郝江花，孫 娜，孫盼盼，孫耀貴，范闊海，尹 偉，李宏全*

(1. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，太谷 030801；2. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗動物管理中心，太谷 030801)

苦參堿是一類生物堿，廣泛存在于多種植物的根莖中，包括北豆根、槐角、苦參、山豆根、菟絲子等[1-2]?？鄥A具有多種藥理作用，包括抗病毒[3-4]、抗炎[5-7]、抗癌[8]等。本實驗室前期研究表明，苦參堿具有抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)的作用，對其典型病變間質(zhì)性肺炎有明顯的治療作用。PRRS是一種急性、接觸性、高度傳染性的疾病[9]，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[10]。PRRS的主要臨床癥狀是嚴(yán)重的呼吸道癥狀，通過組織切片觀察可見嚴(yán)重的間質(zhì)性肺炎[11]。在苦參堿抗PRRSV/PCV2共感染昆明小鼠的研究中，發(fā)現(xiàn)苦參堿各劑量處理組均能不同程度地減輕病毒感染誘發(fā)的肺間隔增寬等肺病變[9]；在PRRSV/LPS共刺激小鼠建立的間質(zhì)性肺炎模型中，苦參堿通過抑制白細(xì)胞的變化以及IL-1β和TNF-α的表達(dá)來改善 PRRSV/LPS共刺激誘導(dǎo)的間質(zhì)性肺炎[12]。目前，苦參堿抗PRRSV作用機(jī)制尚未完全闡明。基于苦參堿的抗炎作用，對苦參堿抗炎作用靶點、機(jī)制的挖掘?qū)⒂兄趯筆RRSV機(jī)制的深入研究。

在中國幾千年的歷史中，中藥在疾病預(yù)防和治療方面發(fā)揮著舉足輕重的作用，但由于人們在其發(fā)揮療效的作用靶點及機(jī)制方面認(rèn)識有限，嚴(yán)重限制了中藥的重新定位及作為新獸藥的開發(fā)利用[13-14]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)這一新興分支學(xué)科的興起，為中藥機(jī)制研究提供了新的技術(shù)和方法。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種以系統(tǒng)生物學(xué)和多向藥理學(xué)為理論基礎(chǔ)，利用生物分子網(wǎng)絡(luò)分析方法，在網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫查找、計算機(jī)虛擬計算以及高通量組學(xué)數(shù)據(jù)分析的基礎(chǔ)上構(gòu)建生物信息網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龅目茖W(xué)研究方法[15-16]。

利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，通過數(shù)據(jù)庫及在線分析平臺，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，通過Degree等屬性值篩選核心靶點，并通過分子對接技術(shù)進(jìn)行驗證；通過GO分析和KEGG分析尋找苦參堿潛在作用靶點的代謝通路，最終構(gòu)建“藥物-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)，從整體的角度探索苦參堿的抗炎機(jī)制。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對作用靶點進(jìn)行預(yù)測，為后續(xù)苦參堿抗病毒、抗炎的機(jī)制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 苦參堿靶點篩選

登錄Pubchem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)，通過搜索“Matrine”獲取苦參堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)，保存為sdf格式。然后將苦參堿的sdf格式文件上傳到反向藥效團(tuán)匹配數(shù)據(jù)庫PharmMapper(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)，選擇“Druggable Pharmacophore Models ”，設(shè)置匹配的靶點數(shù)目為300，點擊submit，即可得到苦參堿對應(yīng)得分排名前300的靶點。得到靶點后，使用UniProt數(shù)據(jù)庫中UniProtKB搜索功能，輸入蛋白名稱，經(jīng)上述數(shù)據(jù)庫檢索和轉(zhuǎn)化操作，將檢索得到的蛋白校正為其官方名稱，即Official Symbol。

1.2 抗炎靶點篩選

登錄GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)，以“Anti-inflammation”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，獲取并篩選與抗炎相關(guān)的靶點數(shù)據(jù)。

