王春艷 王曙光 王佳麗

【關(guān)鍵詞】 高效液相色譜法 瘦素 基因多態(tài)性 復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)

[Abstract] Objective： To investigate the possible associations of Leptin polymorphisms with the risk of recurrent spontaneous abortion （RSA）. Method： A total of 138 patients with recurrent abortion who visited our hospital from May 2016 to April 2019 were selected as RSA group， and 142 normal pregnant women who underwent obstetric examination in our hospital during the same period were selected as control group. All subjects were forbidden to eat， 5 mL peripheral venous blood was taken， all genotypes were determined by High performance liquid chromatography （DHPLC）， and serum leptin level was determined by ELISA. Result： In the polymorphism of Leptin RS7799039 G/A genotype， the frequency of GA+AA type， AA type and A allele in RSA group were higher than those in control group， GG type was lower than that in the control group （P<0.05）. In Leptin RS7799039 G/A gene polymorphism， patients with A allele and patients without non-A allele in RSA group have different clinical manifestations， The incidence of severe pregnancy reaction， abortion time during pregnancy （≥3 months）， abortion ≥3 times and interval between pregnancy and next pregnancy （≥6 months） in patients with GG genotype were higher than those with GA+AA genotype， the differences were statistically significant （P<0.05）. In the control group， the plasma leptin level of GG genotype pregnancy was （4.87±0.36） ng/mL， although slightly lower than （5.01±0.39） ng/mL of GA+AA genotype， but the difference was not statistically significant （P=0.101）; in RSA group， the leptin level of patients with GG genotype RSA was （6.38±0.45） ng/mL， lower than （6.77±0.56） ng/mL of patients with GA+AA genotype， the difference was statistically significant （P=0.026）. Conclusion： Leptin rs7799039 G/A mutation of A gene can increase the risk of RSA.

[Key words] High performance liquid chromatography Leptin Genetic polymorphism Recurrent spontaneous abortion

First-author’s address： Shenzhen Longhua District Central Hospital， Shenzhen 518110， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.26.039

復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）為妊娠20周內(nèi)出現(xiàn)兩次或兩次以上的連續(xù)性妊娠并發(fā)生流產(chǎn)，文獻(xiàn)統(tǒng)計復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)在育齡婦女的發(fā)病率達(dá)1%～5%[1-2]，一旦出現(xiàn)復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)，多數(shù)患者臨床治療效果差。RSA是由多種因素引起，遺傳、內(nèi)分泌、激素異常、各種病原微生物病毒等感染、胎盤異常、長期吸煙、過度過量飲酒、有毒有害環(huán)境因素暴露、心理創(chuàng)傷和持續(xù)性不良心理壓力等公認(rèn)因素所引起[3-4]。然而，尚有近40%的RSA患者的具體病因不明[5]，經(jīng)多種檢查檢驗均未發(fā)現(xiàn)異常結(jié)果，為探究此類RSA患者的病因，許多科研工作人員轉(zhuǎn)向遺傳學(xué)、內(nèi)分泌學(xué)和免疫學(xué)等非常規(guī)領(lǐng)域?qū)SA的致病因素和治療進(jìn)行了探索[6-8]，最近一年以來，分子生物學(xué)技術(shù)得到飛速發(fā)展，借此技術(shù)，人們將研究的重點轉(zhuǎn)移到基因多態(tài)性與RSA的關(guān)系上。

