范婷婷，陳 燕，張路培，徐凌洋，高會(huì)江，李俊雅，高 雪

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京100193)

我國肉牛品種主要為地方黃牛品種。黃牛品種作為我國的特色資源，具有耐粗飼、抗逆性好、肉質(zhì)細(xì)嫩等優(yōu)點(diǎn)，但因其役用的歷史緣故，同時(shí)也存在生長(zhǎng)速度緩慢，體型發(fā)育不佳、胴體產(chǎn)肉少、優(yōu)質(zhì)牛肉切塊率低等缺陷[1]。為了增加產(chǎn)肉量，提高牛肉品質(zhì)，我國引入了大量?jī)?yōu)良的外國肉牛品種，對(duì)本土黃牛品種進(jìn)行雜交改良，培育出了很多優(yōu)秀的肉用專門化品種，例如利用夏洛萊培育了遼育白牛和夏南牛。我國自20世紀(jì)50年代開始引進(jìn)西門塔爾牛，利用西門塔爾牛與本地牛進(jìn)行雜交后選育獲得了生產(chǎn)性能良好的中國西門塔爾牛[2]和蜀宣花牛[3]兩個(gè)乳肉兼用新品種，而且兩個(gè)培育的新品種在我國的適應(yīng)性較好。西門塔爾牛的雜交后代占我國肉牛飼養(yǎng)產(chǎn)業(yè)的80%以上，是我國肉牛生產(chǎn)及改良所用的主導(dǎo)品種。雜種優(yōu)勢(shì)利用成為了提高地方黃牛生產(chǎn)性能的重要途徑之一。雜種優(yōu)勢(shì)利用的一般方法是在雜交試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行不同親本種群之間的雜交，然后對(duì)雜種后代進(jìn)行評(píng)比鑒定，最終篩選出最佳的雜交組合進(jìn)而應(yīng)用于生產(chǎn)。這個(gè)過程不僅耗費(fèi)大量的人力、物力和時(shí)間[4]，而且畜禽的種群又很多，不可能全部?jī)蓛蛇M(jìn)行雜交試驗(yàn)，同時(shí)大量的雜交試驗(yàn)也帶來了育種結(jié)果的不確定性。因此，在雜交試驗(yàn)之前對(duì)親本組合潛在的雜種優(yōu)勢(shì)進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)，對(duì)最終獲得符合生產(chǎn)目標(biāo)的雜交種，加快育種進(jìn)程，提高育種效率具有重要的意義。

隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的發(fā)展，使利用分子水平的遺傳標(biāo)記預(yù)測(cè)畜禽雜種優(yōu)勢(shì)和估計(jì)畜禽基因組雜種優(yōu)勢(shì)及其組成成分[5-7]成為了可能[8]。目前應(yīng)用最廣泛的是通過微衛(wèi)星標(biāo)記預(yù)測(cè)雜種優(yōu)勢(shì)，但是其研究結(jié)果卻有很大的不一致性[9-11]。而SNP標(biāo)記以其存在的優(yōu)勢(shì)開始被研究者發(fā)現(xiàn)，并發(fā)掘其在雜種優(yōu)勢(shì)預(yù)測(cè)中的潛在價(jià)值。Amuzu-Aweh 等[12]利用全基因組SNPs研究白來航雞純系品種的雜交數(shù)據(jù)，對(duì)雜種優(yōu)勢(shì)進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)雜種優(yōu)勢(shì)與親本品系之間等位基因頻率之差的平方(SDAF)成正比，預(yù)測(cè)的雜種優(yōu)勢(shì)準(zhǔn)確率達(dá)到了50%。徐忠等[13]利用全基因組與性狀相關(guān)的SNPs分子標(biāo)記估算不同群體間的遺傳距離，對(duì)金華豬不同雜交模式下的雜種優(yōu)勢(shì)進(jìn)行預(yù)測(cè)，篩選不同雜交模式下較優(yōu)的雜交組合。雖然SNP標(biāo)記得到了廣泛的應(yīng)用，但是關(guān)于SNP標(biāo)記在牛雜種優(yōu)勢(shì)預(yù)測(cè)上的研究報(bào)道并不多。

