徐康 程強強 楊春霞 谷振軍 丁偉 李火根

摘要：為使速生濕地松良種快速大規(guī)模繁殖，對其胚性愈傷組織進行誘導和增殖優(yōu)化研究。該文以1代濕地松種子園中10個速生濕地松優(yōu)良無性系（基因型）的未成熟合子胚為外植體，系統(tǒng)研究基因型、合子胚發(fā)育階段、基本培養(yǎng)基、植物生長調(diào)節(jié)劑種類和濃度等不同因子對胚性愈傷組織誘導效率的影響，探討胚性愈傷組織的增殖條件。結(jié)果表明：基因型、合子胚發(fā)育階段、基本培養(yǎng)基及植物生長調(diào)節(jié)劑種類和濃度等均對胚性愈傷組織誘導有不同程度的影響。10個基因型均誘導出了胚性愈傷組織，其中以2號基因型誘導率最高，達到25.37%;合子胚發(fā)育階段中，以處于多胚階段的球果誘導率最高;四種基本培養(yǎng)基中，以在DCR基本培養(yǎng)基上誘導效果最佳;植物生長調(diào)節(jié)劑濃度及組合中以2，4D 2.0 mg·L1 + KT 2.5 mg·L1誘導率最高，達到27.78%。濕地松胚性愈傷組織增殖的最佳培養(yǎng)基為在DCR基本培養(yǎng)基上添加0.5 mg·L1 2，4D、1.0 mg·L1 KT、500 mg·L1 CH和300 mg·L1 L谷氨酰胺。綜上研究結(jié)果，為濕地松良種進一步開展成熟胚誘導及植株再生奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 濕地松， 未成熟合子胚， 體細胞胚胎發(fā)生， 胚性愈傷組織

中圖分類號：Q943.1

文獻標識碼：A

文章編號：10003142（2021）02028309

Abstract：In order to make the rapid and largescale propagation of fastgrowing varieties of Pinus elliottii， the induction and proliferation of embryogenic callus were studied. The immature zygotic embryos （with endosperm） of ten P. elliottii families were used to systematically study the effects of different factors on the induction efficiency of embryogenic callus， including genotype， the developmental stage of zygotic embryos， basic medium， types and concentrations of plant growth regulator （PGR）. At the same time， the proliferation conditions of embryogenic callus were discussed. The results were as follows： The genotype， the developmental stage of zygotic embryos， basic medium and types and concentrations of plant growth regulator （PGR） all had different degrees of influence on the induction of embryogenic callus. Embryogenic callus were induced in all ten genotypes， of which the induction rate of Genotype 2 was the highest， reaching 25.37%; In the stage of zygotic embryo development， the induction rate of cones at the multiple embryo stage was the highest; Among the four basic media， the induction effect on DCR basic medium was the best; The induction rate of 2，4D 2.0 mg·L1+KT 2.5 mg·L1 was the highest， reached 27.78%. The proliferation of embryogenic callus for P. elliottii was achieved on DCR medium， supplemented with 2，4D （0.5 mg·L1）， KT （1.0 mg·L1）， CH （500 mg·L1） and Gln （300 mg·L1）. This study laid a foundation for further developing mature embryo induction and plant regeneration of fastgrowing varieties of P. elliottii.

Key words： Pinus elliottii， immature zygotic embryo， somatic embryogenesis， embryonic callus

濕地松（Pinus elliottii）在20世紀30年代引入我國，因其表現(xiàn)出速生、產(chǎn)脂量高及適應性強等優(yōu)點在我國大規(guī)模推廣，現(xiàn)已成為我國南方地區(qū)主要造林樹種之一。速生和高產(chǎn)脂是濕地松良種選育的主要目標，迄今已選育出一批速生高產(chǎn)脂濕地松良種。目前，濕地松良種繁育仍以種子園種子的有性繁殖為主。雖然濕地松速生和高產(chǎn)脂種子園已更新至第二代，但傳統(tǒng)的種子繁育存在種子園世代更新慢、育種周期長、后代變異大、育種經(jīng)費高等問題。為了使選育出的濕地松良種得到快速推廣應用，且更好地保持良種的優(yōu)良特性，無性繁殖技術(shù)在良種繁育中顯得尤為重要。

