胡 月，高雁怩，加爾肯，車傳忠，王旭蕾，姜 平，冉多良*，劉建華

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，南京 210095)

馬皰疹病毒1型(equine herpesvirus-1， EHV-1)和4型(equine herpesvirus-4， EHV-4)是馬鼻肺炎(equine rhinopneumonitis，ER)的病原體，這兩種病毒均能引起馬屬動(dòng)物呼吸系統(tǒng)疾病[1]。然而，EHV-1除了可以引起馬匹呼吸系統(tǒng)疾病以外，還能導(dǎo)致孕馬流產(chǎn)和新生馬駒死亡及神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如馬皰疹病毒髓腦病(equine herpesvirus myeloencephalopathy，EHM)，且其所致疾病的病發(fā)率和死亡率均較EHV-4高[2-3]。由于EHV-1是一種引起馬匹不同臨床綜合征的病原體，給馬產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，2012年5月，世界衛(wèi)生組織將EHV-1引起的疾病稱為馬皰疹病毒-1型感染(infection with equine herpesvirus-1)[4]，2020年7月，我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部、海關(guān)總署將該病列為二類動(dòng)物傳染病[5]。

然而，長(zhǎng)期以來(lái)，我國(guó)的流行病學(xué)的研究重心一直放在馬鼻肺炎病的調(diào)查與防控上，忽略了區(qū)分EHV-1與EHV-4感染[6-8]。2013—2017年，針對(duì)新疆地區(qū)的馬鼻肺炎的流行病學(xué)調(diào)查顯示各地區(qū)平均陽(yáng)性率為15.16%～28.85%[9-13]。ER在新疆廣泛流行，但卻沒有針對(duì)EHV-1開展的流行病學(xué)調(diào)查，對(duì)EHV-1的防控工作帶來(lái)阻礙。為掌握新疆地區(qū)EHV-1的流行現(xiàn)狀，本研究于2019—2020年研究采集新疆不同地區(qū)代表性馬場(chǎng)的1 657份馬血清樣品，利用已建立的針對(duì)EHV-1 gG蛋白抗體的間接ELISA檢測(cè)方法[14]，進(jìn)行了血清學(xué)調(diào)查，并分析其流行特點(diǎn)和感染因素，為新疆馬皰疹病毒1型感染的有效防控提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 樣本

2019年6月—2020年7月，由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院和部分地區(qū)獸醫(yī)站從新疆烏魯木齊、伊犁州、昌吉州和巴州的16處規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)采集純血馬、混血馬、哈薩克馬、伊犁馬、焉耆馬、普氏野馬共1 657份血液樣本，分批離心制備血清，于-80 ℃保存后集中檢測(cè)。

1.2 試劑及儀器

TMB顯色液和DAB試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；ELISA酶標(biāo)板購(gòu)自康為世紀(jì)公司；兔抗馬IgG-HRP購(gòu)自Abcam公司；其他常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。酶標(biāo)分析儀(Elx800)購(gòu)自Bio-tek公司。

1.3 菌種、質(zhì)粒及抗體

表達(dá)EHV-1 gG蛋白的陽(yáng)性質(zhì)粒pGEX-4T-1-gG，感受態(tài)表達(dá)菌E.coliBL21(DE3)，EHV-1感染馬陽(yáng)性血清、陰性血清均由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院傳染病實(shí)驗(yàn)室保存。

1.4 檢測(cè)方法

將含有pGEX-4T-1-gG的陽(yáng)性菌大量誘導(dǎo)表達(dá)后，用GSTrapTM HP kits純化EHV-1 gG蛋白，并測(cè)定蛋白濃度。按照實(shí)驗(yàn)室已建立的間接ELISA方法進(jìn)行樣品檢測(cè)，反應(yīng)條件：抗原蛋白包被濃度為0.5 μg·mL-1；4 ℃過(guò)夜；50 g·L-1脫脂奶粉封閉，37 ℃ 2 h；待檢血清1∶800稀釋，37 ℃ 1 h； 二抗1∶1 000稀釋，37 ℃ 30 min；加TMB顯色液，37 ℃ 5 min；加1 mol·L-1H2SO4終止。每個(gè)樣品同時(shí)設(shè)置3個(gè)平行對(duì)照，設(shè)陰陽(yáng)對(duì)照。結(jié)果判定，樣品OD450 nm值>0.307可判為陽(yáng)性，OD450 nm值≤0.307可判為陰性。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

運(yùn)用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)不同品種、性別及年齡的馬匹EHV-1感染陽(yáng)性率采用卡方檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 不同地區(qū)馬血清馬皰疹病毒1型感染抗體檢測(cè)

