吉 琳，楊秋月，方斐旻，竇 虹，郁建鋒，徐 璐，顧志良

(常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院,蘇州 215500)

載脂蛋白B(apolipoprotein B，Apob)是血漿中低密度脂蛋白(low density lipoproteins，LDL)和極低密度脂蛋白(very low density lipoprotein，VLDL)的主要蛋白質(zhì)成分[1]。哺乳動(dòng)物的Apob主要由肝和小腸合成，在脂類代謝、膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)[2]、吸收代謝等過程中發(fā)揮重要作用。Apob異常與冠心病[3]、糖尿病[4]、脂肪肝[5]、代謝綜合癥[6-8]等疾病的發(fā)生相關(guān)性較高，同時(shí)也是評(píng)估動(dòng)脈粥樣硬化風(fēng)險(xiǎn)的重要指標(biāo)之一[9-10]。另外，近年來在家禽上的研究表明，Apob基因不僅在家禽能量代謝[11]、生長(zhǎng)繁殖[12]、脂質(zhì)代謝[13-14]等生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用，而且可作為家禽選育的分子遺傳標(biāo)記。

CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)技術(shù)作為第三代基因編輯工具，相較于鋅指核酸酶技術(shù)(zinc-finger nucleases，ZFNs)[15]和類轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)因子技術(shù)(transcription activator-like effector nucleases，TALENs)[16]，具有短時(shí)高效、價(jià)格實(shí)惠、靶向特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。并且可同時(shí)靶向多個(gè)基因，因而在大量研究中被廣泛應(yīng)用。自CRISPR系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)以來，科學(xué)家不斷探索將其從細(xì)胞分裂與增殖的基本生物學(xué)研究應(yīng)用到癌癥[17-19]、精神病[20]和糖尿病[21-22]等疾病的研究，為疾病的治療提供了新思路和新方向。Schmitt等[23]運(yùn)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在Vemurafenib敏感的細(xì)胞中敲除NES(Nestin)證明，Nestin與黑色素瘤細(xì)胞獲得性Vemurafenib耐藥有關(guān)。Gao等[24]通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除突變Tmc1基因，保留正常Tmc1基因，成功修復(fù)了小鼠模型的顯性突變并緩解了聽力喪失。隨著更多Cas系統(tǒng)的開發(fā)，該系統(tǒng)在各種遺傳性神經(jīng)疾病[25]的治療中也存在巨大的潛力。在植物研究領(lǐng)域，編碼CRISPR/Cas系統(tǒng)的載體以往主要是通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化或基因槍轟擊的方法導(dǎo)入植物細(xì)胞，應(yīng)用于作物改良。近期，Lin等[26]構(gòu)建了適用于植物的引導(dǎo)編輯器(plant prime editor, PPE)系統(tǒng)，并在重要作物中完成了引導(dǎo)編輯。另有研究表明，直接使用CRISPR/Cas核糖核蛋白[27-28]能更有效地導(dǎo)入植物細(xì)胞，介導(dǎo)植物基因組編輯。目前，CRISPR技術(shù)比以往任何技術(shù)都更加易用，并且在生物學(xué)、農(nóng)業(yè)、微生物等研究領(lǐng)域都顯示出了強(qiáng)大的優(yōu)勢(shì)與應(yīng)用價(jià)值。隨著CRISPR技術(shù)研究的不斷深入和技術(shù)的不斷改進(jìn)，其應(yīng)用會(huì)越來越廣泛。