植物體細胞胚胎發(fā)生（somatic embryogenesis）具有穩(wěn)定性好、繁殖系數(shù)高、同步化水平高等優(yōu)點（Gupta et al.， 1993），已成為植物無性繁殖研究中的熱點。胚性愈傷組織誘導是體胚發(fā)生的第一步，其誘導成功是否及質(zhì)量在體胚發(fā)生中處于關(guān)鍵地位。濕地松胚性愈傷組織誘導最早由日本學者Jain et al.（1989）開始研究，隨后Newton（1995）、Liao et al.（1995）、唐巍等（1997）、吳麗君（2009）、Newton et al.（2011）、張彩云（2016）及胡繼文等（2019）相繼對濕地松胚性愈傷組織進行了誘導，不同研究中胚性愈傷組織的誘導率存在顯著差異，有的研究中胚性愈傷組織誘導率高達49.0%，而有的僅為0.8%，甚至誘導失敗。與其他松科松樹的樹種（如火炬松、馬尾松、落葉松等）相比，濕地松胚性愈傷組織誘導率差異不明顯，楊模華等（2011）報道馬尾松胚性愈傷組織的平均誘導率為9.66%～22.59%，Pullman et al.（2006）通過在火炬松培養(yǎng)基中添加有機酸和維生素等提高了胚性愈傷組織誘導率，平均誘導率在13.2%～42.9%之間，而宋躍等（2016）報道長白落葉松胚性愈傷組織平均誘導率為3.11%～11.17%。

雖然對濕地松胚性愈傷組織誘導與增殖研究較多，但仍存在胚性愈傷組織誘導率低、愈傷組織質(zhì)量不高、增殖效果不理想等問題（Nunes et al.， 2018），且胚性愈傷組織誘導受基因型、合子胚發(fā)育程度、培養(yǎng)基種類及植物生長調(diào)節(jié)劑濃度等因素影響（Stasolla & Yeung， 2003）。因此，對于不同育種目標的濕地松良種很有必要開展胚性愈傷組織誘導與增殖研究。本研究以10個速生濕地松優(yōu)良無性系未成熟種子為材料，研究了不同基因型、合子胚不同發(fā)育時期、不同基本培養(yǎng)基、植物生長調(diào)節(jié)劑組合及濃度等對胚性愈傷組織誘導的影響，并探索了胚性愈傷組織最佳增殖培養(yǎng)條件，旨在為下一步體胚成熟和萌發(fā)研究奠定基礎(chǔ)，并為濕地松速生良種進一步快速繁殖利用提供技術(shù)支撐。

1材料與方法

1.1 材料

濕地松速生良種的未成熟種子采自江西省吉安市峽江縣林木良種場1代無性系種子園，選擇10株長勢好、結(jié)果量多，且后代速生特性明顯的無性系作為采種母樹，采種時間從6月24號開始至8月11號截止，每周采集一次，共采集8次，每次采集20～30個球果，球果采集后置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 外植體消毒與接種從冰箱中取出球果，剝出種子，選擇飽滿、發(fā)育良好種子去除種翅。在超凈工作臺內(nèi)，先用無菌水沖洗3次，轉(zhuǎn)入75%酒精中浸泡30 s，用無菌水沖洗3次后再轉(zhuǎn)入0.1%升汞中消毒7～8 min，然后用無菌水清洗3～5次，最后用無菌濾紙吸干表面水分，備用。

取出消毒好的濕地松種子于無菌培養(yǎng)皿中，用無菌解剖刀和鑷子去除種殼和種皮后置于誘導培養(yǎng)基上，每皿接種10粒，接種后用封口膜封口，置于培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)。

1.2.2 胚性愈傷組織誘導開展不同家系、不同基本培養(yǎng)基、不同取樣時間、不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合及濃度（2，4D、6BA和KT）等因素對濕地松胚性愈傷組織誘導影響的研究，誘導培養(yǎng)基中添加L谷氨酰胺300 mg·L1、水解酪蛋白500 mg·L1、蔗糖30 g·L1、卡拉膠7 g·L1;每種處理設(shè)置3個重復，（23 ± 1） ℃ 暗培養(yǎng)。接種后定期觀測種子變化，并于4～8周后統(tǒng)計愈傷組織和胚性愈傷組織的個數(shù)，計算誘導率。

