林若慧 李生強(qiáng) 陳娟 謝麗華 葛繼榮

1.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建 福州 350122 2.福建省中醫(yī)藥科學(xué)院基礎(chǔ)研究所骨質(zhì)疏松證候基因組學(xué)研究室，福建 福州 350003

骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量丟失，骨組織微小結(jié)構(gòu)破壞，引起骨強(qiáng)度下降和骨脆性增加為特征的全身代謝性疾病，臨床上多見于絕經(jīng)后婦女。中醫(yī)認(rèn)為骨質(zhì)疏松癥屬于“骨痿”等范疇，祖國醫(yī)學(xué)辨證治療及預(yù)防骨質(zhì)疏松癥具有明顯的優(yōu)勢(shì)甚至效果顯著，但中醫(yī)理論指導(dǎo)下中醫(yī)藥治療骨質(zhì)疏松癥的分子機(jī)制仍不明確。骨質(zhì)疏松癥分子生物學(xué)的研究發(fā)展為OP的中醫(yī)藥治療研究開辟新的思路，這對(duì)臨床上中醫(yī)藥的廣泛應(yīng)用具有重要指導(dǎo)意義。長(zhǎng)鏈非編碼RNA是近年來的研究熱點(diǎn)，是控制多種基因表達(dá)以及參與多種生物學(xué)過程的重要表觀遺傳調(diào)控因子。越來越多的研究表明，lncRNAs在骨質(zhì)疏松癥、骨關(guān)節(jié)炎等疾病的部分中醫(yī)證型中差異性表達(dá)[1]，中藥調(diào)控lncRNA干預(yù)治療骨骼疾病也逐步成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)。因此，本文基于lncRNA總結(jié)近年來中醫(yī)藥治療骨質(zhì)疏松癥的研究進(jìn)展，進(jìn)一步表明lncRNA在骨質(zhì)疏松癥中醫(yī)藥治療的分子機(jī)制中的研究?jī)r(jià)值，為臨床實(shí)踐提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

1 lncRNA簡(jiǎn)介

lncRNA即長(zhǎng)鏈非編碼RNA，是長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸、不被翻譯成蛋白質(zhì)的一類功能性RNA分子，最早被發(fā)現(xiàn)具有誘導(dǎo)蛋白結(jié)合影響靶點(diǎn)活性，影響mRNA轉(zhuǎn)錄或構(gòu)成細(xì)胞結(jié)構(gòu)成分等功能[2]。研究表明，某些lncRNAs參與了人類疾病的發(fā)病機(jī)制，如骨代謝疾病、癌癥、心血管疾病等[3]；并且與細(xì)胞周期、干細(xì)胞分化等生物進(jìn)程相關(guān)[4-5]。同時(shí)，越來越多證據(jù)表示lncRNA 在基因調(diào)控上的重要作用，分別為表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平影響基因表達(dá)[6-7]。

2 骨吸收-骨形成過程中l(wèi)ncRNA的表達(dá)

骨骼的完整性由不斷重復(fù)的動(dòng)態(tài)“骨重建”維持[8]，而骨重建由成骨細(xì)胞(osteoblasts，OB)、破骨細(xì)胞(osteoclast，OC)和骨細(xì)胞等組成的骨骼基本多細(xì)胞單位實(shí)施。隨著年齡增加，骨吸收則大于骨形成，引起骨代謝失衡導(dǎo)致骨質(zhì)疏松。lncRNA參與了骨質(zhì)疏松癥骨代謝失衡的動(dòng)態(tài)過程，主要涉及成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞分化和調(diào)控，并在骨代謝相關(guān)信號(hào)通路中有重要的調(diào)節(jié)作用。