隨著居民收入水平的不斷提高，家禽養(yǎng)殖效益向好，我國(guó)家禽飼養(yǎng)規(guī)模持續(xù)擴(kuò)大。據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2019年全國(guó)家禽出欄146.41億只，較上年增長(zhǎng)11.9%。禽肉已成為世界上第二大消費(fèi)肉類，由于禽肉價(jià)格低于其他肉類，禽肉消費(fèi)快速增長(zhǎng)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2019年，我國(guó)禽肉產(chǎn)量2 239萬噸，較2018年增長(zhǎng)5.8%。未來隨著居民肉品消費(fèi)結(jié)構(gòu)升級(jí)，禽肉消費(fèi)量還將進(jìn)一步增加。禽肉消費(fèi)中雞肉消費(fèi)量占比最大，約為50%。但雞體內(nèi)過度的脂質(zhì)沉積，不僅削減了雞肉的品質(zhì)和收益[29]，而且對(duì)雞的生長(zhǎng)和繁殖性能[30]也有一定影響。因此，本試驗(yàn)圍繞雞的脂代謝相關(guān)基因——Apob展開，旨在探明其在雞肝脂代謝中的作用，從分子層面為解決家禽的脂質(zhì)沉積問題提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

采集9只4周齡黃羽肉雞的心、腦、肝、脾、肺、腎、脂肪、腺胃、腿肌、胸肌、肌胃和小腸等12個(gè)組織，液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱備用。

大腸桿菌 (Escherichiacoli) DH5α、雞胚胎成纖維細(xì)胞系(douglas foster-1，DF-1)、pMD-19T Vector、pX330/Cas9質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室購(gòu)買并保存；引物由蘇州泓訊生物科技有限公司合成；限制性內(nèi)切酶BbsI、T7核酸內(nèi)切酶I (T7 endonuclease I，T7EI)均購(gòu)于New England Biolabs公司；轉(zhuǎn)染試劑X-tremeGENE-9購(gòu)于Roche公司；100×雙抗(青霉素和鏈霉素均為10 000 U·mL-1)、胎牛血清 (fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基均購(gòu)于賽默飛世爾科技公司。

1.2 試驗(yàn)儀器

冷凍離心機(jī)5804R(Eppendorf)，PowerPacTMBasic電泳儀(Bio-Rad)，7500 Real time PCR儀(ABI)，制冰機(jī)SIM-F140AY6(SANYO)，CO2培養(yǎng)箱(Thermo)，超低溫冰箱(Thermo)，Biospectrum 410凝膠成像系統(tǒng)(UVP)，超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)，全溫?fù)u瓶柜 HYG-A(太倉博萊特)，立式壓力蒸汽滅菌鍋LDZX-75KBS(上海申安醫(yī)療器械廠)，電熱恒溫水浴鍋DK-8AX(上海一恒科技)，電子天平(上海梅特勒-托利多儀器)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 雞Apob蛋白理化性質(zhì)分析 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中雞Apob蛋白氨基酸序列，利用ExPASy數(shù)據(jù)庫分析該蛋白質(zhì)理化性質(zhì),接著通過Pfam數(shù)據(jù)庫進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)域分析。

1.3.2 雞各組織中Apob基因mRNA表達(dá)情況分析 采用Trizol法[31]提取各組織總RNA，使用Prime ScriptTMRT Reagent Kit將其反轉(zhuǎn)錄得到cDNA后，按SYBRRPremix Ex TaqTM說明書進(jìn)行RT-qPCR。結(jié)果使用2-ΔCt值分析，采用GraphPad Prism軟件進(jìn)行作圖。

1.3.3 雞Apob基因敲除載體的構(gòu)建 本試驗(yàn)在蛋白N端結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)的外顯子上選取3個(gè)待敲除位點(diǎn)，設(shè)計(jì)合成3對(duì)sgRNA(表1)。將合成的寡核苷酸鏈(oligonucleotides，oligos)退火形成雙鏈。反應(yīng)體系：TE Buffer 8 μL，正、反義鏈各1 μL。退火程序：沸水處理5 min后，自然冷卻至室溫。使用T4 DNA連接酶將雙鏈DNA與線性載體pX330/Cas9于16 ℃連接過夜，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含50 μg·mL-1氨芐青霉素(ampicillin，Amp)的LB平板。培養(yǎng)12 h后挑取單菌落接種于含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，菌液PCR鑒定后提取陽性菌質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序成功的陽性菌擴(kuò)大培養(yǎng)后，使用無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒提取質(zhì)粒。

