梁繼翔，焦 哲，嚴治山，李 旸，李棟祺，劉曉麗， 谷長勤，胡薛英，程國富，張萬坡

(華中農業(yè)大學 動物醫(yī)學院，武漢 430070)

小腸是仔豬食物消化和營養(yǎng)物質吸收的主要場所之一，腸絨毛是完成食物消化吸收的重要保障[1]。腸絨毛之間凹陷形成的隱窩結構主要用來合成新的腸絨毛上皮細胞[1]。腸絨毛上皮細胞主要由吸收性腸細胞、腸內分泌細胞、杯狀細胞(goblet cell，GC)和潘氏細胞等組成[2]。覆蓋在腸上皮細胞表面的黏液層是與外來食物或病原微生物接觸的前沿[2-3]。腸黏液層主要由GC分泌產物構成，所以GC對維持腸道內環(huán)境穩(wěn)態(tài)和腸上皮細胞的完整性尤為重要[2]。當腸道中GC缺失或分泌功能障礙往往伴發(fā)著腸道疾病[2-3]。

豬德爾塔冠狀病毒(porcine deltacoronavirus，PDCoV)為有囊膜的單股正鏈RNA病毒，屬于冠狀病毒科δ冠狀病毒屬[4]。PDCoV在中國香港首次被檢測報道之后陸續(xù)在全球多國發(fā)現(xiàn)[5-8]。臨床上PDCoV導致仔豬腹瀉、脫水和嘔吐等現(xiàn)象[8]。感染PDCoV的仔豬組織病理學觀察顯示小腸中絨毛萎縮、斷裂和上皮細胞變性壞死等[8-9]。腸道黏液層能及時清除外來病原微生物而對黏膜上皮細胞起到物理屏障保護作用[2,10]。腸道中由GC分泌的黏蛋白2(mucoprotein2, MUC2)是形成黏液層的主要成分之一[2]。研究表明Notch信號通路在腸道的發(fā)育過程中起著至關重要的作用[11]。腸道中Notch信號通路不僅可以促進腸黏膜上皮的增殖，而且可以調控黏膜上皮細胞的分化方向，從而調控腸黏膜上皮細胞數(shù)量與比例來適應不同環(huán)境下腸道功能結構的穩(wěn)定[11-12]。轉錄因子發(fā)狀分裂相關增強子1(hairy and enhancer of split-1，Hes1)作為Notch信號通路下游主要的靶基因決定著腸道上皮細胞的分化[2，12]。當Hes1被激活時，腸黏膜上皮細胞向著吸收細胞系分化，影響小腸分泌細胞數(shù)量[12]。腸道中Notch信號通路的激活可以抑制GC的形成和分化[11]。目前，關于PDCoV感染初生仔豬對小腸中GC的影響鮮有報道，因此作者通過仔豬感染試驗探究PDCoV對仔豬小腸中GC數(shù)量及Hes1和MUC2轉錄和表達的影響，以期闡明PDCoV對仔豬小腸黏膜損傷作用機制。

1 材料與方法

1.1 毒株與細胞系

PDCoV-CHN-HG-2017病毒株，由華中農業(yè)大學農業(yè)微生物國家重點實驗室何啟蓋教授饋贈。PK-15細胞(ATCC編號CCL-33)由本實驗室保存，用于PDCoV的培養(yǎng)增殖和TCID50測定。

1.2 動物試驗

湖北武漢某豬場購進6頭未吃初乳的初生大白仔豬，采集所有初生仔豬的直腸拭子RT-PCR檢測PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV呈陰性。隨機將6頭 初生仔豬分為對照組(Mock組)和感染組(PDCoV組)，每組各3頭。對照組和感染組分別安置在隔離器中。每4 h給仔豬喂新鮮液態(tài)代乳品的混合物。待靜養(yǎng)48 h后給感染組仔豬口服感染5 mL 1×105TCID50·mL-1PDCoV-CHN-HG-2017毒株，對照組口服5 mL DMEM培養(yǎng)基。感染后每小時監(jiān)測一次臨床癥狀并觀察記錄，當感染組出現(xiàn)明顯的腹瀉、嘔吐和脫水等臨床癥狀實施安樂死，并及時剖檢觀察，對仔豬十二指腸、空腸和回腸組織進行取樣，一份置于4%甲醛溶液中固定，另一份置于-80 ℃冰箱凍存。對照組仔豬在相對應時間點隨機選擇1頭實施安樂死并取材小腸樣品處理保存(同感染組仔豬)。