1.3 苦參堿抗炎靶點可視化分析

通過生物信息在線作圖平臺(http://www.bioinformatics.com.cn/)繪制韋恩圖，對苦參堿抗炎靶點進(jìn)行可視化處理。

1.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

登錄String數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)，導(dǎo)入苦參堿發(fā)揮抗炎作用的潛在靶點并選擇“homo sapiens”物種，獲取靶點蛋白相互作用關(guān)系；minimum required interaction score選擇medium confidence(0.400)并導(dǎo)出PPI互作圖和tsv文件；將tsv文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件繪制蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，利用Network Analyzer工具對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，節(jié)點大小和顏色深淺用于反映degree的大小，邊的粗細(xì)用于反映combine score的大小。利用Network Analyzer工具對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，選取節(jié)點連接度(degree)的兩倍中位數(shù)為篩選標(biāo)準(zhǔn)，以節(jié)點連接度(betweeness)、節(jié)點緊密度(closeness)的中位數(shù)作為篩選依據(jù)繪制Hithubs網(wǎng)絡(luò)，篩選核心靶點。

1.5 GO功能分析和KEGG通路分析

登錄DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)，導(dǎo)入苦參堿發(fā)揮抗炎作用的潛在靶點并選擇“homo sapiens”物種，select identifier設(shè)置為official gene symbol，list type設(shè)置為gene list，對苦參堿抗炎靶點進(jìn)行GO分析和KEGG通路分析，導(dǎo)出txt文件。將靶點數(shù)目進(jìn)行降序排列，對GO的3個 分支Biological Process、Molecular Function及Cellular Component靶點數(shù)排列前20的生物過程繪制柱狀圖；利用Bioconductor中的R包對靶點數(shù)排列前20的KEGG Pathway繪制氣泡圖。

1.6 藥物-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

登錄Cytoscape 3.7.2軟件(https://cytoscape.org/)，導(dǎo)入苦參堿抗炎靶點及通路信息，構(gòu)建“藥物-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.7 苦參堿與靶點分子對接驗證

登錄Pubchem數(shù)據(jù)庫，下載配體苦參堿結(jié)構(gòu)并保存為sdf格式，利用openbabel轉(zhuǎn)為mol2格式，利用AutodockTools1.5.6打開配體小分子，并加氫、加電荷、檢測配體的root、進(jìn)行可旋轉(zhuǎn)鍵的搜尋與定義，并保存為pdbqt文件。登錄RCSB Protein Data Bank，下載核心靶點蛋白IGFⅠ、MAPK8、CASP3、NR3C1的3D結(jié)構(gòu)，在AutodockTools1.5.6中打開，通過添加所有的氫原子、計算Gasteiger電荷、合并非極性氫后，將其定義為受體并保存成pdbqt文件。根據(jù)配體的位置，最終確定Vina分子對接的坐標(biāo)和盒子大小，為了增加計算的準(zhǔn)確度，將參數(shù)exhaustiveness設(shè)置為20。除了特別說明，其他參數(shù)均采用默認(rèn)值。采用Autodock vina 1.1.2進(jìn)行半柔性對接，選取affinity最佳的構(gòu)象，作為最終的對接構(gòu)象。選取對接結(jié)合能量最低的構(gòu)象用于對接結(jié)合模式分析，并使用PyMol進(jìn)行作圖。

2 結(jié) 果

2.1 苦參堿抗炎靶點的篩選

通過PharmMapper數(shù)據(jù)庫收集到118個苦參堿潛在作用靶點，通過GeneCards數(shù)據(jù)庫收集到263個抗炎靶點，將上述苦參堿靶點和抗炎靶點取交集，獲得23個苦參堿發(fā)揮抗炎作用的潛在靶點(表1)。

2.2 苦參堿抗炎靶點可視化分析

登錄生物信息在線作圖平臺，在成比例文氏圖(Venn diagram)的疾病靶點和藥物靶點中分別輸入抗炎靶點和苦參堿作用靶點，通過韋恩圖對苦參堿抗炎靶點進(jìn)行可視化(圖1)。

