歐陽(yáng)秋芳 郭進(jìn)建 游 濤 姚涵文 劉磊磊 連艷平 林濟(jì)欽 曹 斌 蘇林丘

(福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院 福建福州 350003）

左房功能是左心室舒張期灌注的決定因素，它間接反映左室的充盈壓力，當(dāng)心力衰竭時(shí)，左室舒張末期充盈壓增加，左房后負(fù)荷升高，導(dǎo)致左房結(jié)構(gòu)發(fā)生形變、功能受損。另外，左房功能下降，導(dǎo)致房?jī)?nèi)壓力升高，不利于靜脈血液回流，間接影響心室射血[1]。因此，左房功能與左心室舒張收縮功能密切相關(guān)而且相互影響，評(píng)價(jià)左房功能對(duì)疾病的病情評(píng)估、療效觀察和預(yù)后判斷具有重要意義[2]。

速度向量成像（velocity vector imaging， VVI），采用實(shí)時(shí)心肌運(yùn)動(dòng)跟蹤運(yùn)算法，計(jì)算并以矢量方式顯像二維超聲心動(dòng)圖上組織結(jié)構(gòu)的活動(dòng)方向、速度、距離時(shí)相等，對(duì)心肌組織在多個(gè)平面運(yùn)動(dòng)的結(jié)構(gòu)力學(xué)進(jìn)行量化分析，能定量測(cè)量心肌組織運(yùn)動(dòng)的速度、位移、應(yīng)變率等參數(shù)，為評(píng)價(jià)左房功能提供了更準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的方法[3][4]。但目前尚無(wú)用VVI技術(shù)定量評(píng)價(jià)大鼠左房功能的文獻(xiàn)報(bào)道。

本研究團(tuán)隊(duì)研究表明：根據(jù)溫陽(yáng)益氣、活血利水法配制的院內(nèi)制劑——健心顆粒，能顯著改善心功能[5]，通過(guò)腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞因子，抑制左室肌纖維化[6][7]。但是健心顆粒是否改善心衰大鼠左房結(jié)構(gòu)與功能，尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)。因此，本文擬用VVI技術(shù)定量評(píng)價(jià)健心顆粒對(duì)心衰大鼠左房功能的影響，旨在證實(shí)VVI技術(shù)定量評(píng)價(jià)大鼠左房功能的可行性；并以此為技術(shù)手段，闡明健心顆粒是否通過(guò)改善左房功能治療心力衰竭的新機(jī)制。

一、材料與方法

（一）藥物的來(lái)源、組方及制備

健心顆粒原藥材購(gòu)于福建省藥材公司，經(jīng)鑒定后按照相關(guān)的制劑和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)由本院制劑室制成顆粒劑。

（二）動(dòng)物模型及分組

將體重200g左右的SD大鼠50只，隨機(jī)分成假手術(shù)組、模型組、健心顆粒小劑量組（劑量1.8g/kg/d）、健心顆粒大劑量組（劑量3.6g/kg/d）、苯那普利組（給予劑量10mg/kg/d），每組10只。按孫慶怡等報(bào)道的方法[8]，采用縮窄腹主動(dòng)脈法制備慢性心衰大鼠模型。假手術(shù)組大鼠在游離腹主動(dòng)脈后不結(jié)扎。于造模后第7天用多普勒超聲測(cè)腹主動(dòng)脈的狹窄程度，判斷模型是否成功。對(duì)造模成功大鼠于第8天開(kāi)始按上述方案灌胃給藥，假手術(shù)組和模型組給予相同劑量的生理鹽水。干預(yù)12周后進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究。

（三）超聲心動(dòng)圖分析左室功能及速度向量成像技術(shù)分析左房應(yīng)變率

采用10%水合氯醛（3ml/kg）腹腔注射麻醉下采用西門(mén)子（Acuson S 2000型）超聲儀進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢查，剃掉大鼠胸前的毛，鋪超及導(dǎo)聲墊，M型和二維超聲心動(dòng)圖測(cè)量左房左右徑（left atrial diameter， LA）、左室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular end diastolic diameter， LVEDD）、室間隔舒張末期厚度（interventricular septal end diastolic thickness， IVST）、左室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction， LVEF）與縮短分?jǐn)?shù)（left ventricular shortening fraction， LVFS）。