來(lái)自16處規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)的1 657份血液樣本含有544份陽(yáng)性樣品，平均陽(yáng)性率為32.28%。烏魯木齊7處規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)平均陽(yáng)性率為39.34%(297/755)；伊犁州7處規(guī)?；瘓?chǎng)平均陽(yáng)性率為22.56%(155/687)；昌吉州1處規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)陽(yáng)性率為90.52%(86/95)；巴州1處規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)陽(yáng)性率為5.00%(6/120)(表1)。其中，昌吉州某養(yǎng)殖場(chǎng)陽(yáng)性率最高，烏魯木齊次之，與伊犁州和巴州相比差異顯著(P<0.05)。烏魯木齊養(yǎng)殖場(chǎng)感染EHV-1存在城郊差異，縣郊養(yǎng)殖場(chǎng)(烏魯木齊縣、達(dá)坂城區(qū))44.05%(270/613)與烏魯木齊市區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)(高新區(qū)、國(guó)有馬場(chǎng))19.01%(27/142)抗體陽(yáng)性率差異顯著(P<0.05)。伊犁州的不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)的養(yǎng)殖場(chǎng)感染EHV-1存在差異，昭蘇縣阿克達(dá)拉鎮(zhèn)陽(yáng)性率最高，達(dá)48.28%(28/58)，尼勒克縣陽(yáng)性率最低，僅為0.9%(2/222)。表明EHV-1感染在新疆馬群中存在地區(qū)差異。

表1 馬血清來(lái)源及其EHV-1抗體檢測(cè)結(jié)果

2.2 不同品種馬血清EHV-1抗體檢測(cè)

純血馬、混血馬、哈薩克馬、伊犁馬、焉耆馬、普氏野馬的EHV-1抗體陽(yáng)性率分別為20.34%、32.93%、44.92%、19.35%、5.00%、90.52%。其中，普氏野馬血清的EHV-1抗體陽(yáng)性率最高，顯著高于其他品種的馬(P<0.05)。焉耆馬血清的EHV-1抗體陽(yáng)性率最低，顯著低于其他品種的馬(P<0.05)(圖1)。本土品種(哈薩克馬、伊犁馬、焉耆馬)平均抗體陽(yáng)性率為31.70%(305/962)，與引進(jìn)品種(純血馬、混血馬)25.50%(153/600)差異顯著(P<0.05)；普氏野馬90.52%(86/95)與家馬29.32%(458/1562)的抗體陽(yáng)性率差異顯著(表2)。通過(guò)血清學(xué)檢測(cè)初步表明不同品種馬匹EHV-1抗體陽(yáng)性率差異顯著。

圖1 不同品種馬血清馬皰疹病毒1型抗體檢測(cè)結(jié)果Fig.1 The detection result of horse EHV-1 antibody in different breeds

2.3 不同性別、年齡馬血清EHV-1抗體檢測(cè)

統(tǒng)計(jì)(表2)表明，母馬感染EHV-1的抗體陽(yáng)性率為38.84%(414/1 066)顯著高于公馬22.00%(130/591)(P<0.05)，馬匹感染EHV-1存在性別差異。16處規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)飼養(yǎng)的馬匹年齡為0～15歲，可分為幼年(0≤Age≤1)、青年(1

3 討 論

此次EHV-1抗體陽(yáng)性率檢測(cè)結(jié)果表明，2019—2020年新疆部分規(guī)模化馬場(chǎng)EHV-1的平均陽(yáng)性率為32.28%。新疆烏魯木齊、伊犁州、昌吉州、巴州規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)普遍存在EHV-1感染，且不同地區(qū)、品種、性別及年齡的馬EHV-1感染率差異顯著(P<0.05)。其中，昌吉州某馬場(chǎng)飼養(yǎng)的普氏野馬發(fā)病率高達(dá)90.52%，該地區(qū)某養(yǎng)殖區(qū)于2019年5月 暴發(fā)馬皰疹病毒1型感染，圈養(yǎng)95匹野馬，其中，86匹野馬體溫升高至39.5～41.5 ℃，出現(xiàn)急性呼吸系統(tǒng)疾病， 6～7匹孕馬流產(chǎn)。2匹野馬死亡。86匹患馬經(jīng)血清學(xué)檢測(cè)均為EHV-1抗體陽(yáng)性，并經(jīng)病毒分離鑒定確診為EHV-1感染。普氏野馬為國(guó)家一級(jí)保護(hù)動(dòng)物，該物種具有6 000萬(wàn)年演化史，是研究家馬起源和性狀改良的不可或缺的材料[15]。此次，新疆昌吉州暴發(fā)該病為我國(guó)普氏野馬的繁育與保護(hù)帶來(lái)了嚴(yán)重危害，制約著該物種的健康發(fā)展和保存。制定合理的免疫程序，有效控制EHV-1在新疆的流行，對(duì)該珍貴物種的保存具有重大意義[16]。

