張 萌，劉英楠，謝振華，敖清瑩，呂 璐， 于婉琪，金文杰，秦愛建，扈榮良，陳鴻軍*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241； 2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院 軍事獸醫(yī)研究所，長春 130122；3.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，揚(yáng)州 225009)

非洲豬瘟(African swine fever, ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)引起的一種急性、烈性、高度接觸性傳染病，死亡率可高達(dá)100%[1-2]，被我國列為一類動(dòng)物疫病、世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為法定報(bào)告疫病。ASFV是非洲豬瘟相關(guān)病毒科(Asfarviridae)非洲豬瘟病毒屬(Asfivirus)的成員[6]。ASFV病毒粒子直徑為260～300 nm，為二十面體對(duì)稱[7]，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，不同毒株基因組全長不同，為170～194 kb，中央保守區(qū)為125 kb，基因組差異主要取決于基因組兩端可變區(qū)的多基因家族[8]。

ASFV含有151～167個(gè)開放性閱讀框(ORF)，成熟的病毒粒子中約含50種以上結(jié)構(gòu)蛋白[9]。其中，由pp220水解產(chǎn)生的p150、p37、p34和p14和由pp62水解產(chǎn)生的p35、p15，均存在于成熟病毒粒子中，占結(jié)構(gòu)蛋白總質(zhì)量的30%[10-12]。已有研究表明：ASFV蛋白水解酶pS273R蛋白能夠識(shí)別Gly-Gly-Xaa水解位點(diǎn)裂解病毒多蛋白pp220和pp62，產(chǎn)生上述6種主要結(jié)構(gòu)蛋白。pS273R編碼1個(gè)31 ku的蛋白質(zhì)，包含1個(gè)“核心域”，具有SUMO-1樣蛋白酶保守的催化殘基。有研究表明,S273R蛋白酶的水解加工可以影響病毒滴度，抑制pS273R蛋白的水解過程，會(huì)導(dǎo)致二十面體病毒粒子的組裝缺陷[13]。因此，該蛋白酶功能研究將有助于認(rèn)識(shí)ASFV復(fù)制過程。本研究通過原核表達(dá)ASFVS273R基因，制備純化抗原免疫小鼠，通過細(xì)胞融合，成功制備獲得pS273R單克隆抗體。該蛋白抗體旨在為S273R基因缺失毒株的鑒定及pS273R蛋白酶的功能研究提供生物材料。

1 材料與方法

1.1 病毒、細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

非洲豬瘟病毒強(qiáng)毒株SY18株由軍事獸醫(yī)研究所保存，并在生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室中在豬原代肺泡巨噬細(xì)胞(PAM)和豬原代骨髓細(xì)胞(BM)中擴(kuò)增及測定感染復(fù)數(shù)；人胚腎細(xì)胞系(HEK-293T)由本實(shí)驗(yàn)室保存；SPF級(jí)6～8周齡BALB/c小鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.2 質(zhì)粒和主要試劑

pET-30a(+)、pCMV-2×Flag載體由本實(shí)驗(yàn)室保存；高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶購自美國Gibco公司；DH5α和BL21(DE3)感受態(tài)購自美國Invitrogen公司；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、HindⅢ購自英國NEB公司；T4 DNA連接酶購自美國Promega公司；Phanta?Max Super-Fidelity DNA Polymerase購自南京諾唯贊生物科技有限公司；HRP標(biāo)記兔抗Flag抗體、HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG和Alexa Fluor?488標(biāo)記羊抗鼠IgG購自英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司；ECL顯色液購自Pierce公司；GM-CSF購自美國R&D Systems公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑和IPTG購自美國Sigma公司。

1.3 S273R基因的合成與重組質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)ASFV SY18毒株S273R基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物，上游為EcoRⅠ-S273R-F：5′-CCGGAATTCATGTCTATATTAGAAAAAATTAC-GTCAAGT-3′；下游為HindⅢ-S273R-R：5′-CCCAAGCTTTTATGCGATGCGAAACAGATG GGTTCTAAA-3′，以SY18病毒基因組DNA為模板，進(jìn)行S273R基因擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系50 μL：2×Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 25 μL、 上下游引物各2 μL、DNA模板50 ng，ddH2O補(bǔ)至50 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min； 95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共33個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳后回收并純化目的片段。目的片段和pET-30a(+)空載體分別經(jīng)EcoRⅠ/HindⅢ雙酶切，純化回收相應(yīng)目的片段，T4 DNA連接酶16 ℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，涂布于相應(yīng)LB平板，37 ℃倒置培養(yǎng)，菌液PCR鑒定正確后，送至上海擎科公司測序。測序正確的重組質(zhì)粒按照小提質(zhì)粒試劑盒說明書提取質(zhì)粒，命名為pET30-S273R。定量后,于-20 ℃保存。