表1 sgRNA序列

1.3.4 DF-1細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 DF-1細(xì)胞在含1% FBS和1% 100×鏈霉素-青霉素的DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。細(xì)胞匯合度達(dá)90%左右時(shí)，用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)洗滌后，加入0.25% Tyrpsin-EDTA消化。細(xì)胞脫落后加入不含抗生素的新鮮培養(yǎng)基，將細(xì)胞吹散后計(jì)數(shù)，以3×105個(gè)·孔-1的濃度鋪于24孔板。當(dāng)細(xì)胞匯合度約為70%～90%時(shí)，使用脂質(zhì)體X-tremeGENE 9 DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染。以未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為空白對(duì)照。將1 μg質(zhì)粒按X-tremeGENE 9 DNA(V)∶質(zhì)粒(μg)= 3∶1的比例，轉(zhuǎn)染至DF1細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后使用3 μg·mL-1嘌呤霉素(puromycin，puro)篩選2～3 d至對(duì)照組細(xì)胞全部死亡。去除培養(yǎng)基中puro，對(duì)陽性細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)并提取基因組DNA。

1.3.5 T7EI酶切檢測(cè) 以酚氯仿法[32]抽提細(xì)胞基因組DNA。利用T7EI酶可識(shí)別并切割錯(cuò)配雙鏈DNA的特點(diǎn)，驗(yàn)證靶位點(diǎn)敲除活性。根據(jù)靶位點(diǎn)上、下游序列分別設(shè)計(jì)3對(duì)PCR引物(表2)，以基因組DNA為模板擴(kuò)增靶位點(diǎn)上、下游序列。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s， 72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。將擴(kuò)增的目的片段退火后，加入T7EI酶進(jìn)行酶切。反應(yīng)體系：PCR退火產(chǎn)物5 μL，NE buffer 1.1 μL，T7EI酶0.5 μL，ddH2O補(bǔ)足體系至11 μL。37 ℃酶切30 min后通過2.1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切結(jié)果。

表2 靶位點(diǎn)的PCR引物序列

1.3.6 TA克隆測(cè)序 將擴(kuò)增的目的片段純化回收后，與pMD-19T載體于16 ℃連接過夜；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞DH5α，涂布于含50 μg·mL-1Amp的LB平板培養(yǎng)12 h后，取20管菌液進(jìn)行測(cè)序。并計(jì)算靶位點(diǎn)實(shí)際敲除效率。計(jì)算公式：敲除效率=發(fā)生突變序列的菌液數(shù)/測(cè)序菌液總數(shù)×100%。

1.3.7 熒光定量PCR檢測(cè) 分別提取對(duì)照組和試驗(yàn)組細(xì)胞RNA，通過RT-qPCR檢測(cè)Apob基因敲除后其表達(dá)量變化情況。RT-qPCR方法同“1.3.2”。采用公式2-ΔΔCt值分析計(jì)算，使用GraphPad Prism軟件進(jìn)行作圖。并用非配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié) 果

2.1 雞Apob蛋白理化性質(zhì)分析

Pfam數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果表明，雞Apob有4個(gè)關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，2個(gè)未知功能結(jié)構(gòu)域以及位于C端和N端的結(jié)構(gòu)域。ExPASy數(shù)據(jù)庫顯示，雞Apob分子式為 C23449H37206N6214O7051S136，相對(duì)分子質(zhì)量為523.356 ku，理論pI為8.44。蛋白由4 631個(gè)氨基酸組成，其中，亮氨酸含量最多，為10.6%，絲氨酸含量次之，為8.6%，半胱氨酸與色氨酸含量最少，均為0.6%。帶負(fù)電荷的殘基總數(shù)為533，帶正電荷的殘基總數(shù)為554。根據(jù)計(jì)算結(jié)果，Apob不穩(wěn)定性系數(shù)為37.61，歸類為穩(wěn)定蛋白。其脂肪系數(shù)為90.07，平均親水性為-0.300。

以Hphob./Kyte & Doolittle為刻度，利用ProtScale分析蛋白親水性和疏水性(圖1)，該蛋白質(zhì)第10位氨基酸得分最高，為3.289，表明該位點(diǎn)疏水性較強(qiáng)；第285和286位氨基酸得分最低，為-3.122， 表明該位點(diǎn)親水性較強(qiáng)。

