的大鼠ALI組織病理學(xué)改變LPS可造成氣道粘膜損傷，引起大鼠ALI 組織病理學(xué)改變，見圖1。而DL32 預(yù)處理的大鼠肺損傷評分明顯低于LPS 模型組（6.75±0.63 vs 13.75±0.85，t=6.60，P=0.0006），且DL32 單純給藥組與空白對照組肺損傷評分比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（2.25±0.63 vs 3.00±0.41，t=1.00，P=0.3559）。

2.2 化合物DL32緩解LPS誘導(dǎo)的ALI大鼠肺W/D及BALF蛋白滲出與LPS模型組相比，DL32預(yù)處理可顯著降低肺W/D 及BALF 中蛋白濃度（t=2.930、2.507，P=0.043、0.028）；DL32 單純給藥組與空白對照組比較未見明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.499、1.930，P=0.652、0.086），見表1。

2.3 化合物DL32緩解LPS誘導(dǎo)的ALI大鼠炎性細(xì)胞浸潤氣管滴注LPS 24h后，免疫組化顯示CD68 陽性細(xì)胞于肺組織中大量聚集，見圖2。CD68 為巨噬細(xì)胞表面的一種特異性抗原，與LPS模型組相比，化合物DL32 預(yù)處理后能明顯減少巨噬細(xì)胞浸潤（t=6.398，P=0.001），DL32 單純給藥組與空白對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.824，P=0.441）。LPS 模型組BALF 中總細(xì)胞數(shù)及中性粒細(xì)胞數(shù)明顯增加，而經(jīng)化合物DL32 預(yù)處理后，炎性細(xì)胞數(shù)量顯著減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.433、5.197，P=0.045、0.004），DL32 單純給藥組與空白對照組相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.005、2.161，P=0.996、0.083）。LPS 刺激MPO 活性的增高，DL32預(yù)處理后組織中MPO 活性明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.648，P=0.046），DL32單純給藥組與空白對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.417，P=0.698），見表2。

2.4 化合物DL32緩解LPS誘導(dǎo)的ALI大鼠炎癥因子的釋放氣管滴注LPS 24h后，BALF 中TNF-α 濃度明顯升高，組織中炎癥因子IL-6、TNF-α 基因表達(dá)也顯著增多，化合物DL32 預(yù)處理可顯著抑制炎癥因子的釋放和表達(dá)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.320、25.310、7.203，P=0.030、＜0.0001、0.002），DL32 單純給藥組與空白對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.175、1.283、0.246，P=0.118、0.256、0.818），見表3。

2.5 化合物DL32抑制ALI 大鼠中TLR4/MD-2復(fù)合物的形成為進(jìn)一步探討DL32緩解ALI 的靶向性，進(jìn)行肺組織免疫共沉淀檢測，結(jié)果顯示，LPS 可誘導(dǎo)TLR4/MD-2 的大量形成，DL32 預(yù)處理則明顯減少該復(fù)合物的形成，并且DL32 單純給藥組未見明顯變化，見圖3。