2.3 構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

將篩選出的23個苦參堿抗炎潛在靶點輸入String數(shù)據(jù)庫，限制物種為人，獲取蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(圖2)，節(jié)點數(shù)為23，邊數(shù)為52，預(yù)期的邊數(shù)為14，平均節(jié)點度值為4.52，平均局部聚類系數(shù)為0.524，PPI富集P值為4.44×10-15，保存為tsv文件。將文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，根據(jù)其度值繪制柱狀圖(圖3)，由圖可見度值排名前5的靶點包括IGFⅠ、MAPK8、CASP3、NR3C1及MAPK14；游離靶點包括PPARD、CYP2C9及LTA4H。利用Network Analyzer工具對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，選取節(jié)點連接度(Degree)的兩倍中位數(shù)(10.4)為篩選標(biāo)準(zhǔn)，以節(jié)點連接度(betweeness)中位數(shù)(0.007 761 435)和節(jié)點緊密度(closeness)中位數(shù)(0.567 297)作為篩選依據(jù)繪制Hithubs網(wǎng)絡(luò)，篩選核心靶點，結(jié)果見圖4。由圖4可知苦參堿抗炎核心靶點為IGFⅠ、MAPK8、CASP3、NR3C1。

2.4 GO功能分析和KEGG通路分析

將篩選出的23個苦參堿抗炎靶點輸入DAVID 數(shù)據(jù)庫，物種限定為人，進(jìn)行GO功能分析，共獲得116個富集結(jié)果。獲得生物過程(biological process)81個，細(xì)胞組分(cellular component)8個，分子功能(molecular function)27個。其中，生物過程涉及RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、類固醇激素介導(dǎo)的信號通路、凋亡過程的負(fù)調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)磷酸化等。細(xì)胞組分涉及核質(zhì)、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、受體復(fù)合物等。分子功能涉及蛋白質(zhì)結(jié)合、鋅離子結(jié)合、類固醇激素受體活性、序列特異性DNA結(jié)合、蛋白激酶活性等。將GO功能分析中生物過程、細(xì)胞組分、分子功能的degree值排列前20的過程繪制柱狀圖(圖5～7)。KEGG 通路分析共獲得47個通路，利用Bioconductor中的R包對靶點數(shù)排列前20的KEGG Pathway繪制氣泡圖(圖8)。

表1 苦參堿抗炎靶點

2.5 苦參堿-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將DAVID通路注釋得到的數(shù)據(jù)，通過Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建苦參堿靶點-代謝通路-疾病網(wǎng)絡(luò)模型(圖9)。Network Analyzer結(jié)果顯示，網(wǎng)絡(luò)節(jié)點數(shù)為71，網(wǎng)絡(luò)邊數(shù)為217，網(wǎng)絡(luò)密度為0.087，網(wǎng)絡(luò)直徑為4，網(wǎng)絡(luò)半徑為2，網(wǎng)絡(luò)中心度為0.483、網(wǎng)絡(luò)異質(zhì)性為1.217，最短路徑為4 970，特征路徑長度為2.378，平均網(wǎng)絡(luò)度為6.113。

2.6 苦參堿的分子對接驗證

選取Hithubs網(wǎng)絡(luò)中的4個核心靶點(IGFⅠ、MAPK8、CASP3、NR3C1)，利用AutoDock Vina軟件分別與苦參堿進(jìn)行分子對接(表2)。為了從分子水平闡明蛋白與化合物的作用模式，將苦參堿對接至核心蛋白的活性口袋，理論結(jié)合模式如圖10～13所示。由圖可以看出，苦參堿與CASP3蛋白氨基酸LYS53形成鍵長為3.4 ?的氫鍵作用；與IGFⅠ蛋白氨基酸TYR60形成鍵長為3.4 ?的氫鍵作用；與MAPK8蛋白氨基酸ASN156形成鍵長為3.4 ?的氫鍵作用;與NR3C1蛋白氨基酸ARG558形成鍵長為3.4 ?的氫鍵作用，這些相互作用使得蛋白與化合物形成復(fù)合物，由于IGFⅠ蛋白較小，對接結(jié)合自由能較高，因此，可能不是很穩(wěn)定，而蛋白MAPK8與苦參堿對接結(jié)合能較低，可形成穩(wěn)定的復(fù)合物。因此，MAPK8為苦參堿的最佳結(jié)合靶點。