研究表示lncRNA-H19、lncRNA-HIF1α-AS1[9]、lncRNATUG1[10]、lncRNAMEG3[11]、lncRNAMALAT1[12]等可能參與了成骨細(xì)胞的增殖過程。其中l(wèi)ncRNA-H19[13]則是通過靶向miR-675間接誘導(dǎo)成骨細(xì)胞增殖，同時(shí)充當(dāng)競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA[14]激活Wnt信號(hào)傳導(dǎo)促進(jìn)成骨細(xì)胞分化；此外，lncRNA-H19、lncRNAMEG3和lncRNATSIX[15]通過miRNA間接減弱成骨細(xì)胞的增殖。RUNX2轉(zhuǎn)錄因子是促成骨分化通路中的關(guān)鍵因子，有研究表明lncRNA ANCR[16]與EZH2特異性結(jié)合能促進(jìn)Runx2表達(dá)從而促成骨分化。

在破骨細(xì)胞功能和骨吸收過程中，lncRNA調(diào)控的信息較少。洪宇桁等[17]認(rèn)為lncNEAT1促進(jìn)破骨細(xì)胞分化并抑制成骨細(xì)胞分化；另有Dou等[18]對(duì)破骨細(xì)胞形成各個(gè)階段lncRNA、mRNA、circRNA和miRNA的表達(dá)譜進(jìn)行了微陣列分析，構(gòu)建了相應(yīng)的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，為lncRNA在OC發(fā)生過程中發(fā)揮的潛在功能提供系統(tǒng)性的觀點(diǎn)。Liu等[19]驗(yàn)證了lncRNAAK077216的表達(dá)在破骨細(xì)胞發(fā)生過程中顯著上調(diào)，提示AK077216抑制NIP45的表達(dá)，且調(diào)節(jié)NFATc1的表達(dá)從而促進(jìn)破骨細(xì)胞的形成和功能。Han等[20]發(fā)現(xiàn)，與健康人群相比，LncRNA TUG1在骨質(zhì)疏松癥患者血清中表達(dá)更高，過表達(dá) LncRNA TUG1促進(jìn)破骨細(xì)胞的增殖及抑制凋亡；采用siRNA敲低則取得了相反的結(jié)果，表明敲低LncRNA TUG1可能成為一個(gè)骨質(zhì)疏松治療的潛在靶點(diǎn)。此外，lncRNA還被發(fā)現(xiàn)參與調(diào)節(jié)細(xì)胞因子[21-22]、骨代謝相關(guān)信號(hào)通路[23]發(fā)生過程。

3 OP不同中醫(yī)證型lncRNA的差異表達(dá)

中醫(yī)將OP歸入“骨痿”、“骨痹”等病癥范疇，并且認(rèn)為其發(fā)生與腎、脾和肝等臟腑功能密切相關(guān)。《素問·痿論》：“骨主身之骨髓，腎氣熱，則腰脊不舉，骨枯而髓減，發(fā)為骨痿?！毖灾驹谀I，病在骨。若稟賦素弱，或久病及腎，或年老腎氣漸衰，皆可致腎氣虧虛，難以化精氣滋養(yǎng)骨髓，故腎虛是本病的主要病因。“骨痿”也與脾關(guān)系密切，若脾胃虛弱，氣血乏源，則肌肉失養(yǎng)，骨骼失去肌肉的支撐則骨弱難支。此外，肝血不足，精血失養(yǎng)，肝腎精虧或陰虛失養(yǎng)也可致骨質(zhì)疏松的發(fā)生。原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥在臨床上一般分為腎陽虛證、肝腎陰虛證、脾腎陽虛證、腎虛血瘀證等6種證型[24]。臨床上以腎虛證為常見，治療以補(bǔ)腎為主，故研究者們也大多從OP腎虛證的分子機(jī)制中探索。

