魏 岳，李云雷，孫研研，武艷平，唐維國，陳繼蘭*，謝金防*

(1. 江西農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，南昌 330200； 2. 中國農業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所， 農業(yè)農村部動物遺傳育種與繁殖(家禽)重點實驗室，北京 100193)

精子活力是衡量精液質量的重要標準之一，精子活力低下引起的弱精癥主要表現為精子前向運動數量(A類和B類)的比例小于50%或快速直線前向運動數量的比例小于25%，其嚴重影響人和動物的生殖能力[1-3]，據不完全統(tǒng)計，每年有5%～12%的種公雞因產精能力低下而被淘汰[4]。中國地方雞中，由于各種因素普遍存在著精子活力偏低的問題，精子活力低下成為制約地方雞種產業(yè)化發(fā)展的限制因素之一。雞精子主要貯藏于輸精管中，精漿來自睪丸、附睪和輸精管，與哺乳動物相比，由于缺少副性腺，雞精液具有體積小、濃稠且精子密度大的特點。精漿是精子重要的環(huán)境載體，為精子提供營養(yǎng)和能量，其中的重要成分精漿蛋白影響精子在雌性生殖道中的貯存，參與精子獲能、頂體反應和免疫應答等諸多生殖過程[5-7]。目前，人和動物中對弱精癥的研究主要集中于精子、染色體異常或相關生殖器官病變的研究[8-10]，而對精漿的研究較少。富麗等[4]采用 RT-qPCR技術在公雞睪丸組織中進行檢測發(fā)現，COX7B、hPTGDS和WNT2等候選基因在弱精組個體睪丸中的表達量與正常個體相比有顯著差異。許紅等[11]研究發(fā)現，SOX5基因在弱精癥公雞睪丸中的表達顯著低于正常公雞，而且SOX5基因和蛋白的表達趨勢與公雞性成熟和繁殖機能衰退的趨勢一致，推測SOX5基因對公雞睪丸發(fā)育水平和精子活力具有重要調控作用。劉一帆[12]利用轉錄組學技術構建雞精子活力相關mRNA-miRNA-lncRNA 互作網絡和蛋白質互作網絡，預測到一個包括35個lncRNAs、119個mRNAs和18個miRNAs的調控因子集合。

本試驗以寧都黃雞作為研究對象，采用液相色譜-質譜聯用(LC-MS/MS)技術開展雞精漿蛋白組學的研究，篩選與弱精癥相關的差異蛋白，分析差異蛋白可能參與的調控通路以及在精子運動中的作用，為進一步闡明弱精癥的病理學基礎，尋找弱精癥診斷的新靶點并以提高繁殖性能為目標的分子育種奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和試劑

1.1.1 試驗材料 試驗動物為來自江西惠大實業(yè)有限公司寧都黃雞原種場同批次孵化的寧都黃雞公雞。篩選方法參考文獻[4]，從42周開始每隔3 d進行1次鏡檢，共進行3次，選擇前向精子比例<20%，且直線前向精子比例<10%的個體作為弱精組樣本，前向精子比例>80%，且直線前向精子比例>40% 的個體作為對照組樣本，每組各4只。

1.1.2 主要試劑 考馬斯亮藍G250、蛋白酶抑制劑混合物和BCA試劑盒均購自北京康為世紀生物科技有限公司；10% SDS-PAGE預制膠購自伯樂生命醫(yī)學產品(上海)有限公司；肽N-糖苷酶F(PNGase F)購自NEB(北京)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品制備 采集寧都黃雞公雞精液，按精液體積加入蛋白酶抑制劑混合物(終濃度為1%)，4 500×g 4 ℃離心10 min；吸上清，重復2～3次。采用BCA法測定上清液總蛋白濃度，-80 ℃保存。