圖1 苦參堿靶點和抗炎靶點交集Fig.1 Intersection of matrine and anti-inflammatory targets

圖2 苦參堿抗炎潛在靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.2 Potential target protein interaction network of matrine

3 討 論

目前，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)在藥物作用靶點的預(yù)測和機(jī)制的研究方面已取得良好的成效。沈汶等[17]在研究銀黃藥對的抗病毒作用機(jī)制時，運(yùn)用PharmMapper網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器、DAVID數(shù)據(jù)庫、String數(shù)據(jù)庫等預(yù)測關(guān)鍵蛋白，發(fā)現(xiàn)銀黃藥對抗病毒作用的靶點主要有CDK2、CDK7、SRC、DHFR、CHEK1、CCNA2等，可能通過抑制DNA前體合成來發(fā)揮抗病毒作用。崔琳琳等[18]在陳皮干預(yù)COVID-19機(jī)制研究中，利用TCMSP數(shù)據(jù)庫、GeneCards數(shù)據(jù)庫及分子對接技術(shù)等獲得MAPK、MAPK8、CASP3、MAPK1、PTGS2、CAT、PPARG、NOS2等核心靶蛋白，提示陳皮可能通過抗病毒、抗炎、調(diào)控細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)免疫等途徑，發(fā)揮抑制肺纖維化的作用。

圖3 苦參堿抗炎潛在靶點度值排序Fig.3 Order of anti-inflammatory potential target values of matrine

圖4 苦參堿抗炎靶點蛋白Hithubs網(wǎng)絡(luò)Fig.4 Hithubs network of matrine anti-inflammatory target proteins

圖5 苦參堿抗炎靶點的生物過程Fig.5 Biological process of matrine anti-inflammatory target

利用PharmMapper和Genecards數(shù)據(jù)庫挖掘到23個苦參堿抗炎靶點。利用String和Cytoscape數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，通過連接度(degree)、節(jié)點連接度(betweeness)、節(jié)點緊密度(closeness)篩選出4個核心靶點，即IGFⅠ、MAPK8、CASP3和NR3C1。IGFⅠ又被稱為胰島素樣生長因子Ⅰ(insulin-like growth factorⅠ,IGFⅠ)，是胰島素樣生長因子家族重要的一員。研究發(fā)現(xiàn)，IGFⅠ在免疫系統(tǒng)炎癥調(diào)節(jié)方面發(fā)揮著重要作用。小鼠感染流感病毒后IGFⅠ表達(dá)上調(diào)，IGFⅠ R磷酸化水平升高，促進(jìn)下游PI3K/AKT和MAPK8中的P38信號通路的激活進(jìn)而促進(jìn)炎癥反應(yīng)[19-20]。半胱天冬酶(caspase)是一類天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶家族，caspase-3是其最主要的成員之一[21]，被稱為細(xì)胞凋亡的代表性效應(yīng)CASP，最近也被稱為焦亡的炎性介質(zhì)。Suzuki等[22]在caspase-3缺陷小鼠免疫相關(guān)腎病研究中，發(fā)現(xiàn)caspase-3缺陷小鼠表現(xiàn)出腎炎癥、輕度脾腫大和炎性基因表達(dá)上調(diào)，表明caspase-3在炎癥反應(yīng)中起重要作用。NR3C1是糖皮質(zhì)激素受體基因(nuclear receptor subfamily 3, group C, member 1),糖皮質(zhì)激素(glucocorticoids,GC)是腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞分泌的一種類固醇激素，具有強(qiáng)大的抗炎和對組織細(xì)胞的免疫抑制作用[23]，廣泛用于治療包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和哮喘在內(nèi)的不同炎癥性疾病[24]。糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid reccptor,GR)是介導(dǎo)GC發(fā)揮作用的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，GC作用于NR3C1進(jìn)而抑制炎癥基因表達(dá)是抗炎有效性的核心[25]。MAPK8又被稱為c-Jun氨基末端激酶1(c-Jun N-terminal kinase 1,JNK1)，是MAPKs 家族的重要成員之一，在炎癥等病理過程中起著重要的調(diào)控作用[26-27]。研究表明，PRRSV感染能夠激活MAPK信號通路，促進(jìn)MAPK信號通路中JNK、p38和ERK1/2的磷酸化[28]。雷瑩瑩[28]在親和蛋白A對PRRSV增殖的影響及其作用機(jī)制的研究中，發(fā)現(xiàn)在親和蛋白A作用后，不影響PRRSV感Marc-145細(xì)胞中的JNK的表達(dá)，但明顯抑制其磷酸化過程。余志彬[29]在PRRSV誘導(dǎo)白介素-12產(chǎn)生的分子機(jī)制研究中，發(fā)現(xiàn)PRRSV感染可以誘導(dǎo)IL-12p40和IL-12p35的表達(dá)，且PRRSV對IL-12p40的誘導(dǎo)依賴于JNK-AP-1和NF-κB的信號途徑。Liu等[30]研究表明PRRSV可能通過TAK-1/JNK/AP-1途徑誘導(dǎo)IL-8的產(chǎn)生。運(yùn)用分子對接技術(shù)計算4個核心蛋白與苦參堿分子的結(jié)合能，結(jié)果可知MAPK8與苦參堿分子的結(jié)合能最低，形成的復(fù)合物最穩(wěn)定，因此，MAPK8可能是苦參堿發(fā)揮抗PRRSV作用的主要靶點。通過苦參堿抗炎作用靶點、通路的挖掘，為苦參堿抗PRRSV作用機(jī)制的深入研究奠定基礎(chǔ)。

