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        高效液相色譜法測定西藏不同地區(qū)蜂蜜中甲基乙二醛含量*

        2021-04-02 03:16:52王筱嬋劉夢蝶鄧永聰梁曉鳳彭文科
        廣州化工 2021年6期
        關(guān)鍵詞:乙二醛盧卡西藏地區(qū)

        王筱嬋,王 璐,劉夢蝶,鄧永聰,梁曉鳳,彭文科,杜 琳

        (成都師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,功能分子結(jié)構(gòu)優(yōu)化與應(yīng)用四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 成都 611130)

        近二十年來蜂蜜的抗菌性越來越為人們所熟知,人們?cè)絹碓蕉嗟膶⒎涿圻\(yùn)用于醫(yī)藥與生活中,蜂蜜的抑菌、殺菌作用近些年已近得到了國內(nèi)外專家學(xué)者的廣泛研究[1]。美國醫(yī)院采用因子指數(shù)20以上的麥盧卡蜂蜜來治療第一和第二等級(jí)的燒傷。

        一些研究表明新西蘭麥盧卡蜂蜜在去除過氧化氫后仍然具有較好的抗菌性。研究發(fā)現(xiàn)麥盧卡蜂蜜的抗菌活性并不依賴于其中的過氧化物,所以這種物質(zhì)被稱為非過氧化抗菌活性物質(zhì)(non-peroxide antibacterial activity,NPA)后來一些報(bào)道發(fā)現(xiàn)甲基乙二醛(MGO)可能是麥盧卡蜂蜜NPA中的主要物質(zhì)基礎(chǔ),并且發(fā)現(xiàn)麥盧卡蜂蜜中的甲基乙二醛含量與NPA的相關(guān)性高達(dá)0.98。人們稱贊麥盧卡蜂蜜獨(dú)特的抗菌性并開始研究麥盧卡蜂蜜,發(fā)現(xiàn)麥盧卡蜂蜜具有獨(dú)特的抗菌因子甲基乙二醛[2],其對(duì)大腸桿菌[2]、銅綠假單胞菌[3]等有較好的抑制作用,其強(qiáng)大的抗菌活性,具有獨(dú)特的營養(yǎng)保健功效。

        關(guān)于蜂蜜中甲基乙二醛含量的研究,國外的檢測方法建立較早。Weigel等[4]最早報(bào)道甲基乙二醛能與鄰苯二胺發(fā)生反應(yīng)得到喹噁啉類化合物,在反相色譜上有較好的保留,且紫外吸收強(qiáng)。Oelschlaegel[5]和Mavric等[6]確立的甲基乙二醛檢測方法都是在Weigel[7]的研究基礎(chǔ)上進(jìn)行了適當(dāng)修改。后來Windsor等[8]則更進(jìn)一步,采用了鄰-(2,3,4,5,6-五氟芐基)羥胺鹽酸鹽(PFBHA)做衍生試劑,能夠同時(shí)檢測蜂蜜中的甲基乙二醛、羥甲基糠醛和二羥基丙酮。國內(nèi)相關(guān)研究起步較晚徐麗等[9]用2,3-二氨基萘做衍生化試劑用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定了澳大利亞28個(gè)麥盧卡蜂蜜部分新西蘭和澳洲百花蜜中甲基乙二醛含量。陳磊等[10]利用鄰苯二胺做衍生試劑通過高效液相色譜法測定了新西蘭麥盧卡蜂蜜和中國不同產(chǎn)地的油菜蜜、荊條蜜、洋槐蜜等16個(gè)樣品中的甲基乙二醛含量。趙瓊暉等[11]用乙酸鈉提取蜂蜜中的甲基乙二醛后用2,4-二硝基苯肼做衍生化試劑,建立了超高效液相色譜檢測蜂蜜中甲基乙二醛含量的方法。

