牛悅，石磊，張?chǎng)?，孫新增，白建平

（中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第983醫(yī)院 普外科，天津300142）

三陰性乳腺癌（three negative breast cancer,TNBC）是指雌激素受體（estrogen receptor, ER）、孕激素受體（progesterone receptor,PR）、人類表皮生長因子受 體2（human epidermal growth factor receptor 2,HER2）表達(dá)均陰性的乳腺癌，占所有乳腺癌類型的12%～17%[1]。TNBC 是高侵襲性、異質(zhì)性惡性腫瘤，惡性程度高，臨床缺乏內(nèi)分泌和靶向治療藥物，治療后易復(fù)發(fā)，耐藥患者預(yù)后差，是病死率最高的乳腺癌亞型[2]。因此，探討與TNBC 的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移等惡性行為相關(guān)的分子機(jī)制對(duì)改善患者的預(yù)后具有重要意義。親嗜性病毒整合位點(diǎn)1（ecotropic virus integration site-1, EVI1）是一種原癌基因，具有雙結(jié)構(gòu)域的鋅指轉(zhuǎn)錄因子，參與白血病細(xì)胞的分化、凋亡和增殖，在髓系白血病中高度表達(dá)[3]。核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因2（karyopherin-α2, KPNA2）是核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的一員，參與多種腫瘤相關(guān)蛋白的核轉(zhuǎn)運(yùn)途徑，在結(jié)直腸癌、乳腺癌、胃癌、肝癌等惡性腫瘤中過表達(dá)，與不良預(yù)后有關(guān)[4-5]。有關(guān)EVI1、KPNA2 在TNBC 的表達(dá)的報(bào)道較為少見，其是否與TNBC 高度侵襲性和不良預(yù)后有關(guān)尚不明確，鑒于此，本研究擬通過檢測(cè)TNBC 患者癌組織、癌旁組織中EVI1、KPNA2 的表達(dá)，分析其與臨床病理特征的關(guān)系，以探討EVI1、KPNA2 在TNBC 惡性進(jìn)展中的作用機(jī)制，為TNBC 的臨床治療和預(yù)后預(yù)測(cè)提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2012年1月—2015年1月中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第983 醫(yī)院收集的73 例TNBC 患者手術(shù)切除的癌組織、癌旁組織（距離癌組織>5 cm）及70 例正常乳腺組織（對(duì)照組）的石蠟標(biāo)本。乳腺癌患者年齡46～63 歲，平均（55.23±7.31）歲；乳腺腫塊直徑0.62～3.56 cm，平均（2.13±0.34）cm；組織學(xué)分級(jí)：Ⅰ級(jí)20 例，Ⅱ級(jí)16 例，Ⅲ級(jí)37 例；淋巴結(jié)：N033 例，N1、N240 例；脈管內(nèi)癌栓44 例；Ki-67低表達(dá)33 例，Ki-67 高表達(dá)40 例。對(duì)照組年齡42～60 歲，平均（54.35±3.15）歲，均為女性。納入標(biāo)準(zhǔn)：①ER、PR、HER2表達(dá)陰性和/或熒光原位雜交HER2/Neu基因無擴(kuò)增，經(jīng)病理組織學(xué)診斷為TNBC；②病理類型均為浸潤性導(dǎo)管癌；③病理資料完整，接受隨訪；④標(biāo)本均來自女性患者，年齡≥18 歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前未進(jìn)行化療、放療、免疫治療；②男性患者；③Luminal 型、Her-2 型、Basal-like 型等其他類型乳腺癌；④有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者。乳腺癌患者和對(duì)照組的年齡和性別比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，審批號(hào)[倫（審）S20121127]。

1.2 免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)EVI1、KPNA2的表達(dá)

標(biāo)本在37℃避光下經(jīng)3.7%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，制作4 μm厚切片，二甲苯中脫蠟，乙醇梯度水化，蒸餾水洗滌。108℃高壓2 min，3%過氧化氫/甲醇溶液室溫下阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性15 min，1%稀釋正常馬血清（購自北京太陽紅科技有限公司）37℃下孵育30 min，阻斷非特異性抗體結(jié)合，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗后加入EVI1 多克隆抗體、KPNA2 兔抗人多克隆抗體（均購自英國Abcam 公司），37℃孵育60 min，4℃冰箱孵育過夜。PBS 沖洗3 次加二抗，37℃孵育17 min，PBS沖洗3 次，鏈霉抗生物素蛋白-過氧化物酶（SP）（購自福建邁新生物技術(shù)開發(fā)公司）顯色3～5 min，37℃孵育30 min，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）（購自福建邁新生物技術(shù)開發(fā)公司）顯色3～5 min。再經(jīng)蘇木精復(fù)染、脫水、透明封固，光學(xué)顯微鏡隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野進(jìn)行觀察，放大倍數(shù)為400 倍。以PBS代替一抗為陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果評(píng)定

在雙盲條件下，該院病理科2 位具有副主任職稱的病理醫(yī)師分別采用半定量法進(jìn)行等級(jí)評(píng)定[6]，胞漿和/或細(xì)胞核中的淡黃色至棕色顆粒被定義為陽性。隨機(jī)從各組選擇3 個(gè)切片，每個(gè)切片隨機(jī)選取5 個(gè)高倍視野觀察，先進(jìn)行染色密度評(píng)分，陰性為0 分，弱陽性為1 分，中度陽性為2 分，強(qiáng)陽性為3 分。再進(jìn)行陽性細(xì)胞百分比評(píng)分，陰性為0 分，<25%為1分，25%～<50%為2分，50%～<75%為3分，≥75%為4 分。染色密度評(píng)分與陽性細(xì)胞百分比評(píng)分的乘積為免疫反應(yīng)評(píng)分（IRS），0 分為陰性（-），1～4 分為弱陽性（+），5～8 分為陽性（++），9～12 分為強(qiáng)陽性（+++）。