1.3 RT-PCR檢測PDCoV

取適當凍存的空腸組織樣品，分別采用諾唯贊生物科技有限公司RNA isolater Total RNA Extraction Reagen說明書提取組織中總RNA，用HiScript?Ⅱ Q RT Super Mix for qPCR (+gDNA wiper)逆轉錄為cDNA用于病毒的PCR檢測。參照GenBank中MF095123.1基因序列用Primer5.0軟件設計PDCoV-M引物，引物序列(表1)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。擴增反應體系為10 μL：2 ×TaqMaster Mix 5 μL，PCR Forward Primer 0.5 μL，PCR Reverse Primer 0.5 μL，cDNA 0.5 μL，ddH2O 3.5 μL。反應條件：95 ℃預變性5 min； 95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)35次； 72 ℃延伸7 min；4 ℃保存。

1.4 小腸組織病理學檢查和絨毛長度：隱窩深度分析

仔豬小腸組織用4%甲醛室溫固定48 h后，制備常規(guī)石蠟切片，厚4 μm。采用HE染色觀察小腸組織的病理變化。采用Nikon 80i生物光學顯微鏡和Image-Proplus軟件對每張組織切片選取測量結構完整的6根絨毛長度(villus height，VH)和6個隱窩深度(crypt depth，CD)，進行VH∶CD檢測分析。

1.5 PAS染色法和阿利新藍染色(AB)法檢測小腸中杯狀細胞

分別參照Servicebio品牌型號G1008-100ML說明書和參照Solarbio品牌型號G1560說明書對組織切片中GC進行PAS染色和AB染色。每張組織切片通過Nikon 80i生物光學顯微鏡選取6個視野觀察，通過Image-Proplus計數(shù)GC數(shù)量。PAS/AB染色的每張切片分別選擇至少6個結構完整的腸絨毛和隱窩進行GC計數(shù)。計算PAS/AB染色GC平均數(shù)(mean number of GC)，分別比較對照組和感染組PAS/AB染色(mean number of GC)/(mean number of VH：CD)值。

1.6 RT-qPCR檢測小腸中Hes1和MUC2的mRNA 轉錄水平

在NCBI上設計所需的引物序列并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物(表1)。同“1.3”的試驗方法分別提取小腸各段總RNA并逆轉錄合成cDNA，用ChamQ SYBR qPCR Master Mix在實時熒光定量PCR儀(ABI stepone plus)中進行qPCR，共40個循環(huán)，每個樣品3個重復，檢測β-actin、Hes1和MUC2的mRNA在仔豬小腸各段中的表達水平。

1.7 ELISA法檢測仔豬小腸中Hes1和MUC2的含量

參考文獻[10]試驗方法分別采用慧嘉生物技術有限公司批號202009的Porcine MUC-2 ELISA KIT和Porcine HES1 ELISA KIT試劑盒檢測小腸組織中MUC2和Hes1的含量。試驗操作步驟嚴格按照各試劑盒說明書進行，在Thermo全波長酶標儀(型號：GO)450 nm下檢測各孔OD值，計算各樣本含量。

表1 引物信息表

1.8 統(tǒng)計與分析

2 結 果

2.1 PDCoV病毒檢測

1%瓊脂糖凝膠核酸電泳結果顯示，擴增條帶在353 bp位置，與預期擴增片段的大小一致。從仔豬空腸組織RT-PCR檢測感染組仔豬均為陽性條帶，對照組仔豬均為陰性條帶，則感染組仔豬成功接種PDCoV(圖1)。

M. DL2000 DNA相對分子質量標準； N. 陰性對照； 1～3. 感染組仔豬空腸組織樣； 4～6. 對照組仔豬空腸組織樣 M. DL2000 DNA marker; N. Negative control; 1-3. Jejunum tissue of infected piglets; 4-6. Jejunum tissue of control group圖1 PDCoV的RT-PCR檢測電泳圖Fig.1 Detection of PDCoV by RT-PCR

2.2 小腸組織病理學檢查

仔豬小腸組織HE染色觀察結果顯示，對照組仔豬的十二指腸結構完整，無炎癥反應；空腸褶皺結構完整，腸絨毛較長；回腸結構完整，腸絨毛較長，派爾結發(fā)育正常(圖2 A～C)。感染組仔豬的十二指腸絨毛萎縮，固有層和黏膜下層炎性細胞浸潤；空腸絨毛嚴重萎縮變鈍，絨毛上皮細胞脫落，上皮細胞變性壞死，固有層充血；回腸絨毛嚴重萎縮、斷裂，固有層大量淋巴細胞浸潤(圖2 D～F)。