本研究以西門塔爾牛及地方黃牛作為親本構(gòu)建雜交群體，并利用770K高密度芯片進(jìn)行基因分型，分別用全基因組和與性狀相關(guān)的SNPs數(shù)據(jù)估算親本間的遺傳距離，預(yù)測(cè)親本各雜交組合生長(zhǎng)發(fā)育及胴體性狀的雜種優(yōu)勢(shì)， 以篩選出較優(yōu)的雜交組合，為地方黃牛的雜交改良提供一定的理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

自內(nèi)蒙古錫林郭勒盟烏拉蓋管理區(qū)牧場(chǎng)收集1 222頭 西門塔爾牛(Chinese Simmental beef cattle，CSC)群體的數(shù)據(jù)，此西門塔爾牛群體是將國外引進(jìn)西門塔爾牛與本地北方黃牛進(jìn)行雜交后選育獲得的，經(jīng)過十幾年的選種選育已經(jīng)逐漸偏向肉用。8個(gè)地方黃牛品種共190頭，采集血樣，提取基因組DNA，獲得基因型數(shù)據(jù)。地方黃牛品種的具體信息見表1。其中蒙古牛、西藏牛和柴達(dá)木牛為北方黃牛品種，其余地方黃牛為南方黃牛品種。選擇的目標(biāo)性狀為生長(zhǎng)發(fā)育、胴體和肉質(zhì)性狀，包括初生重(birth weight，BW)、胴體重(carcass weight，CW)、周歲重(yearling weight，YW)和大理石花紋評(píng)分(marbling score，MS)性狀。

表1 地方黃牛各品種信息

1.2 血液樣本基因分型和質(zhì)量控制

使用llumina BovineHD(770K)芯片對(duì)1 222頭西門塔爾牛群體和190頭地方黃牛個(gè)體進(jìn)行基因分型，在分析之前，利用PLINK v1.90軟件[14]對(duì)基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，剔除不合格的個(gè)體和SNPs，質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)：1)SNPs檢出率>95%；2)SNP的最小等位基因頻率>1%；3)哈代-溫伯格平衡檢驗(yàn)(P>10-6)；4)個(gè)體SNP缺失率<0.1；5)SNP位于常染色體。質(zhì)控后，地方黃牛190個(gè)個(gè)體和622 162個(gè)SNPs用于分析，西門塔爾牛1 217個(gè)個(gè)體和675 029個(gè) SNPs用于分析。接著利用BEAGLE v3.3.2軟件對(duì)缺失位點(diǎn)的基因型進(jìn)行填充。

1.3 性狀相關(guān)SNP位點(diǎn)篩選

將牛QTL數(shù)據(jù)庫(https://www.animalgenome.org/cgi-bin/QTLdb/BT/index)中關(guān)于生長(zhǎng)、胴體和肉質(zhì)性狀的QTLs篩選出來。通過Perl軟件將目的性狀QTL與牛參考基因組進(jìn)行比對(duì)，分別獲得包含基因的性狀QTL，從而篩選出與胴體和肉質(zhì)、生長(zhǎng)性狀相關(guān)的QTL集合。然后通過R軟件將檢測(cè)到的SNPs位點(diǎn)映射到這些包含基因的性狀QTL中，以找到落入QTL覆蓋區(qū)間內(nèi)的標(biāo)記SNPs。

1.4 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

為避免互相連鎖的SNPs對(duì)群體結(jié)構(gòu)分析的影響，選取經(jīng)PLINK修剪后相互之間連鎖不平衡系數(shù) (r2)小于0.2的全基因組SNPs及與性狀相關(guān)的SNP進(jìn)行主成分分析(principal component analysis，PCA)(參數(shù)：indep-pairwise 50 5 0.2)，分析雜交組合兩個(gè)群體之間的遺傳背景聯(lián)系。通過PLINK軟件 (參數(shù)：--pca) 進(jìn)行主成分分析，輸出結(jié)果用R軟件畫圖展現(xiàn)。

1.5 群體間遺傳距離

2 結(jié) 果

2.1 性狀相關(guān)的SNP位點(diǎn)分析

通過將西門塔爾牛和地方黃牛的SNPs位點(diǎn)與牛QTL數(shù)據(jù)庫中關(guān)于生長(zhǎng)、胴體和肉質(zhì)性狀的QTL進(jìn)行映射，找到與牛大理石花紋評(píng)分、胴體重、初生重和周歲重性狀潛在相關(guān)聯(lián)的SNPs。西門塔爾牛和地方黃牛與性狀相關(guān)的SNP數(shù)見表2。

