李 琦，?？≥x，王曉利，毛 靜，全映穎， 劉桂坤，雷顯前，朱鵬瑤，廖成水*

(1. 河南科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院/洛陽(yáng)市活載體生物材料與動(dòng)物疫病防控重點(diǎn) 實(shí)驗(yàn)室，洛陽(yáng) 471023；2. 河南科技大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，洛陽(yáng) 471023)

豬霍亂沙門(mén)菌(SalmonellaCholeraesuis)是一種廣泛存在于自然界中的革蘭陰性兼性厭氧菌，是引起仔豬副傷寒的主要病原菌[1]。同時(shí)，豬霍亂沙門(mén)菌亦可造成人類腸道外感染[2]。沙門(mén)菌、大腸桿菌、單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌等屬于常見(jiàn)的食源性病原菌。腸炎沙門(mén)菌和鼠傷寒沙門(mén)菌是人和動(dòng)物沙門(mén)菌病的主要血清型[3]，但豬霍亂沙門(mén)菌作為一種人獸共患致病菌引發(fā)的公共衛(wèi)生安全問(wèn)題仍不可被忽視[4-5]。細(xì)菌分泌的胞外產(chǎn)物在細(xì)菌與宿主互用過(guò)程中起著關(guān)鍵性作用，胞外產(chǎn)物有助于豬霍亂沙門(mén)菌侵襲宿主細(xì)胞，并在吞噬細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和增殖，從而導(dǎo)致人類和豬群產(chǎn)生炎癥、高燒和腹瀉等癥狀[6]。

核酸酶廣泛存在于各種微生物胞外產(chǎn)物中，在微生物感染和宿主免疫中發(fā)揮著重要作用[7]。胞外核酸酶可以分解外源DNA作為微生物生存的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)并且保護(hù)自身結(jié)構(gòu)不被破壞[8]。胞外核酸酶可以作為毒力因子在細(xì)菌侵入宿主機(jī)體時(shí)發(fā)揮作用[9]。大量的外源DNA能使宿主細(xì)胞表面的黏性分泌物增多，而胞外核酸酶可局部降解這些分泌物，從而導(dǎo)致細(xì)菌更容易附著在隱藏的細(xì)胞表面，有助于細(xì)菌成功感染宿主[10]。探究細(xì)菌胞外產(chǎn)物有助于揭示病原體的致病機(jī)制，但目前未見(jiàn)關(guān)于豬霍亂沙門(mén)菌胞外產(chǎn)物核酸酶活性的報(bào)道。

胞外誘捕網(wǎng)(extracellular traps，ETs)是新發(fā)現(xiàn)的一種由DNA和顆粒蛋白組成的固有免疫防御機(jī)制[11]，ETs廣泛存在于中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞和巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞，在體內(nèi)外可捕獲和殺滅細(xì)菌、病毒、真菌和寄生蟲(chóng)等絕大多數(shù)病原[12]。構(gòu)成ETs的主骨架是DNA，因此，DNA酶可降解這種結(jié)構(gòu)物質(zhì)。豬霍亂沙門(mén)菌胞外產(chǎn)物是否可降解ETs值得探究。為此，本研究通過(guò)平板培養(yǎng)法、瓊脂糖凝膠電泳法和瓊脂擴(kuò)散法觀察豬霍亂沙門(mén)菌胞外產(chǎn)物的核酸酶活性，同時(shí)分析不同溫度、pH和金屬離子對(duì)豬霍亂沙門(mén)菌胞外產(chǎn)物核酸酶活性的影響以及豬霍亂沙門(mén)菌胞外產(chǎn)物對(duì)巨噬細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(macrophage extracellular traps，METs)形成的影響，為豬霍亂沙門(mén)菌胞外產(chǎn)物在致病性和免疫逃避方面的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株與細(xì)胞系

豬霍亂沙門(mén)菌C78-1株、白色念珠菌ATCC 10231株和小鼠巨噬細(xì)胞細(xì)胞系J774A.1由洛陽(yáng)市活載體生物材料與動(dòng)物疫病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑

10×Loading Buffer購(gòu)自日本TaKaRa公司；瓊脂糖、瓊脂粉、核酸染料Goodview、氯化鈉和葡萄糖等購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；DNase I(1 000 U) 和10×DNase I Buffer購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；胰蛋白胨、酵母浸出物等購(gòu)自英國(guó)OXOID公司；λDNA、BCA蛋白質(zhì)定量分析試劑盒、胰蛋白酶、谷氨酰胺、青霉素和硫酸鏈霉素購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；高糖DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自Hyclone公司；Hoechst 33342和Sytox Green購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 豬霍亂沙門(mén)菌的復(fù)蘇及其胞外產(chǎn)物的收集

將-80 ℃保存的豬霍亂沙門(mén)菌C78-1株于LB固體平板進(jìn)行復(fù)蘇，然后挑取單個(gè)菌落于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 180 r·min-1震蕩培養(yǎng)12～16 h。將培養(yǎng)液按1∶10比例接種于新鮮LB液體培養(yǎng)基，37 ℃ 180 r·min-1繼續(xù)培養(yǎng)6 h后離心法收集上清液。然后用透析袋多次透析收集胞外產(chǎn)物，經(jīng)BCA蛋白質(zhì)定量分析試劑盒測(cè)定蛋白濃度后備用。

1.4 平板培養(yǎng)法觀察豬霍亂沙門(mén)菌胞外產(chǎn)物的核酸酶活性

用50 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)配制1.0% LB固體培養(yǎng)基，在倒板前添加終濃度分別為50 μg·mL-1的λDNA和1 μg·mL-1的核酸染料。用PBS稀釋新鮮培養(yǎng)的豬霍亂沙門(mén)菌，然后均勻涂布于LB固體平板上，37 ℃溫箱培養(yǎng)24 h，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察豬霍亂沙門(mén)菌單個(gè)菌落周?chē)摩薉NA是否被降解。

1.5 瓊脂擴(kuò)散法觀察豬霍亂沙門(mén)菌胞外產(chǎn)物的核酸酶活性

常規(guī)配制1.0%瓊脂平板，添加λDNA和核酸染料Goodview使得終濃度分別達(dá)到50 μg·mL-1和1 μg·mL-1。利用打孔器在瓊脂平板上打若干個(gè)直徑為5 mm的孔，封底后，分別添加胞外產(chǎn)物(5 μg·mL-1)、 DNase I(10 U)和LB液體培養(yǎng)基，37 ℃濕盒孵育24 h，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察孔周?chē)摩薉NA是否被降解。

1.6 瓊脂糖凝膠電泳法觀察豬霍亂沙門(mén)菌胞外產(chǎn)物的核酸酶活性

酶切體系(50 μL)：50 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)5 μL、λDNA(0.1 mg·mL-1)1 μL、豬霍亂沙門(mén)菌胞外產(chǎn)物(5 μg·mL-1)5 μL，補(bǔ)充ddH2O至總體積為50 μL，于37 ℃水浴鍋中進(jìn)行酶切反應(yīng)，孵育20 min，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析酶切情況。

1.7 不同溫度對(duì)豬霍亂沙門(mén)菌胞外產(chǎn)物核酸酶活性的影響

按照“瓊脂糖凝膠電泳法測(cè)定豬霍亂沙門(mén)菌胞外產(chǎn)物的核酸酶活性”的方法觀察溫度對(duì)豬霍亂沙門(mén)菌胞外產(chǎn)物(5 μg·mL-1)降解λDNA的影響，溫度設(shè)置16、25、30、37、42、50和60 ℃。同時(shí)，為觀察胞外產(chǎn)物核酸酶的耐熱性，胞外產(chǎn)物(5 μg·mL-1)分別經(jīng)65、70、75和80 ℃預(yù)處理20 min，然后按上文所述方法分析酶切變化情況。