圖1 化合物DL32緩解LPS誘導(dǎo)的大鼠ALI 結(jié)果（HE 染色，200×）

表1 肺W/D 及BALF 蛋白濃度測定

圖2 化合物DL32緩解LPS誘導(dǎo)的ALI 大鼠炎性細(xì)胞浸潤（CD68 免疫組化染色，200×）

表2 炎性細(xì)胞及活動測定

表3 炎癥因子測定

圖3 化合物DL32緩解LPS誘導(dǎo)的ALI 大鼠炎癥因子的釋放及TLR4/MD-2復(fù)合物的形成

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，DL32 以MD-2 為靶點可緩解LPS誘導(dǎo)的大鼠ALI。MD-2是TLR4 的一個共同受體，它與TLR4 在細(xì)胞表面結(jié)合并介導(dǎo)LPS 和TLR4 的結(jié)合，促進(jìn)TLR4 二聚化并激活下游信號通路從而上調(diào)炎癥因子的表達(dá)[6]。由于MD-2 可直接識別LPS 的脂質(zhì)A 部分而介導(dǎo)TLR4 活性，在感染引起的炎癥中，MD-2是比TLR4 更具吸引力的藥物作用靶點[11]。研究發(fā)現(xiàn)，通過藥理學(xué)和遺傳學(xué)方法抑制MD-2 活性可使炎癥性疾病減輕，如膿毒血癥、肺炎、腎炎、哮喘、心肌炎、非酒精性脂肪肝和纖維化等[9]。腎組織中，紫杉醇與MD-2 的結(jié)合可阻斷LPS 與TLR4/MD-2 的復(fù)合，從而抑制NF-κB的活化及促炎因子的產(chǎn)生[12]。在大鼠體內(nèi)，小干擾RNA 敲除肺MD-2 可減輕花粉和貓毛引起的過敏性炎癥反應(yīng)[13]。

近年來，相繼報道的作用于MD-2 而抑制LPS與TLR4 結(jié)合的脂質(zhì)類或非脂質(zhì)小分子抑制劑已有幾十種[9]。其中，最具代表性的脂質(zhì)類化合物Eritoran 可與LPS 競爭結(jié)合于MD-2 的位點，而與TLR4 卻沒有直接作用，但是，在膿毒癥Ⅲ期臨床實驗中，Eritoran 治療組與安慰劑組相比并無顯著差異[14]。天然產(chǎn)物如姜黃素、查爾酮、葛杜寧以及我們實驗室新合成化合物L(fēng)6H21[15]和L48H37[16]可直接與MD-2 結(jié)合從而抑制MD-2 與LPS 結(jié)合介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，具有顯著的抗炎效果，同時再次證實MD-2 在介導(dǎo)炎癥反應(yīng)中的重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，DL32 在體內(nèi)具有良好的抗炎作用。

LPS是引起ALI/ARDS 最常見的原因之一，常進(jìn)展較快，氣管內(nèi)滴注LPS 可以導(dǎo)致肺氣-血屏障受損引起毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及肺泡上皮細(xì)胞損傷，組織學(xué)特征及病理生理變化主要表現(xiàn)為肺泡間隔增厚、充血、水腫、中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞浸潤聚集，氣管壁增厚、充血、水腫、杯狀細(xì)胞和粘液細(xì)胞增多、中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞浸潤聚集及炎癥介質(zhì)的大量合成和釋放（TNF-α、IL-6、IL-8、IL-1β 等）[2]。然而，目前臨床上尚無有效的藥物治療且死亡率依然較高。研究發(fā)現(xiàn)，抑制MD-2 活性可緩解肺部炎癥，MD-2 基因敲除的大鼠經(jīng)鼻滴入腦膜炎奈瑟菌來源的LPS誘導(dǎo)的肺炎BALF 中性粒細(xì)胞數(shù)顯著減少[17]。Zhang 等[5]研究發(fā)現(xiàn)，抑制MD-2 活性可減輕革蘭氏陰性細(xì)菌內(nèi)毒素誘導(dǎo)的肺部炎癥。本研究發(fā)現(xiàn)，MD-2 抑制劑DL32 可顯著緩解大鼠肺水腫及減少中性粒細(xì)胞浸潤。同時，DL32 減輕了肺泡毛細(xì)血管的通透性增加及蛋白滲出并抑制了BALF及肺組織中炎癥介質(zhì)的釋放。此外，肺組織中，LPS誘導(dǎo)促使TLR4/MD-2復(fù)合物的形成，而DL32 預(yù)處理則明顯減少該復(fù)合物的含量。因此，DL32 作為MD-2 抑制劑有望成為治療ALI 的候選藥物，而抑制MD-2 有望成為治療ALI 的新策略。

總之，本研究表明DL32 可緩解LPS誘導(dǎo)的大鼠ALI 且MD-2是LPS誘導(dǎo)的ALI 的重要治療靶點，但DL32 抑制MD-2 的具體分子作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。