表2 與性狀相關(guān)的SNP數(shù)

2.2 群體的主成分分析

通過全基因組SNPs和與性狀相關(guān)的SNPs標(biāo)記對(duì)西門塔爾牛和地方黃牛品種的9個(gè)雜交組合進(jìn)行主成分分析，結(jié)果如圖1、圖2所示。從全基因組SNP主成分分析的結(jié)果(圖1)可以看出，PC1能夠解釋57.43%的遺傳變異，PC2能夠解釋20.86%的遺傳變異。結(jié)合PC1和PC2，發(fā)現(xiàn)西門塔爾牛群體聚集在一起，南方地方黃牛品種聚集在一起，北方地方黃牛品種聚集在一起。根據(jù)PC1可以明顯的將南方黃牛品種(南丹牛、文山牛、涼山牛、平武牛、昭通牛)從所有群體中分開，而涼山牛、平武牛、昭通牛相對(duì)聚集在一起，分化程度較低，親緣關(guān)系相較于南丹牛和文山牛要近；西門塔爾牛群體與北方黃牛品種(蒙古牛、西藏牛、柴達(dá)木牛)相距比較近，表明西門塔爾牛與北方黃牛的親緣關(guān)系相對(duì)于南方黃牛較近，遺傳背景差異較小。從與性狀相關(guān)SNPs主成分分析的結(jié)果(圖2)可以看出，其結(jié)果與用全基因SNPs進(jìn)行主成分分析的結(jié)果大致相同。

圖1 根據(jù)全基因組SNPs對(duì)西門塔爾牛和地方黃牛群體進(jìn)行主成分分析Fig.1 Principal component analysis of Chinese Simmental beef cattle and Chinese local cattle populations based on genome-wide SNPs

2.3 各雜交組合間遺傳距離比較

由全基因組SNPs及與4個(gè)性狀具有潛在關(guān)聯(lián)的SNPs計(jì)算的親本間的遺傳距離見表3、圖3，結(jié)果顯示，在全基因組水平上，9個(gè)親本間的遺傳距離范圍為0.306 6～0.323 7，對(duì)于初生重性狀，9個(gè)親本間的遺傳距離變幅為0.301 4～0.323 0，在胴體重性狀上，9個(gè) 親本間的遺傳距離變幅為0.297 4～0.316 2，對(duì)于大理石花紋評(píng)分性狀，9個(gè)親本間的遺傳距離變幅為0.297 2～0.312 5，在周歲重性狀上，9個(gè)親本間的遺傳距離變幅為0.305 3～0.322 5。在各性狀中，遺傳距離最大的親本組合都是CSC與NDC。除了大理石花紋評(píng)分性狀是CSC與ZTC之間的遺傳距離最小，其余性狀遺傳距離最小的親本組合都是CSC與PWC。因此，從總體水平來看，在各性狀上西門塔爾牛與南丹牛雜交獲得的雜種優(yōu)勢(shì)可能最大。以上結(jié)果與PCA分析的結(jié)果相似性很高。

西門塔爾牛與不同地域地方黃牛的之間的遺傳距離見圖4、圖5。西門塔爾牛與北方黃牛組成的雜交組合中(圖4)，在初生重和胴體重性狀上，遺傳距離排序?yàn)镃SC×CDM > CSC×MGC > CSC×XZC；在大理石花紋評(píng)分性狀上，遺傳距離排序?yàn)镃SC×MGC > CSC×CDM > CSC×XZC；在周歲重性狀上，遺傳距離排序?yàn)镃SC×CDM > CSC×XZC > CSC×MGC。西門塔爾牛與南方黃牛組成的雜交組合中(圖5)，在初生重、胴體重上，遺傳距離排序?yàn)镃SC× NDC > CSC× WSC > CSC× LSC > CSC×ZTC> CSC×PWC；在大理石花紋評(píng)分性狀上，遺傳距離排序?yàn)镃SC×NDC > CSC×WSC > CSC×PWC > CSC×LSC > CSC×ZTC；在周歲重性狀上，遺傳距離排序?yàn)镃SC×NDC > CSC×WSC > CSC×ZTC > CSC×LSC > CSC×PWC。