2.3 小腸各段絨毛長度和VH∶CD值

感染組仔豬小腸各段腸絨毛長度、腸絨毛長度與隱窩深度比值(VH∶CD)相對于對照組仔豬均降低，且差異顯著(P<0.05)。

2.4 仔豬小腸組織中杯狀細胞的PAS染色

仔豬小腸中的GC經PAS染色呈紫紅色(中性黏蛋白)，主要分布在腸絨毛和隱窩中，感染組仔豬小腸各段陽性信號均低于對照組仔豬(圖3 A～F)。小腸各段GC計數(shù)統(tǒng)計分析結果顯示，感染組仔豬小腸各段均低于對照組，差異顯著(P<0.001)(圖3 G～I)。

2.5 仔豬小腸組織中杯狀細胞的AB染色

仔豬小腸中的GC由AB染色呈藍色(酸性黏蛋白),主要分布在腸絨毛上皮和隱窩中，與PAS染色結果一致，感染組仔豬小腸各段陽性信號均低于對照組仔豬(圖4 A～F)。小腸各段GC計數(shù)統(tǒng)計分析結果顯示，感染組仔豬小腸各段均低于對照組仔豬，十二指腸(P<0.01)、空腸(P<0.05)和回腸(P<0.001) 差異顯著(圖4 G～I)。

2.6 小腸組織各段平均單個腸絨毛和隱窩中GC數(shù)量

由PAS染色和AB染色的小腸組織，各段平均單個腸絨毛和隱窩中GC數(shù)量顯示感染組仔豬小腸各段均低于對照組仔豬，且差異顯著(P<0.05)。

A～C. 對照組小腸組織病理學觀察結果; D～F. 感染組小腸組織病理學觀察結果 A-C. Histopathological observation results of small intestine in control group; D-F. Histopathological observation results of small intestine in infection group圖2 仔豬小腸組織病理學變化Fig.2 Histopathological changes in small intestine of piglets

表2 小腸各段腸絨毛長度與VH∶CD值

2.7 小腸各段組織中GC平均數(shù)與VH∶CD平均值的比值

參照文獻[3]方法對小腸各段組織GC的平均數(shù)(表3)與對應的小腸各段VH平均值∶CD平均值(表2)的比值(表4)進行統(tǒng)計，結果顯示感染組仔豬均低于對照組仔豬。采用PAS染色結果顯示，対照組仔豬小腸各段分別為3.98、3.21、11.58，感染組仔豬小腸各段分別為3.76、2.07、6.56。采用AB染色結果顯示，對照組仔豬小腸各段分別為4.55、3.70、11.79，感染組仔豬小腸各段分別為3.02、3.03、8.88。

2.8 小腸各段組織中Hes1和MUC2 mRNA相對轉錄量

結果顯示，感染組仔豬與對照組仔豬相比小腸各段Hes1 mRNA水平表達均有不同程度的升高，在空腸(P<0.01)和回腸(P<0.05)中升高明顯差異顯著，十二指腸(P>0.05)中無顯著差異(圖5A)。感染組仔豬與對照組仔豬相比小腸各段MUC2 mRNA水平表達均有不同程度降低，在十二指腸(P<0.05)和回腸(P<0.001)中降低明顯差異顯著，空腸(P>0.05)中無顯著差異(圖5B)。

2.9 PDCoV對初生仔豬小腸組織中Hes1和MUC2含量的影響

結果顯示，感染組仔豬與對照組仔豬相比十二指腸、空腸和回腸組織中Hes1含量均升高，在十二指腸(P<0.01)和回腸(P<0.01)中升高明顯差異顯著，在空腸(P>0.05)中無顯著差異(圖6 A)。感染組仔豬與對照組仔豬相比十二指腸、空腸和回腸組織中MUC2含量均降低，在十二指腸(P<0.01)和回腸(P<0.05)中降低明顯差異顯著，在空腸(P>0.05)中無顯著差異(圖6 B)。

A～F. 杯狀細胞在各組小腸各段AB染色結果； G～I. AB染色結果在各組小腸各段陽性率分析；*.P<0.005; **.P<0.01; ***.P<0.001 A-F. AB staining results in small intestine of per group; G-I. The positive rate of AB staining in each segment of small intestine was analyzed；*.P<0.05; **.P<0.01; ***.P<0.001圖4 仔豬小腸組織杯狀細胞AB染色結果及陽性率Fig.4 AB staining results and positive rate of goblet cells in small intestine of piglets