表2 不同屬性馬匹感染EHV-1血清抗體檢測(cè)結(jié)果

對(duì)烏魯木齊的調(diào)查結(jié)果顯示，縣郊養(yǎng)殖場(chǎng)抗體陽(yáng)性率(44.05%)顯著高于市區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)(19.01%)。這與飼養(yǎng)環(huán)境及管理水平相關(guān)，縣郊養(yǎng)殖場(chǎng)主要飼養(yǎng)哈薩克馬，還包括混血馬和伊犁馬，多用于景區(qū)參觀，而市區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)僅飼養(yǎng)純血馬，用于賽馬和馬術(shù)活動(dòng)。由于引進(jìn)馬匹的經(jīng)濟(jì)成本較高，養(yǎng)殖場(chǎng)更注重飼養(yǎng)環(huán)境和消毒防疫工作，因而市區(qū)馬場(chǎng)的飼養(yǎng)管理水平較縣郊馬場(chǎng)高[17]。此外，市區(qū)馬場(chǎng)間隔較遠(yuǎn)，而縣郊馬場(chǎng)較為密集，不利于疫情防控[18]。提示當(dāng)?shù)貞?yīng)提高縣郊馬場(chǎng)的管理水平，降低飼養(yǎng)密度并做好疫苗接種工作。此次伊犁州7處規(guī)?；R場(chǎng)平均陽(yáng)性率為22.56%，低于2017年袁貝等[13]對(duì)伊犁州10個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)的調(diào)查結(jié)果(28.85%)。其中，伊犁州新源縣和尼勒克縣陽(yáng)性率為5.96%(18/302)，低于2016年杜潤(rùn)慈等[12]對(duì)兩縣的馬鼻肺炎抗體檢測(cè)結(jié)果(15.16%)。這可能與該地區(qū)EHV-4流行有關(guān)，本研究采用的EHV-1 gG蛋白抗體的間接ELISA檢測(cè)方法可以有效區(qū)分EHV-1和EHV-4感染，因此，可以準(zhǔn)確了解EHV-1感染情況。巴州焉耆縣集中飼養(yǎng)的本地品種焉耆馬EHV-1感染抗體陽(yáng)性率僅為5%。焉耆馬以群牧為主，因其具有持久耐勞的特性多用于馬術(shù)比賽，當(dāng)?shù)卣仓匾暱茖W(xué)飼養(yǎng)和防疫程序，積極開展焉耆馬養(yǎng)殖技術(shù)培訓(xùn)班，有效控制疫病傳播[19]。

統(tǒng)計(jì)表明，母馬EHV-1抗體陽(yáng)性率(38.84%)顯著高于公馬(22.00%)，且養(yǎng)殖場(chǎng)的母馬存欄量高于公馬，應(yīng)當(dāng)對(duì)母馬加強(qiáng)免疫預(yù)防該病。1歲以下馬匹EHV-1抗體陽(yáng)性率最高，其原因是5～6月齡馬駒獲得的母源抗體逐漸減少而自身免疫力較弱，與其他年齡階段馬匹相比更易于感染EHV-1[20-21]。研究表明，4～7月齡未斷奶馬駒及時(shí)進(jìn)行疫苗接種可有效預(yù)防EHV-1感染，因而養(yǎng)殖場(chǎng)應(yīng)重視對(duì)幼駒的預(yù)防接種工作[21]。

本研究通過(guò)對(duì)新疆部分地區(qū)規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)馬匹的血清抗體檢測(cè)，初步了解當(dāng)前新疆地區(qū)EHV-1感染的流行情況，為該病的防控提供數(shù)據(jù)支持。分析結(jié)果提示，科學(xué)的飼養(yǎng)管理和嚴(yán)格的防疫工作可有效控制EHV-1在馬群中的傳播，養(yǎng)殖場(chǎng)應(yīng)根據(jù)不同品種的馬匹特性，給予其良好的生長(zhǎng)環(huán)境；制定完善的免疫程序；對(duì)患馬應(yīng)及時(shí)隔離與治療；加強(qiáng)跨區(qū)運(yùn)輸馬匹EHV-1感染的監(jiān)測(cè)工作。

4 結(jié) 論

通過(guò)對(duì)新疆烏魯木齊、伊犁州、昌吉州、巴州規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行馬皰疹病毒1型抗體檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)新疆地區(qū)普遍存在EHV-1感染，且不同地區(qū)、品種、性別及年齡的馬匹EHV-1感染率差異顯著(P<0.05)，可為新疆地區(qū)EHV-1感染的研究和防控工作提供調(diào)查數(shù)據(jù)。