瘦素是人體內(nèi)肥胖基因的產(chǎn)物，瘦素的生理作用可調(diào)節(jié)個體體重、飽腹感以及個體的生育能力[9]，瘦素可以通過飽腹感控制食物攝入的量，瘦素可以刺激能量消耗，進(jìn)一步發(fā)揮著代謝調(diào)節(jié)作用，瘦素的本質(zhì)是下丘腦發(fā)出的神經(jīng)內(nèi)分泌信號，它的作用途徑是通過T淋巴細(xì)胞系統(tǒng)或者通過原癌基因來實現(xiàn)，瘦素可以調(diào)節(jié)或者控制胎兒-胎盤結(jié)構(gòu)的功能完整性，進(jìn)一步經(jīng)過免疫調(diào)節(jié)作用保證并維持妊娠的持續(xù)[10]。瘦素在各種病原微生物感染和炎癥過程中發(fā)生了顯著變化，瘦素在免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)功能受到了越來越多的關(guān)注[9，11]。復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)、妊娠期孕婦發(fā)生的糖尿病、妊娠期發(fā)生的先兆子癇、宮內(nèi)胎兒發(fā)育遲緩等因素，均有可能與瘦素在胎兒、胎盤、母體三者之間的分泌功能發(fā)生失調(diào)相關(guān)。研究顯示，瘦素rs7799039 G/A基因多態(tài)性和血漿中瘦素水平表達(dá)密切相關(guān)，推測其機(jī)制可能通過在轉(zhuǎn)錄的水平上影響了瘦素表達(dá)水平[12]。然而，目前為止，有關(guān)RSA的風(fēng)險與人體血液中瘦素基因多態(tài)性關(guān)聯(lián)的研究暫時未見相關(guān)報道，因此，本研究旨在探討人體血液中瘦素基因多態(tài)性對RSA的影響和意義，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年5月-2019年4月來深圳市龍華區(qū)中心醫(yī)院婦產(chǎn)科門診診治的138例復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者為RSA組，另選取同期142例正常妊娠婦女為對照組。RSA組的納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）連續(xù)發(fā)生兩次或兩次以上妊娠自然流產(chǎn)的婦女;（2）夫婦核型及流產(chǎn)后留取的絨毛取樣正常;（3）參與研究的患者生殖道無異常解剖;（4）化驗檢查內(nèi)分泌功能正常，如生殖內(nèi)分泌、甲狀腺功能檢查均未見異常;（5）血液中各種自身抗體檢測陰性，例血液中抗心磷脂抗體、抗核抗體、抗補(bǔ)體依賴性抗體和弓形蟲以及比較常見的其他病毒如風(fēng)疹病毒、巨細(xì)胞病毒單純皰疹病毒Ⅱ;（6）檢測后未發(fā)現(xiàn)患者有血栓形成或血栓形成傾向;（7）生殖道炎癥檢測未見異常，無全身炎癥反應(yīng)。對照組的納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）未出現(xiàn)自然流產(chǎn)史;（2）夫妻雙方染色體核型正常;（3）夫妻雙方至少曾生育一正常存活胎兒，并且未出現(xiàn)妊娠相關(guān)并發(fā)癥。兩組的排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）具有吸煙、飲酒史、吸毒和家族相關(guān)疾病;（2）具有慢性疼痛、先天生殖道異常、內(nèi)分泌紊亂;（3）患有嚴(yán)重心腦血管疾病、肝腎功能檢查不全;（4）患有抑郁癥傾向或其他精神疾病;（5）過去三個月內(nèi)因曾因并發(fā)癥再次手術(shù)。該研究經(jīng)深圳市龍華區(qū)中心醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，入組人員均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 檢測瘦素基因多態(tài)性 抽取各受試者的外周血（5 mL）放置于裝有乙二胺四乙酸試劑（Ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）的試管中，然后儲存在-80 ℃超低溫冰箱中儲存。按照血液基因組DNA提取試劑盒的提取步驟（大連TaKaRa生物科技有限公司）提取血液中的DNA。以瘦素rs7799039 G/A為引物，然后進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增，引物設(shè)計是通過prime 5.0軟件進(jìn)行設(shè)計，引物合成公司是上海生工生物科技有限公司，引物序列具體如下F：5’-TTTCCTGTAATTTTCCCATGAG-3’;R：5’-AAGCAAAGACAGGCATAAAA-3’設(shè)定PCR的反應(yīng)條件為：94 ℃ 2 min;94 ℃ 1 min，52 ℃?1 min，72 ℃ 1 min，一共計35個循環(huán);72 ℃進(jìn)行延長5 min。反應(yīng)產(chǎn)物儲存于4 ℃以下備用。利用變性高效液相色譜分析（denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC）檢測對照組和RSA組研究對象的PCR產(chǎn)物的基因型。具體實驗條件如下：柱溫設(shè)定溫度為59.3 ℃，流動相的流速設(shè)定為0.9 mL/min，瘦素rs7799039 G/A的基因分型檢測需要通過2個步驟完成：（1）瘦素rs7799039雜合子GA基因型顯示峰型為雙峰DHPLC（圖1a）;（2）瘦素rs7799039顯示單峰的樣品，需要進(jìn)一步檢測，通過與經(jīng)測序已經(jīng)證實的等效GG樣品進(jìn)行混合，然后，再次進(jìn)行DHPLC測序分析，則野生型GG基因型顯示單峰，突變型AA基因型顯示雙峰（圖1b）。進(jìn)一步通過測序驗證G和A的突變（圖1c）。