表3 小腸組織各段平均單個腸絨毛和隱窩中GC數(shù)量

表4 對照組和感染組(mean number of GC)/(mean number of VH：CD)值

A. 用qPCR檢測小腸各段Hes1的mRNA相對表達; B. 用qPCR檢測小腸各段MUC2的mRNA相對表達; *.P<0.05; **.P<0.01；***.P<0.001 A. Relative expression of Hes1 mRNA was detected by qPCR; B. Relative expression of MUC2 mRNA was detected by qPCR; *.P<0.05; **.P<0.01；***.P<0.001圖5 Hes1(A)和MUC2(B)的基因轉錄檢測Fig.5 Detection of Hes1 (A) and MUC2 (B) genes transcription

A. 用ELISA檢測小腸各段Hes1含量; B. 用ELISA檢測小腸各段MUC2含量; *P<0.05; **.P<0.01 A. The content of Hes1 in small intestine was detected by ELISA; B. The content of MUC2 in small intestine was detected by ELISA; *P<0.05; **.P<0.01圖6 仔豬小腸各段組織中Hes1(A)和MUC2(B)含量Fig.6 The content of Hes1 (A) and MUC2 (B) in small intestine of piglets

3 討 論

Zhang等[13]從腹瀉的哺乳仔豬糞便中分離出PDCoV-CHN-HG-2017病毒株，并通過口服10 mL 1×106TCID50·mL-1PDCoV-CHN-HG-2017毒株感染5日齡的仔豬驗證了病毒的致病性。本次試驗對未吃初乳的初生仔豬口服感染5 mL 1×105TCID50·mL-1PDCoV-CHN-HG-2017毒株觀察到的臨床癥狀為腹瀉、脫水和嗜睡，這與之前的研究結果相符[8,13-14]。Ma等[15]和Jung 等[16]對10～19日齡的仔豬感染PDCoV，24 h后觀察到仔豬腹瀉，并在直腸拭子中檢測到PDCoV。Zhang等[13]在PDCoV感染5日齡仔豬1 d后觀察到腹瀉癥狀，并通過RT-qPCR檢測了不同組織中病毒的拷貝數(shù)，發(fā)現(xiàn)空腸組織中相對較高。本試驗對仔豬空腸組織樣本進行RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)在22 hpi時呈陽性結果，這與之前報道相一致，表明初生仔豬感染試驗成功。Dong等[17]發(fā)現(xiàn)5日齡仔豬感染PDCoV后1 d有4/8出現(xiàn)臨床癥狀，21日齡仔豬感染同等劑量PDCoV后1 d有1/5出現(xiàn)臨床癥狀。Zhang等[13]在5日齡仔豬感染PDCoV后1 d觀察到腹瀉癥狀，在2～6 dpi觀察到更嚴重的臨床癥狀。本研究中初生仔豬分別在22、39和70 hpi出現(xiàn)明顯腹瀉、脫水和嗜睡等臨床癥狀，這可能與仔豬之間的個體差異和本次試驗感染病毒劑量有關。小腸組織病理學研究結果顯示感染組仔豬與對照組相比，十二指腸絨毛萎縮，空腸絨毛嚴重萎縮變鈍，上皮細胞變性壞死，固有層充血，回腸絨毛嚴重萎縮，大量淋巴細胞浸潤，這與之前的試驗結果相符[9,13,16]。小腸是仔豬重要的食物消化吸收場所之一，其豐富完整的腸絨毛與隱窩結構分別增加了腸道的有效吸收面積與絨毛上皮細胞的更換速率[1]。所以VH和VH∶CD值是用來衡量小腸黏膜功能完整性的重要指標[18]。本次試驗PDCoV感染仔豬引起小腸各段腸絨毛萎縮且差異顯著，感染組仔豬小腸各段的VH∶CD值均降低且差異顯著，導致感染組仔豬小腸的吸收和屏障功能下降，進而出現(xiàn)腹瀉和脫水現(xiàn)象。