本課題組[25]前期檢測(cè)腎陰虛、腎陽虛證的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)患者的lncRNA表達(dá)譜，篩選出腎陰虛、腎陽虛證組之間的差異表達(dá)lncRNA45條、差異表達(dá)mRNA35條，并構(gòu)建了差異lncRNAs基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，同時(shí)分析得出LINC00334等8條共同差異表達(dá)的lncRNAs。生物信息學(xué)分析表明它們可能通過調(diào)控JAK/STAT、MAPK等12條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來調(diào)節(jié)骨代謝平衡，從而參與腎陰虛證的發(fā)生發(fā)展過程[26]。在lncRNA芯片篩選的基礎(chǔ)上，課題組進(jìn)一步驗(yàn)證了lincRNAuc431+及其靶基因CLCF1在PMOP腎陰虛證中低表達(dá)[27]，且lincRNAuc431+可能對(duì)CLCF1負(fù)向調(diào)節(jié)。另外，課題組的研究[28]發(fā)現(xiàn)GAS5低表達(dá)可影響骨免疫相關(guān)細(xì)胞因子水平，從而通過對(duì)骨免疫通路的收縮影響骨代謝平衡，參與PMOP的發(fā)生和發(fā)展。這些研究表明了絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥腎虛證患者中l(wèi)ncRNAs存在差異表達(dá)，它們參與了骨質(zhì)疏松癥中醫(yī)證的發(fā)生發(fā)展。

4 OP中醫(yī)藥治療中l(wèi)ncRNA的調(diào)控

4.1 中醫(yī)藥干預(yù)OP模型對(duì)lncRNA表達(dá)的影響

現(xiàn)有研究[29-30]發(fā)現(xiàn)中草藥的生物活性成分靶向非編碼RNA，尤其是miRNA，lncRNA和circRNA，它們已成為許多疾病的新治療靶標(biāo)。lncRNA相關(guān)中藥作用機(jī)制也已成為中醫(yī)藥研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域，多種中藥可通過lncRNA發(fā)揮疾病治療作用[31]。臨床研究[32]表明中醫(yī)藥治療OP已具顯著療效，同時(shí)越來越多研究也逐步深入中藥調(diào)控lncRNA干預(yù)治療骨質(zhì)疏松癥等骨骼疾病。柴爽[33]通過對(duì)去卵巢大鼠模型高通量測(cè)序后進(jìn)行差異性分析，發(fā)現(xiàn)存在差異表達(dá)的17條lncRNA(9條上調(diào)和8條下調(diào))和21條TUCP，對(duì)差異表達(dá)的lncRNA和TUCP進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)錄本預(yù)測(cè)到BMP家族，而進(jìn)一步深入實(shí)驗(yàn)證實(shí)了骨疏康可以通過刺激BMP-2/Smads信號(hào)途徑的活化來改善去卵巢大鼠模型的骨密度和骨微結(jié)構(gòu)特性。張峰等[34]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷干預(yù)治療能顯著提高兔骨質(zhì)疏松臨床療效，優(yōu)化股骨MEG3、H19和DANCR/ANCR三者lncRNAs表達(dá)水平。Zhang等[35]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過薯蕷皂苷元(diosgenin，DIO)干預(yù)，抑制了卵巢切除術(shù)(OVX)引起的大鼠牙槽骨量丟失，結(jié)果顯示在構(gòu)建的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵lncRNA與mRNA的相互作用，且部分lncRNA可能通過骨代謝途徑中的一些關(guān)鍵mRNA發(fā)揮作用，他們認(rèn)為這種抗骨質(zhì)疏松影響的機(jī)制可能在于DIO對(duì)lncRNA和mRNA表達(dá)譜的整體調(diào)節(jié)。