1.8 不同pH對(duì)豬霍亂沙門(mén)菌胞外產(chǎn)物核酸酶活性的影響

按照“瓊脂糖凝膠電泳法測(cè)定豬霍亂沙門(mén)菌胞外產(chǎn)物的核酸酶活性”的方法觀察溫度對(duì)豬霍亂沙門(mén)菌胞外產(chǎn)物(5 μg·mL-1)降解λDNA的影響，反應(yīng)緩沖液的pH設(shè)置4.0(甲苯酸鹽緩沖液)、5.0(醋酸鹽緩沖液)、6.0(檸檬酸鹽緩沖液)、7.0(磷酸鹽緩沖液)、8.0(Tris緩沖液)、9.0(硼酸鹽緩沖液)、10.0(甘氨酸緩沖液)和11.0(甲胺緩沖液)，其他參數(shù)不變，然后按上文所述方法分析酶切變化情況。

1.9 不同金屬離子對(duì)豬霍亂沙門(mén)菌胞外產(chǎn)物核酸酶活性的影響

按照“瓊脂糖凝膠電泳法測(cè)定豬霍亂沙門(mén)菌胞外產(chǎn)物的核酸酶活性”的方法觀察金屬離子對(duì)豬霍亂沙門(mén)菌胞外產(chǎn)物(5 μg·mL-1)降解λDNA的影響，金屬離子設(shè)置Na+、K+、Ca2+、Co2+、Ba2+、Mg2+、Ni2+、Zn2+、Cu2+、Mn2+和Fe3+，使得反應(yīng)體系中金屬離子的終濃度分別為0.01、0.10、1.00、5.00和10.00 mmol·L-1， 其他參數(shù)不變，然后按上文所述方法分析酶切變化情況。

1.10 豬霍亂沙門(mén)菌胞外產(chǎn)物對(duì)白色念珠菌刺激巨噬細(xì)胞METs形成的影響

常規(guī)方法復(fù)蘇巨噬細(xì)胞J774A.10，取24孔細(xì)胞培養(yǎng)板按1×105個(gè)·孔-1加入巨噬細(xì)胞，孵育1 h 后加入新鮮培養(yǎng)好的白色念珠菌1×105CFU，培養(yǎng)基為不含胎牛血清和雙抗的DMEM，于5% CO237 ℃ 孵育2 h。然后加入胞外產(chǎn)物(5 μg·mL-1)、熱滅活胞外產(chǎn)物或DNase I。37 ℃孵育10 min后，輕輕去除上清液，加入Hoechst 33342和Sytox Green(5 μmol·L-1) 染料孵育5 min，利用熒光顯微鏡觀察METs形成的情況。同時(shí)，為了定量分析胞外誘捕網(wǎng)形成情況，按照同樣的試驗(yàn)條件和方法進(jìn)行巨噬細(xì)胞和白色念珠菌共孵育，培養(yǎng)基為不含胎牛血清和雙抗的無(wú)酚紅DMEM培養(yǎng)基。孵育結(jié)束后，加入Sytox Green(5 μmol·L-1)染料，于5% CO237 ℃ 作用5 min后，檢測(cè)METs的形成。以巨噬細(xì)胞空白對(duì)照組的熒光水平為1，從而分析各組METs形成的情況。在兩個(gè)試驗(yàn)中均設(shè)置豬霍亂沙門(mén)菌單獨(dú)感染巨噬細(xì)胞的對(duì)照研究。

2 結(jié) 果

2.1 平板培養(yǎng)法觀察豬霍亂沙門(mén)菌胞外產(chǎn)物的核酸酶活性

λDNA被核酸染料Goodview染色后在紫外線下觀察時(shí)顏色呈灰白色(圖1C)，而不含λDNA或者λDNA被降解后，在紫外線下觀察時(shí)顏色呈黑色(圖1A)。因此，當(dāng)LB固體瓊脂中均勻混合了λDNA，在紫外燈下觀察時(shí)瓊脂顏色呈灰白色，而如瓊脂上生長(zhǎng)的細(xì)菌分泌核酸酶，細(xì)菌周?chē)傊械摩薉NA可被降解，經(jīng)核酸染料Goodview染色后紫外線下觀察顯示菌落周?chē)傊憩F(xiàn)為黑色。在本試驗(yàn)中，將新鮮培養(yǎng)的豬霍亂沙門(mén)菌均勻涂布于含有λDNA和核酸染料的LB固體平板上，37 ℃溫箱培養(yǎng)24 h后，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果顯示，在紫外燈下豬霍亂沙門(mén)菌菌落周?chē)傊@示出一圈黑色區(qū)域(圖1B)，表明菌落周?chē)傊械摩薉NA已被降解，提示豬霍亂沙門(mén)菌生長(zhǎng)過(guò)程中可分泌具有核酸酶活性的胞外產(chǎn)物。