腸黏膜上皮細胞往往是抵御外來病原體的第一道防線，在機體先天性免疫和適應性免疫中發(fā)揮著重要的作用[2]。黏液層覆蓋在腸黏膜上皮細胞表面能及時地清除外來病原體，對腸道具有潤滑和屏障作用[2,10]。GC分泌的多種因子在維持腸道組織穩(wěn)態(tài)中起重要作用，這些因子都有助于黏液層保護黏膜上皮細胞[2]。本試驗對小腸組織中GC進行PAS染色(中性黏蛋白)和AB染色(酸性黏蛋白)結果一致，感染組仔豬在小腸各段GC數(shù)量均不同程度低于對照組仔豬且差異顯著。這與Jung 等[3]對9日齡仔豬接種PEDV后引起空腸中GC數(shù)量顯著降低相似。Jung等[3]研究發(fā)現(xiàn)PEDV感染組仔豬和對照組仔豬空腸中GC的平均數(shù)與VH平均值∶CD平均值的比值，在感染后1 d分別為0.3(AB)/0.4(PAS)和2.3(AB)/2.5(PAS)，在感染后3 d分別為0.9(AB)/1.7(PAS)和2.6(AB)/3.0(PAS)，證明GC數(shù)量減少明顯與PEDV感染相關。本試驗比較分析了小腸各段組織切片GC的平均數(shù)與小腸各段的VH平均值∶CD平均值的比值，發(fā)現(xiàn)感染組仔豬與對照組相比在空腸和回腸減少明顯(表4)，這與Jung 等[3]的研究相似。表明PDCoV感染仔豬在空腸和回腸中對GC影響很大，這與研究報道PDCoV主要定位在空腸與回腸相符合[13-14]。Jung 等[3]通過免疫組織化學檢測PEDV發(fā)現(xiàn)部分陽性信號位于GC中。但本試驗感染組仔豬數(shù)量偏少，且未通過免疫組織化學檢測PDCoV在小腸各段的分布現(xiàn)象，所以是否PDCoV可以直接侵襲GC進而對GC的形成和分泌產生影響還需要試驗探討。

小腸的黏液層主要由GC分泌的MUC2、水和無機鹽等構成[19]。腸道致病微生物進入機體往往伴發(fā)著MUC2結構、功能和數(shù)量的改變，當黏液層變薄時外來病原體就可以直接侵襲腸上皮細胞導致炎癥或免疫反應等[10,19]。張麗霞等[20]研究發(fā)現(xiàn)牛源致病性大腸埃希菌K99感染小鼠后6～60 h小腸各段組織中的GC數(shù)量均顯著低于對照組，引起小腸黏膜上皮的損傷。吳異健等[21]研究發(fā)現(xiàn)番鴨呼腸孤病毒感染1日齡雛番鴨后在1～21 d小腸各段組織中GC數(shù)量均降低，引起腸道消化吸收功能障礙。王譽穎等[22]研究發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌可以提高腹瀉大鼠回腸中GC數(shù)量和促進MUC2的合成，進而減輕腹瀉對大鼠腸道黏膜的損傷。朱春洋等[23]研究發(fā)現(xiàn)四逆散可通過增加功能消化不良大鼠十二指腸中GC數(shù)量和MUC2的表達改善黏液屏障,從而起到治療功能消化不良作用。Notch信號通路是一條依賴于細胞間相互接觸傳遞的保守信號通路，在動物發(fā)育過程中發(fā)揮著極為重要的作用[12]。研究表明腸道中激活Notch信號通路可調控腸黏膜上皮細胞的增殖與分化，轉錄因子Hes1可作為Notch信號通路下游的靶基因抑制GC的分化[11-12]。Yang等[24]研究發(fā)現(xiàn)在LS174T細胞中通過RNA干擾下調numb基因可激活Notch信號通路，上調Hes1表達。在LS174TI細胞中敲除numb基因可降低MUC2蛋白的表達和喪失杯狀細胞表型分化[24]。本研究中PDCoV感染初生仔豬引起小腸各段組織Hes1 mRNA轉錄量和Hes1含量均升高，推測PDCoV感染仔豬激活小腸中Hes1的表達導致GC分化受到抑制，降低了小腸中GC數(shù)量，這與PAS染色和AB染色結果相對應。感染組仔豬與對照組相比小腸各段組織MUC2 mRNA轉錄量和MUC2含量均降低，這可能與PDCoV感染仔豬減少小腸組織中GC數(shù)量有關。

4 結 論

PDCoV感染初生仔豬引起小腸杯狀細胞數(shù)量明顯減少。原因可能是PDCoV激活了腸道Notch信號通路，使下游靶基因Hes1表達升高，抑制杯狀細胞的形成和分化，導致杯狀細胞數(shù)量減少和MUC2表達降低。