3 000 r/min的速度，離心分離全血約10 min，然后將血漿轉(zhuǎn)移到塑料離心管中。以下程序遵照KIT（R&D系統(tǒng)公司，明尼阿波利斯，MN，USA）手冊執(zhí)行：將離心樣品置于37 ℃下，以稀釋血漿包被ELISA板30 min，然后在每孔中均加入50 μL酶液作用處理30 min。隨后，再分別加入50 μL顯色劑A和50 μL顯色劑B，將各培養(yǎng)孔在避光處保存15 min。最后，酶聯(lián)免疫吸附試驗板各孔變藍(lán)。如果每個反應(yīng)孔顏色太淺，建議進(jìn)一步延長染色時間。通過在各孔中加入50 μL反應(yīng)終止液，各孔顏色會轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。在反應(yīng)體系反應(yīng)終止后的15 min，然后對反應(yīng)體系在450 nm波長下，進(jìn)行光密度（OD）值的測量。然后以O(shè)D值為橫坐標(biāo)，濃度為縱坐標(biāo)進(jìn)行繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次為25、50、100、200、400 ng/L，根據(jù)檢測到的血漿濃度數(shù)值，推算出其他樣品的大致最佳稀釋率。

1.3 觀察指標(biāo) （1）比較兩組瘦素rs7799039 G/A的基因型和等位基因頻率分布。（2）分析瘦素rs7799039 G/A基因型多態(tài)性與RSA風(fēng)險關(guān)系。（3）分析瘦素rs7799039 G/A基因型多態(tài)性與RSA患者臨床特征的關(guān)聯(lián)性。（4）比較兩組不同基因型的血漿瘦素水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。研究中連續(xù)性資料通過（x±s）進(jìn)行描述，兩組間的比較通過t檢驗進(jìn)行。利用百分比或率來描述分類資料，通過字2檢驗比較分類資料各組之間率的差別。比值比（OR值）以及95%可信區(qū)間（95%CI）的計算通過多因素logistic回歸，進(jìn)而估計復(fù)發(fā)性流產(chǎn)與Leptin基因多態(tài)性之間的關(guān)系。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較 兩組的一般資料比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有可比性，見表1。

2.2 兩組瘦素rs7799039 G/A的基因型多態(tài)性以及其等位基因頻率分布比較 在Leptin rs7799039 G/A的多態(tài)性中，RSA組的AA型、GA+AA型以及A等位基因型頻率均高于對照組，GG型頻率低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;兩組的GA型頻率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

2.3 瘦素rs7799039 G/A基因型多態(tài)性與RSA風(fēng)險關(guān)系分析 以瘦素rs7799039 G/A的GG基因型和非GG基因型為自變量，以RSA患者作為因變量，進(jìn)行雙變量的logistic回歸分析，瘦素rs7799039 G/A的非GG基因型與GG基因型分析相比，患RSA的風(fēng)險高4.081倍[95%CI（1.817，9.164），P=0.001]。