a.初生重的PCA；b.胴體重的PCA；c.大理石花紋評(píng)分的PCA；d.周歲重的PCA a. PCA of birth weight; b. PCA of carcass weight; c. PCA of marbling score; d. PCA of yearling weight圖2 根據(jù)與性狀相關(guān)的SNPs對(duì)西門塔爾牛和地方黃牛群體進(jìn)行主成分分析Fig.2 Principal component analysis of Chinese Simmental beef cattle and Chinese local cattle populations based on trait-specific SNPs

表3 9個(gè)親本間SNPs估算的遺傳距離

圖3 8個(gè)雜交組合間的遺傳距離Fig.3 Genetic distance among 8 hybrid combinations

圖4 西門塔爾牛與北方黃牛之間的遺傳距離Fig.4 Genetic distance between Chinese Simmental beef cattle and Northern breeds of Chinese local cattle

圖5 西門塔爾牛與南方黃牛之間的遺傳距離Fig.5 Genetic distance between Chinese Simmental beef cattle and Southern breeds of Chinese local cattle

3 討 論

3.1 分子標(biāo)記多態(tài)性及群體結(jié)構(gòu)分析

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，SNP標(biāo)記作為新一代的分子標(biāo)記類型，具有密度高、分布范圍廣、分型簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，在分子遺傳研究中逐漸興起[15]。尤其是快速、高通量的SNP分型技術(shù)即SNP芯片的問世，讓SNP標(biāo)記在雜種畜禽的遺傳多樣性分析[16-17]和關(guān)聯(lián)分析[18-20]等研究中得到廣泛應(yīng)用。本研究采用牛770K SNP芯片對(duì)兩個(gè)親本群體進(jìn)行全基因組基因型分型，篩選后得到地方黃牛622 162個(gè)有效多態(tài)性SNPs位點(diǎn)，西門塔爾牛675 029個(gè)有效多態(tài)性SNPs位點(diǎn)，可見SNP標(biāo)記多態(tài)性的豐富性和SNP芯片檢測(cè)方法的高通量特性。

群體結(jié)構(gòu)分析主要是研究遺傳變異導(dǎo)致各群體產(chǎn)生分化的一種動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，能夠根據(jù)不同品種的分化走向確定品種所屬類型。從PCA分析結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)親本群體中，西門塔爾牛、北方黃牛和南方黃牛基本能保持地域特異性，3個(gè)不同地域的牛品種獨(dú)立形成聚類。西門塔爾牛與北方黃牛品種在PCA圖上的距離相對(duì)于南方黃牛品種較近，這與李榮嶺等[21]采用Nei′s遺傳距離(DA)進(jìn)行NJ聚類分析中，外來品種西門塔爾牛與北方黃牛聚為一類結(jié)果相似，說明西門塔爾牛與北方黃牛親緣關(guān)系相對(duì)較近，遺傳背景差異較小。本研究所用的西門塔爾牛為引進(jìn)的西門塔爾牛與北方黃牛進(jìn)行雜交培育而成的，所以與北方黃牛品種的親緣關(guān)系近。西門塔爾牛與北方黃牛品種雜交產(chǎn)生的雜種優(yōu)勢(shì)不如與南方黃牛品種雜交形成的雜種優(yōu)勢(shì)大。西門塔爾牛與南丹牛遺傳關(guān)系最遠(yuǎn)，在所有雜交組合中，CSC與NDC雜交可能會(huì)產(chǎn)生最大的雜種優(yōu)勢(shì)。