圖6 苦參堿抗炎靶點的細(xì)胞組分Fig.6 Cellular components of matrine anti-inflammatory target

圖7 苦參堿抗炎靶點的分子功能Fig.7 Molecular function of anti-inflammatory matrine target

圖8 苦參堿抗炎靶點的KEGG分析Fig.8 KEGG analysis of matrine anti-inflammatory targets

圖9 苦參堿-靶點-通路的網(wǎng)絡(luò)模型Fig.9 Network model of matrine-target-pathway

表2 核心靶蛋白與苦參堿對接結(jié)果

a. 苦參堿與IGFI對接的整體圖； b. 苦參堿與IGFI對接的局部作用圖 a. Overall diagram of matrine docking to IGFI; b. Local action diagram of matrine docking to IGFI圖10 苦參堿與IGFI對接的最佳構(gòu)象相互作用示意圖Fig.10 Schematic diagram of the optimal conformational interaction of matrine docked to IGFⅠ

a.苦參堿與MAPK8對接的整體圖；b. 苦參堿與MAPK8對接的局部作用圖 a. Overall diagram of matrine docking to MAPK8; b. Local action diagram of matrine docking to MAPK8圖11 苦參堿與MAPK8對接的最佳構(gòu)象相互作用示意圖Fig.11 Schematic diagram of the optimal conformational interaction of matrine docked to MAPK8

a.苦參堿與CASP3對接的整體圖；b. 苦參堿與CASP3對接的局部作用圖 a. Overall diagram of matrine docking to CASP3; b. Local action diagram of matrine docking to CASP3圖12 苦參堿與CASP3對接的最佳構(gòu)象相互作用示意圖Fig.12 Schematic diagram of the optimal conformational interaction of matrine docked to CASP3

a. 苦參堿與NR3C1對接的整體圖；b. 苦參堿與NR3C1對接的局部作用圖 a. Overall diagram of matrine docking to NR3C1; b. Local action diagram of matrine docking to NR3C1圖13 苦參堿與NR3C1對接的最佳構(gòu)象相互作用示意圖Fig.13 Schematic representation of the optimal conformational interaction of matrine docked to NR3C1

4 結(jié) 論

MAPK8是苦參堿發(fā)揮抗炎作用的主要靶點，苦參堿可能通過作用于MAPK8這一關(guān)鍵蛋白發(fā)揮抗炎作用，進(jìn)而達(dá)到抗PRRSV的作用。