2.4 瘦素rs7799039 G/A基因型多態(tài)性與RSA患者臨床特征的關(guān)聯(lián)性 攜帶GG基因型患者的嚴(yán)重妊娠反應(yīng)、妊娠期流產(chǎn)時間（≥3個月）、流產(chǎn)≥3次、與下一次妊娠時間間隔（≥6個月）的發(fā)生率均高于GA+AA基因型，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表3。

2.5 兩組不同基因型的血漿瘦素水平比較 在Leptin rs7799039 G/A多態(tài)性的GG型和GA+AA型的人群中，RSA組為（6.74±0.56）ng/mL，高于對照組的（4.99±0.39）ng/mL，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）;在對照組中，具有GG基因型的受試者的Leptin水平為（4.87±0.36）ng/mL，雖略低于具有GA+AA基因型受試者的（5.01±0.39）ng/mL，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.101）;在RSA組中，具有GG基因型的RSA患者的Leptin水平為（6.38±0.45）ng/mL，低于具有GA+AA基因型RSA患者的（6.77±0.56）ng/mL，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.026）。

3 討論

RSA的病因非常復(fù)雜，涉及范圍十分廣泛，如遺傳學(xué)異常、激素異常、內(nèi)分泌失調(diào)、胎盤功能及分泌功能異常、個體既往的心理創(chuàng)傷和個體心理持續(xù)保持緊張情緒等。近幾年研究提示，基于免疫學(xué)和遺傳學(xué)的研究成果，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的病因與基因多態(tài)性可能存在相關(guān)性[13]。

瘦素是由體內(nèi)脂肪細(xì)胞分泌的一種蛋白激素，瘦素在能量代謝和蛋白質(zhì)平衡中發(fā)揮著重要作用。Leptin的體內(nèi)靶器官分布廣泛、功能多樣，瘦素可以參與多種代謝調(diào)節(jié)，可通過作用于下丘腦抑制食欲，控制食物的攝入數(shù)量、調(diào)節(jié)機(jī)體代謝能量平衡;通過下丘腦-垂體-卵巢性腺軸途徑促進(jìn)發(fā)情期的啟動過程，瘦素可以維持正常的發(fā)情周期;瘦素亦可以作為炎性介質(zhì)，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫和炎癥反應(yīng)發(fā)揮作用，瘦素另外可以調(diào)節(jié)體內(nèi)多種激素分泌，促進(jìn)血細(xì)胞和血管生成等方面。

瘦素的生物學(xué)活性非常廣泛，有可能參與了多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程，如肥胖癥、糖尿病、乳腺相關(guān)疾病、心腦血管疾病、骨質(zhì)疏松疾病等多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程均與瘦素有關(guān)。Leptin亦可以調(diào)節(jié)個體生殖系統(tǒng)的營養(yǎng)狀況，影響女性生殖系統(tǒng)的內(nèi)分泌功能、通過下丘腦、垂體、性腺軸途徑，進(jìn)一步影響女性的生殖和排卵，參與調(diào)節(jié)青春期的營養(yǎng)代謝和生殖行為，在營養(yǎng)代謝和生殖代謝的調(diào)節(jié)中發(fā)揮了極其重要的作用[14]，近年來的研究顯示出Leptin是導(dǎo)致RSA的危險因素之一。

瘦素還可以通過影響胎盤中的血管滲透性、內(nèi)皮細(xì)胞以及滋養(yǎng)細(xì)胞的形成，進(jìn)而調(diào)節(jié)胎盤中的血管形成水平，妊娠早期個體血液中的瘦素表達(dá)水平可能和胎兒的生長發(fā)育存在一定相關(guān)性。宮內(nèi)發(fā)育遲緩的胎兒檢測出孕婦臍血中的瘦素水平低下[15-17]。