        國外Stephens[12]等報(bào)道,新西蘭卡盧卡蜜、三葉草蜜、Rewarewa蜜和甘露蜜中甲基乙二醛的含量均遠(yuǎn)低于麥盧卡蜂蜜。孫明輝等[13]報(bào)道柑橘蜜中甲基乙二醛的含量3.68~6.19 mg/kg,雜花蜜中甲基乙二醛的含量3.63~6.80 mg/kg。由此知道蜂蜜抗菌物質(zhì)甲基乙二醛含量是具有一定的地域特殊性,西藏地區(qū)平均海拔4000米以上,條件特殊氣候優(yōu)良,有大量珍貴蜜源植物,所產(chǎn)蜂蜜品質(zhì)極高,而國內(nèi)外的研究極少涉及西藏地區(qū)蜂蜜,既然蜂蜜甲基乙二醛含量具有地域特殊性,而西藏地區(qū)又是天然的蜂場,消費(fèi)者也多購買西藏蜂蜜,因此有必要開展西藏不同地區(qū)蜂蜜中甲基乙二醛含量的研究,有利于填充西藏蜂蜜研究的空白,還有利于發(fā)展民族特色產(chǎn)品,促進(jìn)蜂蜜產(chǎn)地的經(jīng)濟(jì)發(fā)展。

        1 實(shí) 驗(yàn)

        1.1 材料與試劑

        蜂蜜樣品:實(shí)驗(yàn)所用原蜜來自西藏日喀則市江孜縣(1~6)和西藏自治區(qū)山南市乃東區(qū)(7~10),西藏地區(qū)商品蜜(11~12)全部來自于成都四十一度蜂業(yè)有限公司,非西藏地區(qū)商品蜜(14~19)按蜜源植物分類主要有蕎麥蜜、洋槐蜜、紫云英蜜,分別來自江西汪氏蜜蜂園有限公司、湖北神農(nóng)蜂語生物產(chǎn)業(yè)有限公司、蜜愛蜜生物科技有限公司、安徽徽清堂有限公司、北京頤壽園蜂產(chǎn)品有限公司。實(shí)驗(yàn)共18個(gè)蜂蜜樣品。18個(gè)樣品產(chǎn)地及取蜜時(shí)間和種類如表1所示。

        表1 樣品基本情況(1~10原蜜,11~19商品蜜)Table 1 Basic information of the samples (number 1~10 were raw honeys, number 11~19 were commercial honeys)

        試劑:甲醇(CH3OH,色譜純);乙酸(CH3COOH,色譜純);鄰苯二胺(C6H8N2,分析純),Maclin公司;甲基乙二醛醛標(biāo)準(zhǔn)品(C3H4O2,40%水溶液),Maclin公司。

        儀器與設(shè)備:高效液相色譜儀,紫外光檢測器;Kromasil反相色譜柱C18(150 mm×4.6 mm×5 μm);FA2204N型電子天平,上海菁海儀器有限公司;SZ-93型雙重蒸餾水機(jī),上海銀澤儀器有限公司;移液槍,大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;濾膜(有機(jī)相0.22 μm,水相0.22 μm),天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司。

        1.2 實(shí)驗(yàn)原理與方法

        1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

        稱取甲基乙二醛標(biāo)準(zhǔn)品1.00 g溶解并轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中用二次蒸餾水稀釋并定容至刻度,得到4 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

        1.2.2 樣品的前處理

        衍生化試劑:稱取鄰苯二胺0.6 g溶解并轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中,用二次蒸餾水稀釋定容至刻度,配制成6 g/L的鄰苯二胺水溶液,用于衍生化反應(yīng)。

        標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液衍生化:將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液逐級(jí)稀釋為適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。用濃度不同的標(biāo)準(zhǔn)工作液分別和衍生化試劑1:1混合搖勻,在室溫條件下,避光衍生反應(yīng)8 h以上。

        衍生反應(yīng)式如下:

        樣品衍生化:稱取1.00蜂蜜溶于10 mL水中,取1 mL該蜂蜜水溶液與1 mL衍生化試劑混勻。在室溫條件下,避光衍生反應(yīng)9 h以上。

        1.2.3 樣品濃度測定

        以標(biāo)準(zhǔn)甲基乙二醛衍生化產(chǎn)物的峰面積為縱坐標(biāo),以甲基乙二醛溶液濃度為橫坐標(biāo),繪出標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。以標(biāo)準(zhǔn)工作曲線對(duì)實(shí)驗(yàn)樣品溶液濃度進(jìn)行定量。