A.不含λDNA陰性對(duì)照組；B. 豬霍亂沙門(mén)菌組；C. 含λDNA陽(yáng)性對(duì)照組。白色箭頭所指黑色區(qū)域?yàn)棣薉NA被降解區(qū)域 A. Negative control without λDNA; B. The extracellular products from S. Choleraesuis; C. Positive control with λDNA. The white arrow represents λDNA digestion around colony圖1 平板培養(yǎng)法測(cè)定豬霍亂沙門(mén)菌胞外產(chǎn)物的核酸酶活性Fig.1 Detection of the nuclease activity of the extracellular products from S. Choleraesuis by agar culture assay

2.2 瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定豬霍亂沙門(mén)菌胞外產(chǎn)物的核酸酶活性

為單獨(dú)分析豬霍亂沙門(mén)菌胞外產(chǎn)物的核酸酶活性，收集豬霍亂沙門(mén)菌胞外產(chǎn)物加到含有λDNA和核酸染料的瓊脂平板孔中，如胞外產(chǎn)物具有核酸酶活性，在紫外線下就可顯示瓊脂孔周?chē)摩薉NA被降解。凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果顯示，37 ℃濕盒孵育24 h后，LB培養(yǎng)基陰性對(duì)照孔在紫外燈照射下周?chē)闯霈F(xiàn)顏色變化，而DNase I陽(yáng)性對(duì)照孔周?chē)霈F(xiàn)黑色環(huán)狀區(qū)域，胞外產(chǎn)物也出現(xiàn)相似的情況(圖2)，說(shuō)明豬霍亂沙門(mén)菌分泌的胞外產(chǎn)物具有降解λDNA的活性。

A. DNase I；B. 豬霍亂沙門(mén)菌胞外產(chǎn)物；C. LB培養(yǎng)基對(duì)照 A. DNase I; B. The extracellular products from S. Choleraesuis; C. LB control圖2 瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)豬霍亂沙門(mén)菌胞外產(chǎn)物的核酸酶活性Fig.2 Detection of the nuclease activity of the extracellular products from S. Choleraesuis by agar diffusion method

2.3 瓊脂糖凝膠電泳法觀察豬霍亂沙門(mén)菌胞外產(chǎn)物的核酸酶活性

為進(jìn)一步分析豬霍亂沙門(mén)菌胞外產(chǎn)物的核酸酶活性，收集豬霍亂沙門(mén)菌胞外產(chǎn)物與λDNA共孵育，瓊脂糖凝膠電泳可觀察λDNA降解情況。凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果顯示，LB液體培養(yǎng)基陰性對(duì)照組未顯示出降解λDNA的能力，DNase I陽(yáng)性對(duì)照組λDNA全部被降解，1 μg·mL-1胞外產(chǎn)物即表現(xiàn)出降解λDNA的能力，并隨著胞外產(chǎn)物濃度增加，λDNA逐漸被降解，并且在5 μg·mL-1時(shí)λDNA可被完全降解(圖3)。結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了豬霍亂沙門(mén)菌胞外產(chǎn)物具有核酸酶活性。

1.λDNA；2.DNase I + λDNA；3.LB + λDNA；4～8. 1、2、3、4 和5 μg·mL-1胞外產(chǎn)物 1. λDNA; 2. DNase I + λDNA; 3. LB + λDNA. 4-8. The extracellular products from S. Choleraesuis with 1, 2, 3, 4, and 5 μg·mL-1, respectively圖3 瓊脂糖凝膠電泳法測(cè)定豬霍亂沙門(mén)菌胞外產(chǎn)物的核酸酶活性Fig.3 Detection of the nuclease activity of the extracellular products from S. Choleraesuis by agarose gel electrophoresis