Leptin rs7799039 G/A中的多態(tài)性改變將在轉(zhuǎn)錄水平上影響瘦素水平表達(dá)、激素的脂肪分泌水平變化，個體體內(nèi)脂肪含量水平不同，血清中個體瘦素表達(dá)亦存在個體間差異。文獻(xiàn)[18]對39例正常體重女性的瘦素基因啟動子區(qū)多態(tài)性（-2548G/A）的基因轉(zhuǎn)錄水平和血漿瘦素水平研究，可以得出11例婦女為AA型純合基因型，18例婦女為GA雜合基因型，10例婦女GG基因型，AA基因型組婦女血清瘦素水平高于GA/GG基因型組婦女血清水平（P=0.02）。AA組基因型的脂肪組織瘦素水平分泌率是GA/GG基因組的兩倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），AA基因型組婦女的脂肪組織瘦素的mRNA表達(dá)的水平較GA/GG基因型組的表達(dá)水平高60%[18]，綜上所述，Leptin rs7799039 G/A（-2548G/A）基因啟動子基因型的多態(tài)性，有可能是在轉(zhuǎn)錄水平上導(dǎo)致了瘦素表達(dá)水平、激素的脂肪分泌水平方面的變化。目前研究發(fā)現(xiàn)，某些抗精神病藥物所引起的個體體重增加亦有可能與Leptin rs7799039 G/A的基因多態(tài)性有著重要關(guān)系[19];女性人群節(jié)食導(dǎo)致BMI下降前的體內(nèi)高水平瘦素，與Leptin rs7799039 G/A基因的多態(tài)性關(guān)系密切[20];但是目前為止，關(guān)于Leptin基因多態(tài)性與RSA發(fā)病風(fēng)險之間關(guān)系的相關(guān)研究尚未見報道。本研究的結(jié)果顯示，瘦素rs7799039 G/A基因多態(tài)性表達(dá)增加了患RSA的風(fēng)險（OR=4.081，P=0.001），在RSA組和正常妊娠對照組中，GG基因型攜帶者個體血漿中瘦素濃度低于RSA組GA+AA基因型攜帶者（P=0.026），提示瘦素rs7799039 G/A基因多態(tài)性可能會增加患RSA的風(fēng)險，其相關(guān)機(jī)制推測可能是瘦素rs7799039 G/A基因多態(tài)性改變了個體體內(nèi)Leptin的表達(dá)水平，進(jìn)一步影響了瘦素的生理調(diào)節(jié)功能，最終導(dǎo)致自然流產(chǎn)率上升。

因為RSA的致病因素極其繁多，機(jī)制復(fù)雜，其他研究有可能存在和本研究結(jié)果不一致的情況，存在一定爭議。后續(xù)相關(guān)研究應(yīng)該繼續(xù)在基因?qū)用孢M(jìn)一步探討相關(guān)發(fā)病機(jī)制，進(jìn)而為RSA疾病的預(yù)防提供一定有意義的參考意見。

參考文獻(xiàn)

[1] Pang L，Wei Z，Li O，et al.An increase in vascular endothelial growth factor （VEGF） and VEGF soluble receptor-1 （sFlt-1） are associated with early recurrent spontaneous abortion[J].PLoS One，2013，8（9）：757-763.

[2] Pereza N，Ostoji? S，Kapovi? M，et al.Systematic review and meta-analysis of genetic association studies in idiopathic recurrent spontaneous abortion[J].Fertil Steril，2017，107（1）：150-159.

[3] Kolte A M，Olsen L R，Mikkelsen E M，et al.Depression and emotional stress is highly prevalent among women with recurrent pregnancy loss[J].Hum Reprod，2015，30（4）：777-782.

[4] Shang W，Wang A，Lv L，et al.Individualized Hormone Adjustment in the Treatment of Recurrent Spontaneous Abortions[J].Cell Biochem Biophys，2015，72（3）：817-820.