2.2 雞Apob基因mRNA組織表達(dá)分析

選取9只4周齡雞為試驗(yàn)材料，取其心、腦、肝、脾、肺、腎、脂肪、腺胃、腿肌、胸肌、肌胃和小腸組織。提取總RNA逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以其為模板進(jìn)行3次 平行RT-qPCR檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果表明，Apob基因主要在雞的肝、腎和小腸組織中表達(dá)(圖2)。

2.3 雞Apob基因Cas9/gRNA敲除載體構(gòu)建

合成的oligos退火后，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。泳道2、4、6退火產(chǎn)物與單鏈引物條帶相比差異明顯(圖3)，表明雙鏈DNA形成，退火成功。將雙鏈DNA與線性載體pX330/Cas9連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞DH5a進(jìn)行涂板。次日在含50 μg·mL-1Amp平板上，挑取4個(gè)單克隆菌落接種于含50 μg·mL-1Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃震蕩培養(yǎng)。泳道2、3、4、5、6試驗(yàn)組的菌液PCR在100 bp左右有較明顯條帶(圖4)，與預(yù)測(cè)位置一致。質(zhì)粒測(cè)序比對(duì)結(jié)果表明，基因敲除載體構(gòu)建成功。

圖1 雞Apob蛋白親水性和疏水性分析Fig.1 Hydrophilic and hydrophobic analysis of chicken Apob protein

圖2 Apob基因在雞各組織中相對(duì)表達(dá)量Fig.2 Relative expression of Apob gene in chicken tissues

M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1、3、5. sgRNA6～8上游引物； 2、4、6. sgRNA6～8雙鏈產(chǎn)物 M.DL2000 DNA marker； 1,3,5. sgRNA6-8 forward primers； 2，4，6. sgRNA6-8 double strand products圖3 退火產(chǎn)物驗(yàn)證Fig.3 Verification of annealed products

M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1.對(duì)照組; 2～6. sgRNA6～8陽性克隆 M.DL2000 DNA marker; 1.Control; 2-6. Positive clones of sgRNA6-8圖4 PCR 驗(yàn)證陽性克隆Fig.4 PCR confirmed positive clones

2.4 Cas9/gRNA敲除載體活性驗(yàn)證

將Cas9/gRNA質(zhì)粒通過X-tremeGENE 9 DNA轉(zhuǎn)染至DF-1，48 h后使用puro篩選陽性細(xì)胞，提取基因組。以基因組DNA為模板擴(kuò)增靶位點(diǎn)6附近500 bp序列、靶位點(diǎn)7附近600 bp序列,靶位點(diǎn)8附近800 bp序列(圖5)，PCR結(jié)果顯示，擴(kuò)增的目的條帶與預(yù)測(cè)大小一致。接著利用T7EI酶切法驗(yàn)證Cas9/gRNA的切割活性。在泳道2、4、6試驗(yàn)組中均檢測(cè)到切割片段(圖6)，而在對(duì)照組則無切割條帶。說明sgRNA6、sgRNA7、sgRNA8均具有切割活性。

2.5 TA克隆分析敲除效率

將2.4中擴(kuò)增的目的片段回收后連至pMD-19T載體，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5a后涂布于Amp抗性的平板上，培養(yǎng)12 h后挑取20個(gè)單克隆菌落進(jìn)行測(cè)序。其中，Cas9/gRNA6測(cè)序的20管菌液中有6管發(fā)生了突變，突變率為33.3%。Cas9/gRNA7測(cè)序的20管菌液中有13管發(fā)生了突變，突變率為65%。Cas9/gRNA8測(cè)序的20管菌液中有16管發(fā)生了突變，突變率為80%。其中，突變類型以堿基缺失為主，并且靶位點(diǎn)上、下游的雙鏈均發(fā)生斷裂(圖7)。上述結(jié)果表明，Cas9/gRNA6、Cas9/gRNA7、Cas9/gRNA8均具有靶向切割活性，且Cas9/gRNA8靶向切割活性最強(qiáng)。