2.4 不同溫度對(duì)豬霍亂沙門(mén)菌胞外產(chǎn)物核酸酶活性的影響

為研究不同溫度對(duì)豬霍亂沙門(mén)菌胞外產(chǎn)物核酸酶活性的影響，在16、25、30、37、42、50和60 ℃下進(jìn)行酶切反應(yīng)。結(jié)果顯示，反應(yīng)溫度為16 ℃時(shí)胞外產(chǎn)

物降解λDNA的活性較弱，隨著孵育溫度增高，降解λDNA活性也逐漸增強(qiáng)，且反應(yīng)溫度達(dá)到42 ℃時(shí)表現(xiàn)出最強(qiáng)的核酸酶活性，但溫度繼續(xù)升高后(50和60 ℃)胞外產(chǎn)物核酸酶的活性被抑制(圖4A)。同時(shí)，胞外產(chǎn)物的耐熱性較差，經(jīng)65 ℃以上溫度處理后核酸酶活性被完全抑制(圖4B)。

2.5 不同pH對(duì)豬霍亂沙門(mén)菌胞外產(chǎn)物核酸酶活性的影響

為研究不同pH對(duì)豬霍亂沙門(mén)菌胞外產(chǎn)物核酸酶活性的影響，在pH 4.0～11.0條件下進(jìn)行酶切反應(yīng)。結(jié)果顯示，反應(yīng)pH為4.0和5.0時(shí)胞外產(chǎn)物表現(xiàn)出較弱的核酸酶活性，隨著反應(yīng)pH增高，降解λDNA活性也逐漸增強(qiáng)，且pH達(dá)到9.0時(shí)表現(xiàn)出最強(qiáng)的核酸酶活性，但pH繼續(xù)升高后(pH 10.0和11.0)胞外產(chǎn)物核酸酶的活性被抑制(圖5)。

2.6 不同金屬離子對(duì)豬霍亂沙門(mén)菌胞外產(chǎn)物核酸酶活性的影響

為研究金屬離子對(duì)豬霍亂沙門(mén)菌胞外產(chǎn)物核酸酶活性的影響，酶切反應(yīng)中添加濃度為0.01、0.10、1.00、5.00和10.00 mmol·L-1的Na+、K+、Ca2+、Co2+、Ba2+、Mg2+、Ni2+、Zn2+、Cu2+、Mn2+和Fe3+。結(jié)果顯示，Na+、K+、Ca2+和Ni2+對(duì)胞外產(chǎn)物的核酸酶活性沒(méi)有影響，高濃度(5.00～10.00 mmol·L-1)的Ba2+、Mg2+和Mn2+可提高胞外產(chǎn)物切割λDNA的活性，低濃度無(wú)影響；低濃度(0.01～1.00 mmol·L-1)的Zn2+、Cu2+和Fe3+促進(jìn)胞外產(chǎn)物切割λDNA的活性，高濃度無(wú)影響；相反地，低濃度(0.01～1.00 mmol·L-1) Co2+則抑制胞外產(chǎn)物切割λDNA的活性(圖6)，提示不同金屬離子對(duì)豬霍亂沙門(mén)菌胞外產(chǎn)物切割核酸酶活性的影響存在差異。

A. 胞外產(chǎn)物在不同孵育溫度下的核酸酶活性(1. λDNA；2～8. 分別代表反應(yīng)溫度為16、25、30、37、42、50和60 ℃)；B.胞外產(chǎn)物在高溫條件下的熱穩(wěn)定性(1～4.分別代表溫度為65、70、75和80 ℃) A. The nuclease activity of the extracellular products was measured at different temperature (1. λDNA; 2-8. Represent 16, 25, 30, 37, 42, 50 and 60 ℃, respectively); B. The heat stability of the extracellular products (1-4. Represent 65, 70, 75 and 80 ℃, respectively)圖4 溫度對(duì)豬霍亂沙門(mén)菌胞外產(chǎn)物核酸酶活性的影響Fig.4 Effect of temperature on the nuclease activity of the extracellular products from S. Choleraesuis

1.λDNA；2～9.分別代表pH在4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0下檢測(cè)胞外產(chǎn)物活性 1. λDNA; 2-9. Represent pH 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0 and 11.0, respectively圖5 pH對(duì)豬霍亂沙門(mén)菌胞外產(chǎn)物核酸酶活性的影響Fig.5 Effect of pH on the nuclease activity of the extracellular products from S. Choleraesuis