1.4 S273R原核表達(dá)

將原核表達(dá)質(zhì)粒pET30-S273R轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落接種于卡那抗性的LB液體培養(yǎng)基，于37 ℃搖床中以 220 r·min-1搖菌12 h后，按1∶100將菌液轉(zhuǎn)接種到1 L卡那抗性LB培養(yǎng)基中搖菌約4 h即OD600 nm=0.6～0.8后，分別加入終濃度為0.5和1.0 mmol·L-1IPTG，37 ℃培養(yǎng)6 h后，4 ℃ 12 000×g離心10 min，收集菌體沉淀。沉淀經(jīng)PBS洗滌后，冰浴條件下進(jìn)行超聲破碎，12 000×g離心10 min后，分別取上清和沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE分析，鑒定表達(dá)情況并純化。

1.5 免疫小鼠血清抗體測定

將純化后的蛋白經(jīng)BCA蛋白測定試劑盒測定濃度后，腹腔注射免疫6～8周齡BALB/c小鼠：將100 μg蛋白與等體積弗氏完全佐劑混合并乳化完全，小鼠腹腔注射，首免之后隔7 d用等量不完全佐劑乳化，免疫2次，加強(qiáng)免疫3 d后尾靜脈采血，分離血清。利用IFA鑒定小鼠血清是否為陽性，即將ASFV SY18毒株按1 MOI感染PAM細(xì)胞24 h，用預(yù)冷的丙酮∶乙醇固定液(體積比3∶2)固定5 min， 或利用pFlag-S273R質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞24 h， 用固定液固定細(xì)胞產(chǎn)物。將多抗血清用PBS 1∶100稀釋，與固定的細(xì)胞于37 ℃反應(yīng)45 min，PBS洗3遍；加入1∶600稀釋的Alexa Fluor?488標(biāo)記羊抗鼠IgG，37 ℃反應(yīng)45 min，PBS洗3遍后，于倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.6 抗ASFV-S273R單抗制備

選血清抗體陽性反應(yīng)的小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫，72 h 后，按常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞融合和單抗篩選。通過有限稀釋法對(duì)檢出的陽性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行2～3次 亞克隆，直至抗體陽性率達(dá)100%時(shí)，擴(kuò)大培養(yǎng)并建株、保種。常規(guī)制備腹水，利用間接ELISA測定效價(jià)，并用免疫印跡(Western blot)和IFA進(jìn)一步鑒定后，對(duì)腹水進(jìn)行分裝，純化，置于-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 間接免疫熒光檢測

將pFlag-S273R質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞或用ASFV SY18毒株以1 MOI感染PAM細(xì)胞，24 h后使用預(yù)冷的固定液(丙酮、乙醇體積比3∶2)固定細(xì)胞5 min； PBS洗滌3次后，每孔加入100 μL含5%脫脂乳的PBS溶液，于37 ℃封閉1 h；PBS洗滌2次后，加入雜交瘤細(xì)胞上清，37 ℃孵育45 min；PBS洗3次，加入100 μL FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG，于37 ℃ 避光孵育45 min，洗滌3次后，置于熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.8 間接ELISA測定抗體效價(jià)

以pS273R蛋白作為檢測抗原，通過間接ELISA法測定抗體效價(jià)。即將抗原稀釋為濃度1 ng·μL-1， 按每孔100 μL包被ELISA板，4 ℃過夜；用PBST洗3次，每孔加入100 μL PBST稀釋的5%脫脂乳封閉液，37 ℃封閉2 h；充分洗滌后，加入單抗腹水(按不同稀釋度為1∶100、1∶200、1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、 1∶32 000、1∶64 000、1∶128 000)，每個(gè)稀釋度設(shè)置2個(gè)重復(fù)孔，以未免疫小鼠血清為陰性對(duì)照，以免疫pS273R蛋白小鼠血清為陽性對(duì)照，37 ℃ 孵育1 h，洗3次；每孔加入100 μL HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG(1∶2 000稀釋)，37 ℃孵育1 h，洗3次； 每孔加入100 μL TMB顯色液，至陰性對(duì)照顯色時(shí)，加入50 μL 2 mol·L-1H2SO4終止液，用酶標(biāo)儀測定OD450 nm值。