1.2.2 蛋白質去糖基 取30 μg總蛋白，加入0.8 μL PNGase F，100 ℃消化10 min。

1.2.3 SDS-PAGE 取25 μg去糖基總蛋白，加入4×DTT buffer，變性，10% SDS-PAGE電泳(200 V·h-1)，考馬斯亮藍染色，脫色。

1.2.4 膠內酶解 切下電泳膠上目標條帶，置于EP管中，同時切下空白膠塊作對照；加入200～400 μL 100 mmol·L-1NH4HCO3/30% ACN脫色，清洗至透明，棄上清，凍干；每管加入90 μL 100 mmol·L-1NH4HCO3，10 μL 100 mmol·L-1DTT，56 ℃孵化30 min；棄上清，每管加100 μL 100% ACN，5 min后吸除；每管加入70 μL 100 mmol·L-1NH4HCO3，30 μL 200 mmol·L-1IAA(現配，避光保存)，暗處放置20 min；棄上清，加入100 μL 100% ACN，5 min后吸去，凍干；凍干后加入5 μL 2.5～10 ng·μL-1Trypsin溶液，置于4 ℃ 冰箱30～60 min，使膠塊充分吸脹(棄除剩余液)；再加入20～30 μL 50 mmol·L-1NH4HCO3緩沖液(無Trypsin)，pH 7.8～8.0，37 ℃反應過夜20 h左右；吸出蛋白酶解液，轉移至新EP管中，原管中加入100 μL 60% ACN/0.1% TFA超聲15 min， 吸出溶液并入前次溶液，反復抽提3次，合并，凍干；樣品制備完成。

1.2.5 質譜分析 質譜上機分析由中國農業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所農業(yè)農村部動物遺傳育種與繁殖(家禽)重點實驗室完成。

1.3 試驗數據分析

使用Thermo Proteome Discoverer 軟件進行蛋白質檢索和鑒定，比對紅原雞參考蛋白質組數據庫(Gallusgallus(Red jungle fowl)Reference proteome)；數據差異分析使用SPSS 23.0軟件T檢驗完成；選擇表達差異倍數≥2(上調)或≤0.5(下調)且錯誤發(fā)現率q< 0.05的蛋白為差異表達蛋白；對每個樣品中蛋白相對含量進行聚類分析并進行Z值校正，利用聚類熱圖觀察不同蛋白在不同樣品間比較時的上調、下調情況；針對篩選出來的差異蛋白進行GO注釋、KEGG功能富集分析和互作網絡分析。

2 結 果

2.1 弱精和正常雞只篩選

42周齡開始篩查寧都黃雞公雞的精子質量，包括精子密度、精子活力和精液量，從中篩選出對照組和弱精組個體各4只，T檢驗顯示，弱精組個體的精子密度和精子活力極顯著低于對照組(P<0.01，表1)。

表1 對照組與弱精組精液質量比較

2.2 SDS-PAGE電泳

總蛋白去糖基化后，SDS-PAGE結果顯示，同組內平行樣本間一致性較好，弱精組和對照組間的差異條帶明顯(圖1)。

2.3 弱精組與對照組差異表達精漿蛋白分析

本研究在弱精組與對照組中共發(fā)現584個蛋

M. 蛋白質相對分子質量標準；1. 弱精組混合樣；2～5. 弱精組L1-L4；6～9. 對照組N1-N4；10. 對照組混合樣 M.Protein marker; 1. Mixed samples in asthenospermia group; 2-5. L1-L4 in asthenospermia group; 6-9. N1-N4 in control group; 10. Mixed samples in control group圖1 SDS-PAGE電泳結果(左)和蛋白marker分子量(右)Fig.1 SDS-PAGE result(left) and protein marker molecular mass (right)

白，兩組間差異表達蛋白有78個。差異蛋白聚類分析顯示，蛋白被分為兩個主要的簇(縱向)，每一組中又被分為上調(紅色)和下調(藍色)表達蛋白，樣品聚類分析結果(橫向)與樣品實際組別相符(圖2)。與對照組相比，弱精組中有5個精漿蛋白表達上調，包括KRT9、SEPP2、VTG2、ABHD14B和一個未知蛋白，其余73個蛋白均表達下調，其中，VNN1、PLCZ1、GK和SLC2A3等蛋白表達下調倍數較大(q<0.05)，值得注意的是，HOGA1、PAH和LCAT僅在對照組的全部樣品中檢測到表達，KRT9和SEPP2僅在弱精組全部樣品中檢測到表達(表2)。