3.2 雜種優(yōu)勢(shì)預(yù)測(cè)分析

在基因序列水平或基因頻率水平上計(jì)算的不同個(gè)體、種群或物種之間的遺傳差異的任何數(shù)值度量，皆可定義為遺傳距離[22]。狀態(tài)一致(IBS)是指兩個(gè)或兩個(gè)以上個(gè)體的DNA片段具有相同的核苷酸序列。因此親本之間的IBS距離應(yīng)該與后代雜種優(yōu)勢(shì)呈負(fù)相關(guān)。數(shù)量遺傳學(xué)理論認(rèn)為，雜種優(yōu)勢(shì)與遺傳距離之間具有一定的線性關(guān)系。通常認(rèn)為，親本間遺傳距離越遠(yuǎn)、品系純度越高，后代表現(xiàn)出來的雜種優(yōu)勢(shì)就會(huì)越明顯[23]。吳常信[24]指出，用DNA多態(tài)性測(cè)定品種或品系間的差異，并據(jù)此作出遺傳距離要比根據(jù)其它材料穩(wěn)定，因此用來預(yù)測(cè)雜種優(yōu)勢(shì)也更為準(zhǔn)確。曹陽等[25]利用微衛(wèi)星標(biāo)記分析了4個(gè)引進(jìn)肉牛品種與西門塔爾雜交牛之間的遺傳距離，并預(yù)測(cè)雜種優(yōu)勢(shì)，發(fā)現(xiàn)西雜牛與4個(gè)引進(jìn)肉牛品種之間的遺傳距離為：德國黃牛(1.259 8)、利木贊牛(1.054 6)、紅安格斯牛(0.886 7)、夏洛萊牛(0.599 7)。進(jìn)而推測(cè)西雜牛與其他品種牛之間的雜種優(yōu)勢(shì)依次為德國黃牛>利木贊牛>紅安格斯牛>夏洛萊牛。在其他畜禽，如豬[13,26-27]、鴨[28]、雞[29]、羊[30-31]等同樣依據(jù)遺傳距離得到了評(píng)估雜交組合雜種優(yōu)勢(shì)優(yōu)劣的結(jié)果。本研究分別用全基因組SNPs標(biāo)記及與性狀相關(guān)的SNPs標(biāo)記來構(gòu)建狀態(tài)同源矩陣，計(jì)算各雜交組合親本間的遺傳距離，預(yù)測(cè)不同雜交組合在生長(zhǎng)、胴體和肉質(zhì)性狀上的雜種優(yōu)勢(shì)。在全基因組水平推測(cè)雜種優(yōu)勢(shì)較優(yōu)的組合可能是CSC與NDC。雖然與性狀相關(guān)的SNPs標(biāo)記估算的遺傳距離普遍低于全基因組SNPs標(biāo)記估算的遺傳距離，但是在各性狀水平雜種優(yōu)勢(shì)較優(yōu)的可能的組合依然是CSC與NDC。與性狀相關(guān)的分子標(biāo)記雖然減少了計(jì)算中使用標(biāo)記的數(shù)量，但是預(yù)測(cè)的最優(yōu)雜交組合和全基因組SNP標(biāo)記預(yù)測(cè)結(jié)果相同，說明使用與性狀相關(guān)的分子標(biāo)記提高了估計(jì)的準(zhǔn)確性[26]。雜種優(yōu)勢(shì)預(yù)測(cè)可以從不同雜交組合中篩選出最優(yōu)方案，大大減少了候選的雜交試驗(yàn)，但是此預(yù)測(cè)方法的可靠性仍然需要進(jìn)行雜交試驗(yàn)驗(yàn)證?？傊? 這一結(jié)果可為地方黃牛雜交改良研究提供一定的理論參考依據(jù)。

4 結(jié) 論

本研究利用覆蓋全基因組和與性狀相關(guān)的SNPs標(biāo)記估算西門塔爾牛和地方黃牛兩個(gè)親本群體之間的遺傳距離進(jìn)而進(jìn)行雜種優(yōu)勢(shì)預(yù)測(cè)，推測(cè)西門塔爾牛與南丹?？赡転樽罴训碾s交組合。在與北方黃牛的雜種優(yōu)勢(shì)預(yù)測(cè)中，在初生重、周歲重和胴體重性狀上，推測(cè)西門塔爾牛與柴達(dá)木?？赡転樽罴训碾s交組合；在大理石花紋評(píng)分性狀上，推測(cè)西門塔爾牛與蒙古?？赡転樽罴训碾s交組合。在與南方黃牛的雜種優(yōu)勢(shì)預(yù)測(cè)中，推測(cè)在各個(gè)性狀中西門塔爾牛與南丹?？赡転樽罴训碾s交組合。