        色譜條件:

        色譜柱:Kromasil反相色譜柱C18;

        流動(dòng)相:甲醇(A)-0.1%乙酸水溶液(B)梯度洗脫;

        0~5 min,30 % A;5~10 min,30%A~90%A;10~15 min,90% A;15~20 min,90%~30%A;

        20~25 min,30% A;

        流速:0.6 mL/min;

        柱溫:30 ℃;

        檢測波長:318 nm;

        進(jìn)樣量:10 μL;

        1.2.4 結(jié)果計(jì)算

        蜂蜜中甲基乙二醛含量的計(jì)算,結(jié)果按下式計(jì)算:

        式中:X——樣品中甲基乙二醛含量,mg/kg

        C1————樣品中甲基乙二醛濃度,mg/L

        C0————空白樣品中甲基乙二醛濃度,mg/L

        V————試樣體積,L

        m————樣品質(zhì)量,kg

        f————稀釋倍數(shù)

        2 結(jié)果與討論

        2.1 西藏原蜜甲基乙二醛含量比較分析

        實(shí)驗(yàn)選取西藏日喀則市江孜縣六種原蜜,西藏山南市乃東區(qū)四種原蜜??偣彩菰?,實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)與處理數(shù)據(jù)如表2所示。

        表2 西藏地區(qū)原蜜甲基乙二醛含量Table 2 Content of methylglyoxal in raw honey in Tibet

        此表中最高值來自于10號(hào)原蜜原蜜含量達(dá)5.87 mg/kg,最低值來自于2號(hào)原蜜含量為2.46 mg/kg。日喀則市江孜縣原蜜甲基乙二醛含量平均值為4.14 mg/kg,而山南市乃東區(qū)原蜜甲基乙二醛含量平均值較高為4.36 mg/kg,因此蜂蜜的甲基乙二醛含量可能與蜂蜜的產(chǎn)地有關(guān)。五月蜜含量達(dá)5.56 mg/kg,六七月蜜含量有所降低,因此蜂蜜的甲基乙二醛含量可能與蜂蜜的取蜜時(shí)間有關(guān)。

        2.2 西藏商品蜜甲基乙二醛含量比較分析

        對(duì)同一產(chǎn)地六、七月份商品蜜進(jìn)行MGO含量的測定,數(shù)據(jù)如表3所示。

        表3 西藏地區(qū)商品蜜甲基乙二醛含量Table 3 Content of methylglyoxal in commercial honey in Tibet

        由表3可知,西藏地區(qū)六七月商品蜜中甲基乙二醛含量均高于6 mg/kg,7月高于6月,說明蜂蜜的甲基乙二醛含量與蜂蜜的取蜜時(shí)間有關(guān),究其原因可能是不同月份蜜源植物可能有所不同因此影響蜂蜜中甲基乙二醛含量。六月蜂蜜的主要蜜源植物有,狼牙刺、藏怪柳、藏黃連等,七月蜜主要蜜源有野蕎麥、野雞兒、紫花苜蓿等,不同的蜜源植物使蜂蜜品質(zhì)有所差異,甲基乙二醛含量也不同。這與國外Marceau and Yaylayan[14]的研究結(jié)論一致。

        2.3 西藏原蜜與西藏商品蜜甲基乙二醛含量比較分析

        將實(shí)驗(yàn)所得的10種西藏地區(qū)原蜜中甲基乙二醛含量計(jì)算平均值與2種西藏地區(qū)商品蜜中甲基乙二醛含量平均值進(jìn)行分析。

        表4 西藏地區(qū)原蜜與商品蜜甲基乙二醛含量對(duì)比Table 4 Comparison of methylgoxal contents between raw and commercial honey in Tibet