2.4 差異蛋白的GO注釋和KEGG富集分析

利用DAVID在線進行弱精組和對照組精漿差異蛋白的基因功能注釋和信號通路富集分析，結果顯示，差異蛋白分子功能涉及蛋白酶活性和蛋白域特異結合；涵蓋的生物學過程包括糖代謝、蛋白質水解和高爾基體建立等；涉及的細胞功能包括細胞器、細胞膜、細胞質和髓鞘等(圖3)。KEGG富集分析發(fā)現，差異蛋白富集于新陳代謝、糖酵解、碳代謝、抗體合成和氨基酸合成等信號通路(圖4)。

2.5 蛋白互作分析

利用SRTING在線軟件分析差異蛋白間的互作情況，將互作程度為高置信度(Score≥0.7)的蛋白列出(圖5)，其功能主要涵蓋了糖代謝、脂代謝、ATP合成和小分子代謝等生物學功能(表2)。

3 討 論

本研究僅在正常組或弱精組中檢測到的蛋白在人或其他動物中均與能量代謝和精子功能有關。相關研究表明，HOGA1參與谷氨酸和天冬氨酸的代謝過程，將4-羥基-2-氧代戊二酸的物質分解為丙酮酸和乙醛酸鹽，其分解產物參與多種能量代謝和新陳代謝，HOGA1突變與原發(fā)性高草酸尿3型(pH3)有高度的相關性[21]。PAH是苯丙氨酸羥化為酪氨酸的限速酶，PAH活性下降或顯著缺乏會導致苯丙氨酸及其旁路代謝產物堆積和酪氨酸的生物合成減少[22]，而酪氨酸磷酸化程度與精子超激活運動有著一定的相關性[23]。PAH基因突變還是引起人先天性、常染色體隱性遺傳的氨基酸代謝病—高苯丙氨酸血癥的主要原因[24]。LCAT是脂蛋白代謝過程中起關鍵作用的一種酶，對維持膽固醇穩(wěn)態(tài)、調節(jié)膽固醇在血液循環(huán)中的轉運及膽固醇在外周組織中的清除有十分重要的作用[25-27]。膜脂質主要由膽固醇、磷脂和糖脂組成，它們分別在精子生成的不同階段發(fā)揮細胞黏附、信號轉導等作用[28]。有研究表明，人精漿中總膽固醇含量與精子的密度、數量、活力以及形態(tài)均呈正相關，包括LCAT在內的多個參與膽固醇代謝和轉運的標志物在所研究的組織標本中均有不同程度的表達，而精漿中膽固醇濃度與血清膽固醇、血脂水平、血清中生殖激素(FSH、LH、睪酮、雌二醇、性激素結合球蛋白、抑制素B)水平均無相關性，表明精漿中的膽固醇可能對精子發(fā)生具有重要作用[29]。KRT9基因屬于細胞骨架中間絲結構蛋白家族，能與均質狀基質共同構成的一種硬蛋白質，保護上皮細胞免受損壞或機械壓力，KRT9致病突變是導致表皮松解性掌跖角化病的主要原因[30]。目前為止，SEPP2基因被發(fā)現僅存在于非哺乳動物基因組內[31]，在雞體內主要負責硒轉運，在雞肝和腎中，該基因的表達隨飼喂硒濃度升高而增加[32-33]。有研究顯示，在不同濃度硒作用下，雞不同腦區(qū)部位中SEPP2的表達呈現不同趨勢。在高硒組，雞脊髓中SEPP2基因與對照組相比，表達呈極顯著增加，而在小腦中表達呈極顯著下降；而在低硒組，脊髓中SEPP2基因表達與對照組相比，表達仍呈顯著的增加，而在小腦中表達與對照組相比，差異不顯著；在雞嗅球中無論是高硒還是低硒組SEPP2基因表達差異均不顯著[34]。相關文獻報道顯示，硒有利于人和動物精子活力的水平提升[35-36]，而本研究中，僅在弱精組公雞中檢測到與硒轉運相關的SEPP2蛋白表達，SEPP2蛋白表達量高低與公雞體內硒含量的高低以及精子活力的關系仍需進一步研究。除此之外，本研究結合差異表達倍數和蛋白互作等信息，篩選出若干與精子獲能和代謝等作用相關，可作為研究弱精癥發(fā)病機理的候選蛋白。其中，VNN1基因編碼泛酰巰基乙胺酶，在其催化作用下生成的半胱胺是防止脂類過氧化的強抗氧化劑[37]，VNN1基因還受到類固醇生長因子SF-1和SOX9調控，有助于調節(jié)睪丸的應激反應以及維持CoA水平[38]。PLCZ1基因是睪丸特異表達基因，它與CAPZA3、IGPB1b和TUBA3b基因具有維持精子頭部形狀的功能[39]。SLC2A3基因編碼葡萄糖轉運蛋白3，負責葡萄糖轉運。研究顯示，熱應激通過激活ERK1/2信號通路增加HSP70表達，進而通過上調SLC2A3和LDHA的表達促進乳酸合成[40]，SLC2A3在人類精子獲能過程中磷酸化水平升高[41]。