超聲儀自帶分析軟件為syngo US Workplace VVI自動(dòng)分析軟件。采集心尖四腔心連續(xù)3個(gè)心動(dòng)周期動(dòng)態(tài)超聲圖，啟動(dòng)VVI模式，在標(biāo)準(zhǔn)心尖四腔心切面顯示清晰的房間隔和側(cè)壁，連續(xù)采集3個(gè)心動(dòng)周期的動(dòng)態(tài)圖像，存儲(chǔ)后脫機(jī)分析。分析時(shí)，將圖像幀頻回放到左室收縮末期，逐點(diǎn)勾畫(huà)心內(nèi)膜邊界，VVI軟件將自動(dòng)生成速度應(yīng)變向量圖（圖1）。在四腔心切面自動(dòng)獲取收縮期峰值應(yīng)變率（left ventricular peak systolic strain rate，SR-s）、舒張?jiān)缙诜逯祽?yīng)變率（left ventricular peak early diastolic strain rate，SR-e）及舒張晚期峰值應(yīng)變率（left ventricular peak latediastolic strain rate，SR-a）的測(cè)量并記錄，其中SR-s對(duì)應(yīng)心電圖的QRS波群起始點(diǎn)至T波終末期，SR-e、SR-a分別對(duì)應(yīng)T波終末開(kāi)始至QRS波群起始點(diǎn)之間。測(cè)得計(jì)算平均值，并記錄。

圖1

（四）ELISA法測(cè)血漿AngII、BNP水平

因血管緊張素II（Ang II）可致心房肌纖維化，而N末端腦鈉肽（NT-proBNP）反映心功能，故血漿檢測(cè)上述指標(biāo)。斷頭取血，2ml血注入含10%二乙胺四乙酸二鈉30μl和抑肽酶40試管中，混勻，4℃，3000r/min離心10min，分離血漿，-20℃存放。測(cè)定前冷水中復(fù)融，再次4℃，3000r/min離心5min后，取上清液，采用非平衡法測(cè)定。將聚苯乙烯試管編號(hào)，經(jīng)過(guò)加液程序后混勻，4℃，3500r/min離心20min，吸取上清液，采用免疫放射法測(cè)定。在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，查出樣品值。

（五）原位缺口末端標(biāo)記法評(píng)估左房肌細(xì)胞凋亡

因細(xì)胞凋亡與左房功能密切相關(guān)，故檢測(cè)凋亡程度。采用原位缺口末端標(biāo)記（TdT-mediated dUTP nickend labeling， TUNEL）法對(duì)各組所取組織用10%中性緩沖福爾馬林固定，常規(guī)石蠟切片。按“原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒”說(shuō)明進(jìn)行檢測(cè)。

（六）MASSON染色分析左房間質(zhì)纖維化

打開(kāi)已測(cè)定好血壓大鼠的胸腔，分離心臟，切取左心耳并用10%中性甲醛固定。石蠟包埋，取左心耳冠狀面最大橫徑處切片，行MASSON染色。膠原纖維染成藍(lán)色，胞漿、肌纖維呈紅色，而胞核為黑藍(lán)色。膠原容積分?jǐn)?shù)（collagen volume fraction， CVF）是指視野中膠原染色的區(qū)域面積占總面積的百分比。每張切片上隨機(jī)選取8個(gè)視野，通過(guò)使用Image Pro Plus軟件（version 6.0， USA）計(jì)算CVF來(lái)反映左心房纖維化程度，計(jì)算CVF時(shí)視野中血管周圍區(qū)域不記入內(nèi)。

（七）左房組織Western blot方法檢測(cè)Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原表達(dá)

采用Western blot方法檢測(cè)左房肌組織膠原蛋白的表達(dá)。提取左房總蛋白，進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度定量后，對(duì)蛋白樣品進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉。采用Abcam公司抗體，以1：2000稀釋I型和III型膠原一抗，二抗孵育，免疫印跡顯色。以GAPDH作為內(nèi)參，進(jìn)行半定量分析，用圖像分析系統(tǒng)對(duì)圖片進(jìn)行灰度掃描，比值表示其相對(duì)含量。

（八）統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 19.0軟件，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，均數(shù)比較采用成組設(shè)計(jì)單因素方差分析，組間均數(shù)比較采用LSD法。非正態(tài)分布資料采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

二、結(jié)果

（一）AngII、NT-pro BNP水平、左室功能與左房峰值應(yīng)變率

如表1，模型組和各治療組的Ang II、NT-pro BNP水平均明顯高于假手術(shù)組（P＜0.05）。與模型組比較，各治療組上述指標(biāo)均顯著降低（p＜0.05）。超聲心動(dòng)圖結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組左室射血分?jǐn)?shù)（EF）、縮短分?jǐn)?shù)（FS）減低，而室間隔厚度（IVST）、左室舒張末徑（LVEDD）、左房徑增加，說(shuō)明腹主動(dòng)脈縮窄所致心力衰竭建模成功。低、高劑量健心顆?；虮侥瞧绽委熀?，EF、FS增高，IVST、LVEDD減低，說(shuō)明治療后左心功能改善。