1.2.3 胚性愈傷組織增殖選擇生長狀態(tài)一致的胚性愈傷組織置于不同植物生長調(diào)節(jié)劑濃度組合的增殖培養(yǎng)基上，DCR為基本培養(yǎng)基，添加麥芽糖30 g·L1、卡拉膠7 g·L1、L谷氨酰胺300 mg·L1、水解酪蛋白500 mg·L1。培養(yǎng)溫度（23±1）℃，濕度60%～65%，15 d后觀測愈傷組織生長狀態(tài)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

（胚性）愈傷組織誘導率（%） =誘導出（胚性）愈傷組織的未成熟合子胚數(shù)/接種的未成熟合子胚數(shù)×100，采用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，Duncan法進行多重比較。胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)時生長狀態(tài)用“+”表示程度。

2結(jié)果與分析

2.1 不同基因型對胚性愈傷組織誘導的影響

濕地松10個速生優(yōu)良基因型的胚性愈傷組織誘導效果見表1。從表1可以看出，不同基因型誘導胚性愈傷組織存在明顯差異，10個基因型中誘導率最高的為2號，達到25.37%，其次是5號和10號，誘導率最低的為17號家系，胚性愈傷組織誘導率僅為1.43%。方差分析結(jié)果顯示，2號基因型胚性愈傷組織組織的誘導率顯著高于其他基因型，而1號基因型的非胚性愈傷組織誘導率顯著高于其他基因型，說明不同基因型胚性愈傷組織誘導與非胚性愈傷組織誘導無相關(guān)性。

2.2 采集時間（合子胚發(fā)育時期）對胚性愈傷組織誘導的影響

從10個濕地松優(yōu)良家系中挑選誘導效果較好的10號家系開展不同采集時間（6月至8月）對胚性愈傷組織誘導的影響，結(jié)果見表2。從表2可以看出，胚性愈傷組織誘導率隨采集時間呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢，7月21號采集的球果胚性愈傷組織和非胚性愈傷組織誘導率均最高，分別達到11.29%和43.55%，其次是7月14號和7月7號，胚性愈傷組織誘導率分別為8.22%和4.55%，而6月24號、7月1號和8月11號則未誘導出胚性愈傷組織。方差分析結(jié)果顯示，未成熟合子胚的采集時間對胚性愈傷組織和非胚性愈傷組織誘導率有顯著影響，7月14號和21號采集球果的胚性愈傷組織誘導率顯著高于其他6個時期，尤其是以7月21號為最佳采樣時期。

在7月14日和7月21日采集的球果中隨機取出3～5個球果，先從球果不同部位取出種子，然后用解剖刀剝?nèi)シN殼和胚乳，得到合子胚，體視顯微鏡下觀察（圖1），發(fā)現(xiàn)7月14號種子中約有2/3處于裂生多胚階段（圖1：A，多胚明顯，胚體透明），即合子胚發(fā)育的第Ⅱ階段，1/3處于濕地松合子胚發(fā)育的第Ⅲ階段（圖1：B，胚頭清晰，漸變?yōu)榘咨煌该鳎?月21號采集的種子發(fā)育時期約有2/3處于濕地松合子胚發(fā)育的第Ⅲ階段，1/3種子處于合子胚發(fā)育的第Ⅳ階段（圖1：C，胚頭乳白色，不透明，開始發(fā)育為圓筒狀）。本研究最佳采集時期雖然與其他文獻報道有差異，但球果中大多種子合子胚發(fā)育階段處于第Ⅱ階段至第Ⅳ階段，與張彩云等（2016）研究結(jié)果一致。

2.3 不同基本培養(yǎng)基對胚性愈傷組織誘導的影響

保持植物生長調(diào)節(jié)劑配比和濃度不變，外植體在MS、 WPM、 DCR和B5四種不同基本培養(yǎng)誘導胚性愈傷組織效果存在一定差異（圖2）。其中：DCR和WPM為基本培養(yǎng)基時胚性愈傷組織的誘導率較高，分別為30.65%和25.40%;MS和B5為基本培養(yǎng)基時誘導率較低，分別為14.29%和7.14%，而非胚性愈傷組織在四種基本培養(yǎng)基上的誘導率均低于胚性愈傷組織。方差分析結(jié)果表明，在DCR和WPM培養(yǎng)基上胚性愈傷組織誘導率顯著高于MS和B5（P<0.05），而非胚性愈傷組織在四種培養(yǎng)基上的誘導率差異不顯著，說明DCR和WPM基本培養(yǎng)基更適合濕地松未成熟種子胚性愈傷組織誘導。