[5] San Lazaro Campillo I，Meaney S，McNamara K，et al.Psychological and support interventions to reduce levels of stress， anxiety or depression on women’s subsequent pregnancy with a history of miscarriage： an empty systematic review[J].BMJ Open，2017，7（9）：234-239.

[6] Bari?i? A，Pereza N，Hod?i? A，et al.Functional single nucleotide polymorphisms of matrix metalloproteinase 7 and 12 genes in idiopathic recurrent spontaneous abortion[J].J Assist Reprod Genet，2017，34（3）：365-371.

[7] Pereza N，Ostoji? S，Zdrav?evi? M，et al.Insertion/deletion polymorphism in intron 16 of ACE gene in idiopathic recurrent spontaneous abortion： case-control study， systematic review and meta-analysis[J].Reprod Biomed Online，2016，32（2）：237-246.

[8] Li X Y，Zhao J X，Liu X Y.Diagnosis and treatment of antiphospholipid antibody-related recurrent spontaneous abortion and analysis of therapeutic drugs and pregnancy outcome in 75 patients with antiphospholipid syndrome[J].Beijing Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban，2018，50（6）：956-961.

[9] Khosropour S，Hamidi M，F(xiàn)attahi A，et al.Leptin and leptin-receptor polymorphisms in fertile and infertile men[J].Syst Biol Reprod Med，2017，63（1）：7-14.

[10] Carlton E D，Demas G E，F(xiàn)rench S S.Leptin，aneuroen docrinemediator of immuneresponses，inflammation，and sickness behaviors[J].HormBehav，2012，62（3）：272-279.

[11] Salmerón C，Johansson M，Asaad M，et al.Roles of leptin and ghrelin in adipogenesis and lipid metabolism of rainbow trout adipocytes in vitro[J].Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol，2015，188（10）：40-48.

[12] Tang W，Kang M，Liu C，et al.Leptin rs7799039 （G2548A） polymorphism is associated with cancer risk： a meta-analysis involving 25，799 subjects[J].Onco Targets Ther，2019，16（4）：2879-2890.

[13] Yang Y，Liu P，Guo F，et al.Genetic G2548 Apolymorphism of leptin gene and risk of cancer： a meta-analysis of 6860 cases and 7956 controls[J].J BUON，2014，19（4）：1096-1104.

[14] Elzein A O，Ali A A，Hamdan H Z，et al.Materno-foetal leptin and insulin-like growth factor in low birth weight neonates[J].J Obstet Gynaecol，2016，36（1）：31-33.

[15] Christou H，Connors J M，Ziotopoulou M，et al.Cord blood leptin and insulin-like growth factor levels are independent predictors of fetal growth[J].J Clin Endocrinol Metab，2001，86（2）：935-938.

[16] Pérez-Pérez A，Toro A，Vilari o-García T，et al.Leptin action in normal and pathological pregnancies[J].J Cell Mol Med，2018，22（2）：716-727.

[17] Zhang Y，Chua S Jr.Leptin Function and Regulation[J].Compr Physiol，2017，8（1）：351-369.

[18] Hoffstedt J，Eriksson P，Mottagui-Tabar S，et al.A polymorphism in the leptin promoter region （-2548 G/A） influences gene expression and adipose tissue secretion of leptin[J].Horm Metab Res，2002，34（7）：355-359.

[19] Chen J，Tan L，Long Z，et al.Drug-naive patients with schizophrenia have metabolic disorders that are not associated with polymorphisms in the LEP （-2548G/A） and 5-HTR2C （-759C/T） genes[J].Int J Clin Exp Pathol，2018，11（12）：5969-5980.

[20] Riestra P，Garcia-Anguita A，Viturro E，et al.Influence of the leptin G-2548A polymorphism on leptin levels and anthropometric measurements in healthy Spanish adolescents[J].Ann Hum Genet，2010，74（4）：335-339.

（收稿日期：2021-08-09） （本文編輯：張爽）