與假手術(shù)組比較，模型組左房SR-s（儲(chǔ)庫(kù)功能，0.96±0.07 vs 1.95±0.14，p＜0.01）與SR-a（輔泵功能，-0.57±0.05 vs -1.32±0.19，p＜0.01）顯著增強(qiáng)，而SR-e（管道功能，-0.75±0.04 vs-0.36±0.05，p＜0.01）減弱。健心顆粒或苯那普利治療后，SR-s、SR-a降低，而SR-e增加。

表1 各組血漿Angll、血漿NT-pro BNP、左室超聲分析及左房應(yīng)變率比較

（二）左房肌細(xì)胞凋亡

與假手術(shù)組相比，模型組左房凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增加（23.16%±3.19% vs 2.41%±0.47%，p＜0.01）。盡管健心顆粒治療后的左房凋亡細(xì)胞數(shù)仍較假手術(shù)組嚴(yán)重（各治療組均p＜0.01），但與模型組比較，高劑量健心顆粒治療后，細(xì)胞凋亡明顯減少（12.45%±2.16% vs 23.16%±3.19%，p＜0.01），與苯那普利組（10.60%±1.57%）比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。低劑量健心顆粒治療，細(xì)胞凋亡數(shù)稍減低（18.93±2.08），但與模型組比較（23.16%±3.19%），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 左房肌組織的TUNEL染色結(jié)果（細(xì)胞核呈藍(lán)綠色，凋亡細(xì)胞呈棕褐色，模型組大鼠心房肌凋亡細(xì)胞高于假手術(shù)組，健心顆粒、苯那普利治療后，凋亡程度減輕。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表示為x±s，n=10。與假手術(shù)組比較，*p＜0.05；與模型組比較，#p＜0.05。（×400）

（三）左房間質(zhì)纖維化

膠原容積分?jǐn)?shù)（CVF）代表左房纖維化的嚴(yán)重程度，Masson染色時(shí)膠原纖維呈藍(lán)色，肌纖維和纖維素呈紅色，藍(lán)色染色面積的百分比為膠原容積分?jǐn)?shù)。與假手術(shù)組相比，模型組左房CVF顯著增加（24.52%±2.41% vs 3.65%±0.44%，p＜0.01）。盡管健心顆粒治療后的左房肌纖維化仍較假手術(shù)組嚴(yán)重（各治療組均p＜0.05），與模型組相比，健心顆粒低劑量和高劑量治療組CVF顯著降低（JXKL-和JXKL-H與模型組：15.53%±2.12%和8.94%±1.07% vs 24.52%±2.41%；p＜0.001），兩組治療均達(dá)到顯著性差異。健心顆粒高劑量治療組與苯那普利組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（8.94%±1.07% vs 6.68±0.73，p＞0.05）。

圖3 左房肌組織Masson染色，膠原纖維呈藍(lán)色，肌纖維和纖維素呈紅色，模型組大鼠心房肌纖維化程度高于假手術(shù)組，健心顆粒、苯那普利治療后，纖維化程度減輕。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表示為±s，n=10。與假手術(shù)組比較，*p＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。（×400）

（四）左房肌Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)

與假手術(shù)組比較，模型組I、III型膠原表達(dá)及I/III型膠原比值均增加（I型：1.35±0.20 vs 0.43±0.05；III型：0.97±0.12 vs 0.41±0.06；I/III膠原比值：1.39±0.13vs1.05±0.03，），提示腹主動(dòng)脈所致心衰大鼠左房出現(xiàn)膠原沉積，并以I型膠原增加為主。與模型組比較，低劑量及高劑量健心顆粒均抑制Ⅰ型（0.95±0.08和0.72±0.12 vs 1.35±0.20）和Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)（0.75±0.08和0.62±0.11 vs 0.97±0.12），降低I/III型膠原比值（1.27和1.16 vs 1.39±0.20）。高劑量健心顆粒與苯那普利作用相似（p＞0.05）。

圖4 各組大鼠心房肌組織的Western blot分析l、lll型膠原的表達(dá)及定量分析。數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，GAPDH作為內(nèi)參蛋白，3次實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生相似的結(jié)果，如圖所示其中1次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。*P＜0.05,與假手術(shù)組比較；#P＜0.05，與模型組比較。Collagen l:l型膠原，Collagen lll:lll型膠原。

三、討論

左房在整個(gè)心臟功能中起著重要作用。它既可作為“存儲(chǔ)器”，于左室收縮期存儲(chǔ)血液；亦可充當(dāng)肺靜脈和左室之間的“管道”，在左室舒張?jiān)缙谳斔脱河煞戊o脈進(jìn)入左室；另外，左房作為“助力泵”，于舒張晚期主動(dòng)收縮，增加左室充盈血量。左心房的存儲(chǔ)、管道、助力泵功能分別占左心室充盈容積的40%、35%和25%左右，左房通過(guò)這3個(gè)功能來(lái)共同協(xié)助左室充盈，維持心輸出量[9]。