圖2 弱精組(L1-L4)和對照組(N1-N4)樣本差異表達蛋白聚類熱圖Fig.2 Results of differentially expressed proteins cluster analysis in asthenospermia (L1-L4) and control (N1-N4) groups

生物學過程：1.糖酵解過程；2.糖異生；3.中間絲形態(tài)；4.細胞骨架形態(tài)；5.甘油醛-3-磷酸生物合成；6.蛋白質水解；7.基于微管進程；8.上皮細胞分化；9.his細胞束浦肯野肌細胞黏附參與細胞通訊；10.高爾基體的建立；11.氧化還原法；12.心室心肌細胞動作電位的調節(jié)。細胞組分：13.胞外外切體；14.細胞外間隙；15.髓鞘；16.胞質溶膠；17.角蛋白絲；18.血液微粒；19.中間絲；20.細胞；21.焦點黏附；22.細胞黏附連接；23.質膜外側；24.細胞外基質。分子功能：25.結構分子活性；26.蛋 白域特異性結合；27.絲氨酸型內肽酶活性；28.β-半乳糖苷酶活性 Biological process: 1.Glycolysis process;2.Gluconeogenesis;3.Intermediate filament morphology;4.Cytoskeleton morphology;5.Glyceraldehyde-3-phosphate biosynthesis;6.Proteolysis;7.Microtubule based process;8.Epithelial cell differentiation;9.His cell bundle Purkinje myocyte adhesion and participation in cell communication; 10.Establishment of Golgi body;11.Redox method;12.Regulation of action potential of ventricular cardiomyocytes. Cell component:13.Extracellular body; 14. Extracellular space;15.Myelin sheath;16.Cytoplasmic sol;17.Keratin filament;18.Blood particles;19.Intermediate filament;20.Cell;21.Focal adhesion;22.Cell adhesion;23.Outer plasma membrane;24.Extracellular matrix. Molecular function: 25.Structural molecular activity;26.Protein domain specific binding;27.Serine endopeptidase activity;28.β-galactose glucosidase activity圖3 GO功能注釋結果Fig.3 Functional annotation result of gene ontology

圖4 KEGG功能富集分析Fig.4 Functional enrichment analysis of KEGG

圖5 差異蛋白互作分析圖Fig.5 Differential protein interaction analysis graph

表2 部分差異表達蛋白結果

本研究所得到的弱精組和對照組差異表達蛋白后續(xù)經過進一步驗證并結合多組學研究，為今后發(fā)現更多與弱精癥發(fā)生相關的未知蛋白或基因提供可能，也為進一步闡明弱精癥的發(fā)病機理提供依據。

4 結 論

在寧都黃雞弱精癥和正常公雞的精漿蛋白中篩選到78個差異表達蛋白，其中，5個蛋白在弱精組中表現為上調，其余均表現為下調。生物信息學分析顯示，差異表達蛋白功能涵蓋糖代謝、脂代謝、ATP合成和小分子代謝等生物學功能。