M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1、3、5.對(duì)照組；2、4、6. sgRNA6～8 PCR產(chǎn)物 M.DL2000 DNA marker; 1,3,5.Control; 2,4,6.sgRNA6-8 products of PCR圖5 PCR 擴(kuò)增sgRNA靶位點(diǎn)上、下游序列Fig.5 PCR amplified the upstream and downstream sequences of sgRNA targets

M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1、3、5.對(duì)照組; 2、4、6. sgRNA6～8酶切產(chǎn)物 M.DL2000 DNA marker; 1, 3, 5. Control; 2, 4, 6. sgRNA6-8 enzyme-digested products圖6 T7EI酶切驗(yàn)證結(jié)果Fig.6 The result of T7EI enzyme digestion

2.6 Apob基因敲除后其mRNA表達(dá)水平變化分析

提取對(duì)照組和敲除組亞克隆細(xì)胞RNA，反轉(zhuǎn)錄后利用RT-qPCR檢測(cè)Apob基因mRNA的表達(dá)水平。進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，數(shù)據(jù)采用非配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示(圖8)，轉(zhuǎn)染Cas9/gRNA7的細(xì)胞中Apob基因mRNA表達(dá)水平約下調(diào)99.96%(P<0.01)；轉(zhuǎn)染Cas9/gRNA6的細(xì)胞中Apob基因mRNA的表達(dá)水平約下調(diào)85%(P<0.01)；轉(zhuǎn)染Cas9/gRNA8的細(xì)胞中Apob基因mRNA表達(dá)水平約下調(diào)47%(P<0.05)。表明成功敲除了DF-1細(xì)胞中Apob基因，并篩選到基因缺陷的亞克隆細(xì)胞。

(轉(zhuǎn)下頁 Carried forward)

圖7 TA克隆測(cè)序檢測(cè)靶位點(diǎn)突變結(jié)果Fig.7 Detection of target site mutation results by TA clone sequencing

****. P<0.01；**. P<0.05圖8 敲除Apob基因的DF-1中Apob mRNA的表達(dá)情況Fig.8 Expression of Apob in DF-1 after gene knockout

3 討 論

載脂蛋白家族通過與脂類和膽固醇的結(jié)合穩(wěn)定脂蛋白結(jié)構(gòu)，在血漿與組織之間轉(zhuǎn)運(yùn)脂質(zhì)。隨著研究的不斷深入，載脂蛋白在脂蛋白代謝過程中的功能也陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，其不僅調(diào)節(jié)脂蛋白代謝關(guān)鍵酶活性，而且還參與脂蛋白受體的識(shí)別[33]。其中，Apob在載脂蛋白家族中分子量最大，疏水性也最強(qiáng)，主要參與LDL和VLDL的生成，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)內(nèi)源性甘油三酯和膽固醇。

對(duì)雞Apob基因mRNA的研究發(fā)現(xiàn)，雞與哺乳動(dòng)物Apob基因mRNA的大小大致相同，約為14 kb。雞Apob的mRNA負(fù)責(zé)編碼4 631個(gè)氨基酸的Apob。預(yù)測(cè)分析顯示，Apob共有4個(gè)關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，其N端和C端分布著兩個(gè)重要結(jié)構(gòu)域，分別負(fù)責(zé)結(jié)合脂類和細(xì)胞膜上的LDL受體。另外兩個(gè)為未知功能結(jié)構(gòu)域。雞Apob為穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，其脂肪系數(shù)為90.07，平均親水性為-0.300。