2.4 不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合及濃度配比對胚性愈傷組織誘導的影響

2，4D、6BA和KT三種植物生長調(diào)節(jié)劑及其

A. 合子胚發(fā)育第Ⅱ階段; B. 合子胚發(fā)育第Ⅲ階段; C. 合子胚發(fā)育第Ⅳ階段。

A. The second stage of zygotic embryo development;B. The third stage of zygotic embryo development;C. The fourth stage of zygotic embryo development。

組合對胚性愈傷組織誘導的影響結(jié)果見表3。從表3可以看出，不添加任何植物生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基中，沒有誘導出胚性愈傷組織;單一添加植物生長調(diào)節(jié)劑6BA、 KT和2，4D的培養(yǎng)基中只有2，4D能誘導胚性愈傷形成;當2，4D與6BA、KT組合使用胚性愈傷組織誘導率明顯高于各生長調(diào)節(jié)劑單獨使用，2，4D與KT組合使用明顯好于與6BA組合使用。方差分析結(jié)果顯示，不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合之間胚性愈傷組織誘導率存在顯著差異，其中2，4D 2.0 mg·L1+ KT 2.5 mg·L1中組合的胚性愈傷組織誘導率顯著高于其他植物生長調(diào)節(jié)劑組合，誘導率達到27.78%。

2.5 胚性愈傷組織的增殖培養(yǎng)

在DCR基本培養(yǎng)并添加 L谷氨酰胺300

A. 濕地松雌配子體;B. 誘導6周后的胚性愈傷組織;C. 胚性愈傷組織增殖;D. 體視顯微鏡下的胚性愈傷組織（10倍）。

A. Female gametophyte of Pinus elliottii; B. Embryogenic callus after six weeks of induction; C. Embryogenic callus proliferation; D. Embryogenic callus under stereoscopic microscope （10 fold）.

Fig. 3Induction and proliferation of embryogenic callus from Pinus elliottiimg·L1、水解酪蛋白500 mg·L1、麥芽糖30 g·L1、卡拉膠7 g·L1條件下，試驗了不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對濕地松胚性愈傷組織增殖的影響，在增殖試驗過程中，我們將試驗持續(xù)進行4次增殖，每隔15 d從上一代中取一團愈傷組織進行增殖，增殖過程中觀察愈傷組織的形態(tài)、顏色、生長速度、水漬化以及細胞表面突起形態(tài)，甚至細胞間粘連情況，結(jié)果如表4。從表4結(jié)果可以看出，2號植物生長調(diào)節(jié)劑濃度及配比條件下，胚性愈傷組織增殖效果最佳，愈傷組織增殖快、細胞間有粘性，且愈傷組織表面有突起，說明胚性愈傷組織在增殖過程中很好地保持了胚性（圖3）。

3討論與結(jié)論

濕地松胚性愈傷組織誘導與基因型、合子胚發(fā)育階段、基本培養(yǎng)基種類、植物生長調(diào)節(jié)劑種類及植物生長調(diào)節(jié)劑濃度等因素關(guān)系密切，是誘導成敗的關(guān)鍵因子（Pinto et al.， 2008）。外植體基因型在胚性愈傷組織誘導中起著關(guān)鍵作用，不同基因型對胚性愈傷組織誘導率的影響存在明顯差異。本研究選取的10個速生濕地松優(yōu)良無性系，胚性愈傷組織誘導率最高的為2號，誘導率達到25.37%，最低的為17號，誘導率僅為1.43%。相同的結(jié)果在火炬松（Pullman et al.， 2003;Tang，2001）、海岸松（Park et al.， 2006）、輻射松（Hargreaves et al.， 2009）及地中海松（Montalbán et al.， 2012）等中均有報道。因此，對于濕地松不同良種的快速利用，可以通過篩選并利用易誘導胚性愈傷組織的家系（基因型）進行誘導，以獲得更多的胚性系，為后期的無性快繁提供技術(shù)支持。