2.7 豬霍亂沙門(mén)菌胞外產(chǎn)物對(duì)白色念珠菌刺激巨噬細(xì)胞METs形成的影響

將巨噬細(xì)胞J774A.1與白色念珠菌ATCC 10231共孵育，經(jīng)Hoechst 33342染色后用熒光顯微鏡觀察。結(jié)果顯示，白色念珠菌可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生明顯的胞外DNA的纖維狀結(jié)構(gòu)(圖7B)，而未與白色念珠菌共孵育的細(xì)胞未見(jiàn)這種結(jié)構(gòu)物質(zhì)(圖7A)。當(dāng)往白色念珠菌誘導(dǎo)的胞外誘捕網(wǎng)加入5 μg·mL-1豬霍亂沙門(mén)菌胞外產(chǎn)物后，胞外DNA的纖維狀結(jié)構(gòu)物質(zhì)明顯減少(圖7C)，這種現(xiàn)象與DNase I陽(yáng)性處理組的結(jié)果相似(圖7D)，但經(jīng)熱滅活處理的豬霍亂沙門(mén)菌胞外產(chǎn)物組未見(jiàn)這種現(xiàn)象(圖7E)，說(shuō)明豬霍亂沙門(mén)菌胞外產(chǎn)物可抑制白色念珠菌誘導(dǎo)的胞外誘捕網(wǎng)。同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)豬霍亂沙門(mén)菌單獨(dú)與巨噬細(xì)胞共孵育時(shí)并不能刺激釋放METs(圖7F)。同樣地，熒光酶標(biāo)儀定量結(jié)果顯示，白色念珠菌刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度是未處理組的65倍左右，而加入豬霍亂沙門(mén)菌胞外產(chǎn)物，白色念珠菌誘導(dǎo)的胞外DNA含量顯著減少，約減少至未處理組的25倍左右，這與熒光顯微鏡觀察得到的結(jié)果一致(圖8)(P<0.01)。

各圖中離子濃度分別為0、0.01、0.10、1.00、5.00、10.00 mmol·L-1 The ion concentrations in the figures are 0,0.01,0.10,1.00,5.00 and 10.00 mmol·L-1, respectively圖6 金屬陽(yáng)離子對(duì)豬霍亂沙門(mén)菌胞外產(chǎn)物核酸酶活性的影響Fig.6 Effect of metal ions on the nuclease activity of the extracellular products from S. Choleraesuis

A.空白對(duì)照組；B.白色念珠菌組；C.白色念珠菌+胞外產(chǎn)物組；D.白色念珠菌+DNase I組；E.白色念珠菌+熱滅活胞外產(chǎn)物組；F.豬霍亂沙門(mén)菌組。白色箭頭所指為METs A. Control; B. Candida albicans; C. Candida albicans + the extracellular products; D. Candida albicans + DNase I; E. Candida albicans + the heat inactivated-extracellular products; F. S. Choleraesuis. The white arrow represents METs圖7 熒光顯微鏡觀察豬霍亂沙門(mén)菌胞外產(chǎn)物對(duì)白色念珠菌刺激METs形成的影響Fig.7 Effect of the extracellular products from S. Choleraesuis on METs induced by Candida albicans under fluorescence microscope

**.P<0.01圖8 定量分析豬霍亂沙門(mén)菌胞外產(chǎn)物對(duì)白色念珠菌刺激METs形成的影響Fig.8 Quantification of effect of the extracellular products on METs induced by Candida albicans

3 討 論

核酸酶主要參與機(jī)體的營(yíng)養(yǎng)代謝、遺傳物質(zhì)的復(fù)制、重組和修復(fù)機(jī)制以及病原感染和免疫等生理和病理過(guò)程[13]。具有核酸酶活性的胞外產(chǎn)物對(duì)于細(xì)菌進(jìn)入非吞噬細(xì)胞或在吞噬細(xì)胞中存活和增殖是必需的[14]。胞外核酸酶在細(xì)菌生物被膜形成過(guò)程中降解胞外DNA以提供自身的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如MR-1胞外核酸酶[15]。沙門(mén)菌基因組分析發(fā)現(xiàn)具有編碼核酸酶的基因，但豬霍亂沙門(mén)菌胞外產(chǎn)物的確切核酸酶活性卻未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)平板培養(yǎng)法、瓊脂糖凝膠電泳法和瓊脂擴(kuò)散法均證實(shí)了豬霍亂沙門(mén)菌分泌的胞外產(chǎn)物具有降解λDNA的核酸酶活性。