4.2 中醫(yī)藥調(diào)控lncRNA影響B(tài)MSCs成軟骨、成骨分化

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是一種有多向分化能力的細(xì)胞，經(jīng)誘導(dǎo)下可向成骨細(xì)胞分化[36]，在骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生起著重要作用。梁晶亮[37]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)左歸丸含藥血清在BMSCs成軟骨分化過程中影響相關(guān)lncRNA的表達(dá)，利用基因芯片技術(shù)在表達(dá)譜中共發(fā)現(xiàn)5個(gè)lncRNAs顯著上調(diào)，4個(gè)lncRNAs顯著下調(diào)；李亮[38]則研究發(fā)現(xiàn)右歸丸可能通過調(diào)控XR0072425等9個(gè)lncRNAs的表達(dá)來影響B(tài)MSCs的軟骨分化。

張順聰[39]實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了LncANRIL抑制細(xì)胞成骨分化因子的表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷通過調(diào)控ANRIL-CDKN2B方式呈時(shí)間特異性的促進(jìn)人BMSCs成骨分化。Fang等[40]發(fā)現(xiàn)活血通絡(luò)膠囊通過抑制內(nèi)源lncRNA-Miat的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而促進(jìn)大鼠BMSCs的成骨。Hou等[41]研究揭示了數(shù)個(gè)mRNAs和lncRNAs在中藥活性成分(+)-cholesten-3-one誘導(dǎo)的成骨分化中起重要作用；當(dāng)歸多糖(angelica polysaccharide，AP)是當(dāng)歸的主要水溶性成分，Xie等[42]人發(fā)現(xiàn)AP以劑量依賴的方式上調(diào)了lncRNAH19的相對(duì)表達(dá)水平，反之抑制H19從而逆轉(zhuǎn)了AP對(duì)細(xì)胞增殖和成骨細(xì)胞分化的促進(jìn)作用。同時(shí)，姚順晗等[43]發(fā)現(xiàn)羅漢果苷V通過促進(jìn)LncRNATUG1表達(dá)刺激成骨細(xì)胞的增殖與分化。

中醫(yī)藥具有成分復(fù)雜、多靶點(diǎn)作用的特點(diǎn)，隨著lncRNA與骨質(zhì)疏松癥分子機(jī)制關(guān)系的深入挖掘，中醫(yī)藥可通過調(diào)控lncRNAs發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松的作用機(jī)制更加清晰。但目前研究涉及臨床試驗(yàn)尚少，仍需臨床進(jìn)一步驗(yàn)證補(bǔ)充。

5 展望

骨質(zhì)疏松癥是一種全身代謝性疾病，其產(chǎn)生可能與干細(xì)胞的成骨分化減弱、成骨細(xì)胞的骨形成作用減弱、破骨細(xì)胞的增殖及骨吸收作用增強(qiáng)和免疫調(diào)控等多種作用機(jī)制有關(guān)；lncRNA作為一種參與骨代謝生物學(xué)過程的重要因子，從多種水平在骨質(zhì)疏松癥發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。中醫(yī)藥治療原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的原則是“辨證施治，病證結(jié)合，整體調(diào)節(jié)，防治結(jié)合”，治療OP的過程中具有不良反應(yīng)小、不良反應(yīng)發(fā)生率低的優(yōu)勢(shì)[44]。但在長(zhǎng)期使用過程中，仍需持續(xù)關(guān)注中醫(yī)藥使用的安全性問題，加強(qiáng)安全性指標(biāo)監(jiān)測(cè)，并且密切關(guān)注患者中醫(yī)證候的演變，及時(shí)調(diào)整處方或?qū)ΠY處理?？傊?，OP中醫(yī)證具有復(fù)雜、難以客觀化及微觀化的特點(diǎn)，而lncRNA已在部分證型中呈現(xiàn)不同的差異性表達(dá)；與此同時(shí)，中醫(yī)藥也可調(diào)控lncRNA的表達(dá)水平影響OP“骨吸收-骨形成”的過程從而達(dá)到治療效果，由此推測(cè)lncRNA可能作為預(yù)測(cè)診斷及判斷預(yù)后的指標(biāo)以及治療的潛在靶點(diǎn)，為深入探討中醫(yī)藥治療OP的機(jī)制研究提供新思路和新方法。