1.9 免疫印跡(Western blot)鑒定

以pFlag-S273R真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，24 h后，收集蛋白樣品，或以1MOI ASFV感染PAM，不同時(shí)間點(diǎn)收集蛋白樣品，再以常規(guī)方法進(jìn)行SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜(NC)。將NC膜用含5%脫脂乳的PBST溶液37 ℃封閉2 h，PBST洗3次，每次10 min；將小鼠多抗血清、單克隆抗體作為一抗，4 ℃孵育過夜后，PBST洗3次，每次10 min； 將HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG 1∶5 000稀釋作為二抗，室溫孵育1 h后，PBST洗3次，利用ECL顯色液顯色，通過成像系統(tǒng)成像。

2 結(jié) 果

2.1 S273R基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，在700～1 000 bp 可見單一擴(kuò)增條帶，條帶大小為822 bp與預(yù)期相符?；厥誔CR產(chǎn)物，經(jīng)雙酶切后，與載體質(zhì)粒pET-30a(+)連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)菌，挑取菌落，進(jìn)行菌液PCR，鑒定后測序驗(yàn)證。測序正確的重組質(zhì)粒命名為pET30-S273R。

2.2 S273R蛋白的原核表達(dá)

pET30a-S273R重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3))。挑取陽性菌落，經(jīng)兩種不同濃度IPTG誘導(dǎo)，設(shè)立未加IPTG誘導(dǎo)菌和空載體轉(zhuǎn)化菌樣本作為對(duì)照，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。結(jié)果顯示：在37 ℃誘導(dǎo)后，繼續(xù)培養(yǎng)6 h，S273R獲得高表達(dá)。通過對(duì)菌體裂解液的上清和沉淀分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白主要在包涵體中表達(dá)(圖1)，蛋白大小為37 ku。

2.3 pS273R蛋白純化SDS-PAGE分析及單抗Western blot驗(yàn)證

純化后的pS273R蛋白條帶較為單一，蛋白純度達(dá)90%以上，BCA法定量蛋白濃度為1.1 mg·mL-1，滿足后期免疫要求(圖2)。

1. pET30-S273R未誘導(dǎo)上清；2. pET30a-S273R IPTG 0.5 mmol·L-1上清；3. pET30-S273R IPTG 1.0 mmol·L-1上清；4. pET30a空載體上清；M. 預(yù)染蛋白相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 5. pET30-S273R未誘導(dǎo)沉淀；6. pET30-S273R IPTG 0.5 mmol·L-1沉淀；7. pET30-S273R IPTG 1.0 mmol·L-1沉淀；8. pET30a空載體沉淀 1. Supernatant of pET30-S273R without induction；2. Supernatant of pET30-S273R induced with 0.5 mmol·L-1 IPTG；3. Supernatant of pET30-S273R induced with 1.0 mmol·L-1IPTG；4. Supernatant of pET30a induced with 1.0 mmol·L-1 IPTG；M. Protein marker；5. Precipitation of pET30-S273R without induction；6. Precipitation of pET30-S273R induced with 0.5 mmol·L-1 IPTG；7. Precipitation of pET30-S273R induced with 1.0 mmol·L-1 IPTG；8. Precipitation of pET30a induced with 1.0 mmol·L-1 IPTG圖1 pS273R蛋白SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of pS273R protein

2.4 抗pS273R多抗血清的檢測

為驗(yàn)證多抗的特異性，將pFlag-S273R真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞、將SY18毒株以1 MOI感染豬肺泡巨噬細(xì)胞后分別固定，進(jìn)行免疫熒光檢測。IFA結(jié)果顯示，小鼠多抗血清可特異性識(shí)別293T細(xì)胞中表達(dá)的pS273R蛋白，且在ASFV感染的豬肺泡巨噬細(xì)胞胞質(zhì)呈陽性反應(yīng)(圖3)。