本研究結(jié)果提示大鼠腹主動(dòng)脈結(jié)扎12周后，出現(xiàn)室間隔增厚，左室射血分?jǐn)?shù)降低、NT-pro BNP增高，左房擴(kuò)大，SR-s、SR-a增高而SR-e降低。表明模型鼠出現(xiàn)了室壁肥厚、左心衰竭、左房重構(gòu)、左房?jī)?chǔ)庫(kù)與輔泵功能增加而管道功能降低。左房功能紊亂的血流動(dòng)力學(xué)機(jī)制可能為：心力衰竭時(shí)，由于左室舒張期充盈壓升高，左心室容量負(fù)荷逐漸加重，房室間壓差減小，從而導(dǎo)致舒張?jiān)缙谛氖覍?duì)心房的抽吸作用減低，左心房管道功能下降，后負(fù)荷增加；左房擴(kuò)大，儲(chǔ)備功能增強(qiáng)。根據(jù)Frank-Starling定律，左心房擴(kuò)大即左心房前負(fù)荷增加，心房肌收縮增強(qiáng)；另外，因左室收縮末容量和壓力增加，導(dǎo)致左房后負(fù)荷的增加亦使左心房纖維代償性收縮增強(qiáng)，因此輔泵功能增強(qiáng)。

目前，左房功能的無(wú)創(chuàng)性評(píng)估方法主要有斑點(diǎn)追蹤[10]、血流向量成像技術(shù)[11]、聲學(xué)定量技術(shù)等[12]。但用VVI技術(shù)評(píng)價(jià)左房功能，臨床較少見(jiàn)，亦無(wú)應(yīng)用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究的文獻(xiàn)報(bào)道[13]。本團(tuán)隊(duì)前期研究表明左心房的三大機(jī)械功能可以在應(yīng)變率曲線上定量評(píng)估：正向波收縮峰值應(yīng)變率反映儲(chǔ)庫(kù)功能，負(fù)向波舒張?jiān)缙趹?yīng)變率反映管道功能，負(fù)向波舒張晚期應(yīng)變率反映輔泵功能[14]。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)速度向量成像可定量評(píng)價(jià)大鼠左房功能。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：與假手術(shù)組比較，模型組SR-s（1.95±0.14 vs 0.96±0.07，P＜0.05）、SR-a增高（-1.32±0.19 vs -0.57±0.05，P＜0.05)，而SR-e降低（-0.36±0.05 vs -0.75±0.04，P＜0.05）。健心顆?；虮侥瞧绽委熀?，SR-s、SR-a降低而SR-e增加，說(shuō)明健心顆?；虮侥瞧绽梢越档托牧λソ叽笫笞蠓?jī)?chǔ)庫(kù)與輔泵功能、增加管道功能。

腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAAS）參與心力衰竭的多種病理功能，如：心臟重構(gòu)、心肌細(xì)胞凋亡、間質(zhì)纖維化等[15]。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑苯那普利能降低血Ang II水平，抑制心肌細(xì)胞凋亡與間質(zhì)纖維化。本實(shí)現(xiàn)表明，與模型組比較，苯那普利顯著降低血Ang II（328.93±42.09 vs 780.36±90.45，P＜0.05）水平，減少左房肌細(xì)胞凋亡數(shù)、降低CVF及Ⅰ、Ⅲ型膠原沉積。健心顆粒發(fā)揮與苯那普利類似的作用，可抑制血中Ang II水平，間接說(shuō)明其作用機(jī)制可能與抑制RAAS系統(tǒng)有關(guān)。健心顆粒由黃芪、紅參、蒲黃、丹參、豬苓、白術(shù)、桂枝、葶藶子組成。以黃芪、紅參為君，益氣通陽(yáng)以治其本；臣以生蒲黃、丹參活血化瘀，通利血脈；佐以豬苓、桂枝通陽(yáng)化飲利水；澤瀉、葶藶子宣肺利水為使藥?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明健心顆粒可以逆轉(zhuǎn)左室肥厚[16]，改善左室功能，降低血漿血管緊張素II水平，抑制左室心肌細(xì)胞凋亡[17]。本研究表明健心顆粒同樣可抑制左房肌凋亡與間質(zhì)纖維化。

總之，VVI技術(shù)可無(wú)創(chuàng)定量評(píng)價(jià)大鼠左房功能；健心顆?？筛纳菩乃ゴ笫笞蠓抗δ堋p輕左房肌細(xì)胞凋亡與膠原沉積，本實(shí)驗(yàn)從新的視角為健心顆粒治療心力衰竭提供了理論依據(jù)。但是，本實(shí)驗(yàn)尚需擴(kuò)大樣本量，進(jìn)行進(jìn)一步研究。