        實(shí)驗(yàn)所測西藏地區(qū)原蜜中甲基乙二醛含量均低于6 mg/kg,最大值在山南市乃東區(qū)昌珠鎮(zhèn)2號(hào)蜂蜜中含量達(dá)5.87 mg/kg,最小值在日喀則市江孜縣年堆鄉(xiāng)含量為2.46 mg/kg,10個(gè)西藏地區(qū)原蜜樣品平均值為4.23 mg/kg,西藏地區(qū)商品蜜中甲基乙二醛含量均高于6 mg/kg,最大值在夜伴蜂聲七月蜜中含量6.92 mg/kg,最小值在夜伴蜂聲六月蜜中含量為6.04 mg/kg,2個(gè)西藏地區(qū)商品蜜樣品平均值為6.48 mg/kg。西藏地區(qū)商品蜜中甲基乙二醛含量約比西藏地區(qū)原蜜中甲基乙二醛含量高2.25 mg/kg左右。

        2.4 商品蜜甲基乙二醛含量比較分析

        實(shí)驗(yàn)選取2種西藏商品蜜和6種非西藏地區(qū)商品蜜來自于六個(gè)不同公司,進(jìn)行實(shí)驗(yàn)后按蜜源植物或取蜜時(shí)間進(jìn)行分類計(jì)算平均值,所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表5所示。

        表5 商品蜜甲基乙二醛含量Table 5 Content of methylglyoxal in commercial honey

        此表中14號(hào)蕎麥與18號(hào)紫云英蜂蜜中甲基乙二醛比其他公司同類蜂蜜含量都高。6種非西藏地區(qū)商品蜜中,14號(hào)蕎麥蜜中甲基乙二醛含量最高達(dá)31.20,15號(hào)洋槐蜜中甲基乙二醛含量最低為6.60 mg/kg,2種西藏商品蜜種,12號(hào)夜伴蜂聲七月蜜甲基乙二醛含量最高為6.92 mg/kg,11號(hào)夜伴蜂聲六月蜜最低為6.04 mg/kg。蕎麥蜜類平均含量最高,百花蜜類平均含量最低。孫明輝等[13]報(bào)道柑橘蜜中甲基乙二醛的含量3.68~6.19 mg/kg,雜花蜜中甲基乙二醛的含量3.63~6.80 mg/kg,西藏蜂蜜與之相比,含量較高,說明蜂蜜中甲基乙二醛含量可能與蜜源植物種類有關(guān),因?yàn)槲鞑胤涿鄄皇菃我幻墼捶涿?,蜜源植物來自天然野花,種類較多。

        Marceau and Yaylayan[14]的研究結(jié)論:蜂蜜中二羰基化合物水平(甲基乙二醛也是一種二羰基化合物)與蜜源植物有關(guān)且深色蜂蜜比淺色蜂蜜有更高的二羰基化合物水平。此實(shí)驗(yàn)所用蕎麥蜜顏色最深平均含量最高。

        3 結(jié) 論

        本文運(yùn)用高效液相色譜法測定并研究了共18個(gè)蜂蜜樣品中甲基乙二醛含量。研究顯示西藏日喀則市江孜縣原蜜甲基乙二醛含量為4.14 mg/kg,山南市乃東區(qū)原蜜中甲基乙二醛含量為4.36 mg/kg。兩種不同產(chǎn)地的西藏地區(qū)原蜜甲基乙二醛含量相差較小。同時(shí)按照時(shí)間來看,5月甲基乙二醛含量最高為5.56 mg/kg,其次為7月4.14 mg/kg,6月為3.96 mg/kg,表明蜂蜜中甲基乙二醛含量與蜂蜜的取蜜時(shí)間有關(guān)。

        西藏地區(qū)原蜜與商品蜜的對(duì)比中發(fā)現(xiàn),商品蜜中甲基乙二醛含量高于原蜜。

        與非西藏地區(qū)商品蜜的對(duì)比而言,西藏地區(qū)商品蜜中甲基乙二醛含量低于非西藏地區(qū)商品蜜中甲基乙二醛含量,這可能與蜜源植物種類不同有關(guān),西藏蜂蜜蜜源植物來自天然野花,種類較多,而非西藏蜂蜜多采用的是單一蜜源蜂蜜,其中以深色喬麥蜜含量最高。這也為西藏發(fā)展單一蜜源從而更好的優(yōu)化蜂蜜品質(zhì)提供了思路。

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