圖2 S273R蛋白純化SDS-PAGE分析(A)及多抗血清、5A4單抗Western blot驗(yàn)證(B、C)Fig.2 Expression of purified S273R protein by SDS-PAGE (A) and Western blot analysis of polyclonal sera (B) or monoclonal antibody named 5A4 (C)

A. pFlag-S273R轉(zhuǎn)染293T； B. 未轉(zhuǎn)染的293T；C. 感染24 hpi的PAM細(xì)胞；D. 未感染的PAM細(xì)胞 A. pFlag-S273R transfected 293T; B. Untransfected 293T; C. ASFV infected PAM cells for 24 h; D. Uninfected PAM cells圖3 S273R蛋白免疫熒光檢測(10×)Fig.3 Immunofluorescence assay analysis of S273R protein(10×)

2.5 pS273R單抗特性檢測

通過細(xì)胞融合，獲得4株特異性單抗。IFA結(jié)果顯示：5A4可與病毒感染和真核細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物呈陽性反應(yīng)(圖4)，1C12、5A3、7B9只能與真核細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物反應(yīng)。Western blot結(jié)果顯示：1C12、7B9可特異性識(shí)別ASFV病毒感染過程中產(chǎn)生的pS273R及真核細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物(圖5)，而5A3、5A4僅識(shí)別真核細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物的pS273R(表1)。經(jīng)ELISA效價(jià)測定，4株單抗腹水效價(jià)均達(dá)1∶64 000。

圖4 5A4間接免疫熒光圖片(PAM，10×)Fig.4 5A4 identification of indirect immunofluorescence assay of MAb 5A4 (PAM，10×)

圖5 7B9特異性識(shí)別ASFV pS273RFig.5 7B9 specifically recognizes ASFV pS273R

3 討 論

ASFV pS273R是一種半胱氨酸蛋白酶，在ASFV感染過程中，該蛋白酶對(duì)ASFV多聚蛋白前體pp220和pp62進(jìn)行水解，分別形成p150、p37、p34、p14和p35、p15、p8。上述蛋白組成致密的核衣殼，約占整個(gè)病毒粒子25%以上[12]。當(dāng)多聚蛋白不能被蛋白酶正確切割時(shí)，新組裝的子代病毒粒子呈現(xiàn)錯(cuò)誤包裝，易喪失傳染性[13]。

表1 ASFV pS273R單抗類型及免疫特性

從ASFV蛋白酶整體結(jié)構(gòu)來看，蛋白酶pS273R主要由兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成：N端手臂結(jié)構(gòu)域(N-ter arm domain)、C端核心結(jié)構(gòu)域(core domain)。pS273R蛋白酶的N端手臂結(jié)構(gòu)域是一個(gè)新結(jié)構(gòu)域，且該結(jié)構(gòu)域?qū)S持蛋白酶活性具有至關(guān)重要的作用；C端結(jié)構(gòu)域中則包含由催化三聯(lián)體Cys-His-Asn組成的核心結(jié)構(gòu)域，這部分結(jié)構(gòu)特征與典型半胱氨酸類蛋白酶的結(jié)構(gòu)相似[14]。

本研究進(jìn)行了pS273R單克隆抗體制備并成功獲得4株抗單克隆抗體，IFA結(jié)果顯示：5A4可與病毒感染和真核細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物呈陽性反應(yīng)，1C12、5A3、7B9只能與真核細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物反應(yīng)(圖3)。Western blot結(jié)果顯示：1C12、7B9可特異性識(shí)別ASFV病毒感染過程中產(chǎn)生的pS273R及真核細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物，而5A3、5A4僅識(shí)別真核細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物的pS273R(表1)。造成這一結(jié)果的差異性可能與pS273R的空間結(jié)構(gòu)和蛋白翻譯后修飾有關(guān)，具體原因還需進(jìn)一步分析。本試驗(yàn)獲得的單抗為S273R功能研究奠定了基礎(chǔ)，并為基因缺失毒的鑒定提供了生物材料。

4 結(jié) 論

成功獲得ASFV S273R重組蛋白，以其制備4株單克隆抗體，并篩選出與病毒具有反應(yīng)性的單克隆抗體，為ASFV S273R基因缺失毒的鑒別及S273R蛋白結(jié)構(gòu)功能等基礎(chǔ)研究提供了重要的生物材料。