合子胚發(fā)育階段是影響胚性愈傷組織起始的關(guān)鍵因子之一，研究發(fā)現(xiàn)，在松屬樹種中處于早期發(fā)育階段的合子胚（未成熟合子胚）更有利于誘導胚性愈傷組織的產(chǎn)生（Montalbán et al.， 2012; Alvarez et al.， 2013）。本研究中隨著雌配子體中合子胚發(fā)育，胚性愈傷組織的誘導率呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢，誘導率最高的2個采樣時期（7月14日和7月21日），其球果中大多種子合子胚發(fā)育階段處于第Ⅱ階段至第Ⅳ階段，與以往研究結(jié)論一致。雖然文中誘導率最高的采樣時期與吳麗君（2009）采樣時期符合，與張彩云等（2016）采樣時期相差較大，但球果中合子胚發(fā)育階段（Ⅱ～Ⅳ）一致，采集球果時間上的差異可能與不同地區(qū)氣候條件有關(guān)，且同一時期采集的不同家系的球果發(fā)育時期也存在差異。因此，為了獲得較高的胚性愈傷組織誘導率，可以預先檢測一下合子胚的發(fā)育階段，根據(jù)發(fā)育階段確定最佳采樣時期。

培養(yǎng)基組成（基本培養(yǎng)基及植物生長調(diào)節(jié)劑種類和濃度等）做為影響胚性愈傷組織誘導的另一關(guān)鍵因子，在體胚誘導中舉足輕重。在松樹體胚發(fā)生技術(shù)研究中，發(fā)現(xiàn)DCR是體胚誘導較佳的基本培養(yǎng)基（胡繼文等，2018），這與本研究結(jié)論一致，四種基本培養(yǎng)中以DCR培養(yǎng)基上胚性愈傷組織誘導效率最高，達到30.65%。但也有報道稱濕地松未成熟種子在DCR培養(yǎng)上誘導胚性愈傷組織效率較低（Nunes et al.， 2018），這可能與不同基因型的濕地松對培養(yǎng)條件的需求不一致有關(guān)，也可能與合子胚發(fā)育階段等其他影響因素相關(guān)。相對于基本培養(yǎng)基而言，植物生長調(diào)節(jié)劑種類及其濃度對胚性愈傷組織誘導效率影響更大（張建偉等，2014;Nunes et al.， 2018）。本研究發(fā)現(xiàn)單獨使用一種植物生長調(diào)節(jié)劑效果不理想，2，4D濃度為2.0 mg·L1和KT濃度為2.5 mg·L1時，胚性愈傷組織誘導率最高，達到27.78%。

胚性愈傷組織繼代增殖時體胚發(fā)生的一個重要環(huán)節(jié)。研究表明，在培養(yǎng)基中添加適當濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑可以使胚性愈傷組織保持增殖，并保持胚性，但高濃度植物生長調(diào)節(jié)劑則會使胚性愈傷組織增殖速度降低，甚至導致體細胞胚成熟能力喪失等（宋躍等，2016），故需要調(diào)整植物生長調(diào)節(jié)劑濃度以獲得最佳增殖條件。本研究發(fā)現(xiàn)降低誘導培養(yǎng)基中植物生長調(diào)節(jié)劑濃度，其他條件不變，即胚性愈傷組織在含2，4D 0.5 mg·L1 、KT1.0 mg·L1的DCR培養(yǎng)基上增殖效果好，愈傷組織潔白、生長較快、愈傷表面有大量突起、無水漬化現(xiàn)象，細胞間有粘性。Klimaszewska et al.（2007）研究發(fā)現(xiàn)降低2，4D濃度獲得正常增殖的胚性愈傷組織，這與本研究的結(jié)論一致。

綜上所述，本研究以濕地松速生良種的未成熟種子為材料，成功誘導出胚性愈傷組織、篩選到易誘導的基因型、明確采樣時期、建立胚性愈傷組織誘導與增殖最適培養(yǎng)基，為下一步體胚誘導、成熟及萌發(fā)等奠定基礎(chǔ)。

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（責任編輯周翠鳴）