哺乳動(dòng)物中ApobmRNA主要存在于肝和小腸中。Funahashi等[34]檢測(cè)表明，Apob基因在大鼠肝、小腸、腎上腺中表達(dá)量較高。另外胚胎大鼠在發(fā)育過程中，小腸和胎膜中Apob含量會(huì)顯著增加，且高于肝含量。與哺乳動(dòng)物不同的是，雞Apob的mRNA在腎中含量也較高。Zhang等[11]研究表明，白羽雞Apob基因主要表達(dá)于腎、肝和小腸中。蛋雞和肉雞肝中Apob基因的表達(dá)量一致，但該基因在蛋雞腎和小腸中表達(dá)量高于肉雞。為檢測(cè)Apob基因在黃羽肉雞中的表達(dá)情況，本試驗(yàn)選取4周齡雞的12個(gè)組織提取RNA進(jìn)行RT-qPCR。檢測(cè)結(jié)果表明，Apob基因主要在雞肝、腎及小腸組織中表達(dá)，與Zhang等[11]的研究結(jié)果一致。肝是禽類生長(zhǎng)發(fā)育與能量交換的重要場(chǎng)所，而內(nèi)源性脂類也主要由肝和脂肪合成釋放進(jìn)入血液。雞的脂肪組織本身不能或者只能少量合成脂酸，Apob可將肝合成和小腸吸收的脂肪轉(zhuǎn)運(yùn)至肝外組織，用于氧化供能或儲(chǔ)存堆積。另外，禽類肝內(nèi)Apob的合成還受到雌激素的調(diào)節(jié)，但在腎和小腸組織中的表達(dá)卻不受雌激素影響[35]。

脂肪沉積是由多基因控制的復(fù)雜過程。家禽體內(nèi)不同部位脂肪沉積速度和量并不相同，肉雞以腹脂沉積量為最高，其次是頸部脂肪和腿部皮下脂肪[36]。研究表明，8周齡仔雞腹脂重量是頸部脂肪的3.4倍，腿部脂肪的4倍[37]。雞的腹脂性狀遺傳力較為穩(wěn)定[38]，從遺傳育種方面選育優(yōu)質(zhì)肉雞效果較為理想[39-40]。因此，為探究Apob基因在雞肝脂代謝過程中的作用，對(duì)雞Apob基因進(jìn)行敲除試驗(yàn)具有重要意義。與以往的基因編輯技術(shù)相比，CRISPR/Cas技術(shù)具有明顯的優(yōu)勢(shì)，研究人員只要設(shè)計(jì)和制造用于基因組定位的RNA序列，就能精準(zhǔn)靶向目標(biāo)基因，實(shí)現(xiàn)對(duì)特定基因的破壞、修復(fù)、關(guān)閉和啟動(dòng)。因此本試驗(yàn)利用CRISPR/Cas9技術(shù)，設(shè)計(jì)合成靶向Apob基因的3對(duì)sgRNA，構(gòu)建重組表達(dá)載體，在DF-1細(xì)胞系上進(jìn)行敲除活性驗(yàn)證。將構(gòu)建成功的Cas/gRNA轉(zhuǎn)染至DF-1細(xì)胞后，提取基因組DNA，通過PCR擴(kuò)增、T7EI酶切驗(yàn)證靶位點(diǎn)敲除活性。T7EI酶切顯示，Cas/gRNA載體均可發(fā)揮敲除活性，且sgRNA6切割活性最強(qiáng)。為明確基因編輯類型，利用TA克隆測(cè)序進(jìn)行檢測(cè)。測(cè)序結(jié)果表明，突變類型以堿基缺失為主，且Cas/gRNA8敲除效率高達(dá)80%。RT-qPCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染Cas9/gRNA7、Cas9/gRNA6和Cas9/qRNA9的細(xì)胞中Apob基因mRNA表達(dá)水平分別約下調(diào)99.96%(P<0.01)、85%(P<0.01)和47%(P<0.05)。

4 結(jié) 論

本研究揭示了雞Apob是相對(duì)分子質(zhì)量為523.356 ku，平均親水性為-0.300的穩(wěn)定蛋白質(zhì)；Apob基因主要在雞肝、腎及小腸組織中表達(dá)；另外成功構(gòu)建了雞Apob基因的敲除載體，并檢測(cè)到基因敲除的亞克隆細(xì)胞中Apob基因mRNA水平顯著下調(diào)；為探明Apob基因在雞肝脂代謝中的功能及家禽的良種選育提供了新方向。