本研究利用瓊脂糖凝膠電泳法觀察了溫度、pH和金屬離子對(duì)豬霍亂沙門(mén)菌胞外產(chǎn)物的核酸酶活性的影響。微生物分泌的核酸酶在較寬的pH范圍(pH 6.0～10.0)可發(fā)揮活性，且一般情況下在pH 8.0～8.5的條件下活性最高[16]。豬霍亂沙門(mén)菌胞外產(chǎn)物的核酸酶活性在pH 4.0～6.0的酸性條件下胞外產(chǎn)物的核酸酶活性較弱，在pH為9.0的堿性條件下活性最強(qiáng)。35～44 ℃是絕大多數(shù)微生物核酸酶表現(xiàn)出活性的最佳溫度[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，豬霍亂沙門(mén)菌胞外產(chǎn)物在42 ℃時(shí)表現(xiàn)出較好的核酸酶活性。同時(shí)，多數(shù)核酸酶經(jīng)70 ℃作用30 min后活性可被滅活[17]，而豬霍亂沙門(mén)菌胞外產(chǎn)物在溫度高于60 ℃時(shí)核酸酶活性降低，這有可能是溫度的升高造成了酶蛋白或者酶核酸發(fā)生了變性。金屬離子對(duì)胞外產(chǎn)物的核酸酶活性具有多重影響[18]。Dunn[19]對(duì)大腸桿菌核酸酶活性的研究表明，大腸桿菌核酸酶是依賴二價(jià)金屬離子的核酸酶。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5.00～10.00 mmol·L-1Ba2+、Mg2+和Mn2+可提高豬霍亂胞外產(chǎn)物切割λDNA的活性；0.01～1.00 mmol·L-1的Zn2+、Cu2+和Fe3+促進(jìn)胞外產(chǎn)物切割λDNA的活性。雖然本研究初步證實(shí)了豬霍亂沙門(mén)菌胞外產(chǎn)物的核酸酶活性，但從核酸酶的部分酶學(xué)特性來(lái)看，豬霍亂沙門(mén)菌分泌的胞外產(chǎn)物可能含有多種核酸酶。

研究證實(shí)病原微生物通過(guò)分泌胞外核酸酶降解固有免疫細(xì)胞ETs的DNA骨架是逃避免疫殺傷的主要途徑之一[21]?；魜y弧菌、鏈球菌屬和金黃色葡萄球菌等病原菌的胞外核酸酶具有促進(jìn)降解中性粒細(xì)胞ETs從而逃避中性粒細(xì)胞ETs捕獲的能力[20-22]。本研究證實(shí)豬霍亂沙門(mén)菌胞外產(chǎn)物具有核酸酶活性，我們之前的研究發(fā)現(xiàn)白色念珠菌可刺激巨噬細(xì)胞釋放ETs[23]，而豬霍亂沙門(mén)菌胞外產(chǎn)物可降解這種胞外網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。同時(shí)豬霍亂沙門(mén)菌并不能刺激巨噬細(xì)胞釋放METs，推測(cè)豬霍亂沙門(mén)菌胞外產(chǎn)物可能與細(xì)菌免疫逃避有關(guān)。因此，分離和鑒定豬霍亂沙門(mén)菌胞外核酸酶的種類與特性以及分析豬霍亂沙門(mén)菌胞外核酸酶在感染和宿主免疫中的確切作用是我們下一步重點(diǎn)研究的方向。

4 結(jié) 論

豬霍亂沙門(mén)菌分泌的胞外產(chǎn)物具有降解λDNA的核酸酶活性，胞外產(chǎn)物可顯著降解白色念珠菌刺激巨噬細(xì)胞形成的胞外誘捕網(wǎng)。