1.4 隨訪

患者均定期門診復(fù)查，采用電話或微信隨訪，記錄隨訪期間無進(jìn)展生存時(shí)間（PFS）及總生存時(shí)間（OS）的生存率，PFS 指手術(shù)日起到腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移或隨訪截止時(shí)間，OS 指手術(shù)日起到患者死亡或隨訪截止時(shí)間。復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移指經(jīng)影像及病理證實(shí)的原發(fā)腫瘤局部或遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料以構(gòu)成比或率（%）表示，比較采用χ2檢驗(yàn)，兩兩比較采用χ2分割法（檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.013），Kaplan-Meier法繪制生存曲線，比較用Log-Rank χ2檢驗(yàn)；P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TNBC癌組織中EVI1、KPNA2的陽性表達(dá)

TNBC 癌組織中EVI1、KPNA2 表達(dá)位于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)，陽性為淡黃色至棕色顆粒，見圖1。

圖1 EVI1、KPNA2在TNBC癌組織中的表達(dá) （×400）

2.2 3組EVI1、KPNA2表達(dá)的比較

癌組織、癌旁組織和對(duì)照組EVI1、KPNA2 總的陽性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=30.717和40.855，均P=0.000）；進(jìn)一步兩兩比較，癌組織中EVI1、KPNA2 陽性表達(dá)率高于癌旁組織和對(duì)照組（P<0.013），癌旁組織和對(duì)照組EVI1、KPNA2 陽性表達(dá)率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.013）。見表1。

表1 TNBC癌組織、癌旁組織和對(duì)照組EVI1、KPNA2陽性表達(dá)率的比較 例（%）

2.3 不同臨床病理特征的TNBC 患者的EVI1、KPNA2表達(dá)比較

如表2所示，不同年齡、乳腺腫塊直徑、分化程度的TNBC 患者的EVI1 陽性率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；不同組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)、Ki-67 表達(dá)、脈管內(nèi)癌栓TNBC 患者的EVI1 陽性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其中，組織學(xué)分級(jí)Ⅲ級(jí)的TNBC 患者EVI1 陽性率高于Ⅰ+Ⅱ級(jí)的患者，淋巴結(jié)為N1、N2的TNBC 患者EVI1 陽性率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，Ki-67 高表達(dá)的TNBC 患者EVI1 陽性率高于低表達(dá)者，有脈管內(nèi)癌栓的TNBC 患者EVI1陽性率高于無脈管內(nèi)癌栓患者。不同年齡、乳腺腫塊直徑、分化程度、組織學(xué)分級(jí)、Ki-67 表達(dá)、脈管內(nèi)癌栓的TNBC 患者的KPNA2 陽性表達(dá)率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移的TNBC 患者的KPNA2 陽性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），淋巴結(jié)N1、N2患者的KPNA2 陽性表達(dá)率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者。

表2 不同臨床病理特征的TNBC患者的EVI1、KPNA2陽性率的比較

2.4 不同EVI1、KPNA2 表達(dá)TNBC 患者的生存率比較

所有患者均完成隨訪，隨訪時(shí)間最短60 個(gè)月，最長96 個(gè)月，中位隨訪時(shí)間82 個(gè)月。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，EVI1 陽性表達(dá)者PFS 生存率為35.56%（16/45），低于EVI1陰性表達(dá)者67.86%（19/28）（χ2=6.843，P=0.009），EVI1陽性表達(dá)者OS生存率為77.78%（35/45），低于EVI1陰性表達(dá)者96.43%（27/28）（χ2=4.688，P=0.031）。KPNA2 陽性表達(dá)者PFS 生存率為36.59%（15/41），低于KPNA2陰性表達(dá)者62.50%（20/32）（χ2=4.836，P=0.028），KPNA2陽性表達(dá)者OS生存率為75.61%（31/41），低于KPNA2陰性表達(dá)者的96.88%（31/32）（χ2=5.387，P=0.021）。見圖2、3。

圖2 不同EVI1、KPNA2表達(dá)TNBC患者的PFS生存曲線

圖3 不同EVI1、KPNA2表達(dá)TNBC患者的OS生存曲線

3 討論

乳腺癌是嚴(yán)重威脅女性健康和生命安全的惡性腫瘤，是全世界發(fā)病率最高的女性惡性腫瘤[7]。不同類型乳腺癌臨床和分子生物學(xué)特征不同，治療反應(yīng)性、預(yù)后也不盡相同。TNBC 因異質(zhì)性和缺乏治療靶點(diǎn)，臨床治療效果差，是所有乳腺癌類型中預(yù)后最差的分子分型之一[8-9]，明確分子亞型和靶向抑制是阻止TNBC 惡性進(jìn)展，提高患者生存率的關(guān)鍵和必要條件。探討與TNBC 惡性進(jìn)展相關(guān)的分子機(jī)制有助于完善臨床治療方法，為預(yù)后評(píng)估提供可靠信息。

EVI1 是癌基因轉(zhuǎn)錄因子，位于染色體3q26 上，包含2 個(gè)DNA 結(jié)合鋅指結(jié)構(gòu)域，一個(gè)結(jié)合GATA 樣基序，另一個(gè)結(jié)合v-ets 紅細(xì)胞增多癥病毒E26 癌基因同源性樣基序（E26 transformation-specific sequence,ETs）。EVI1 通過與C 末端結(jié)合域、cAMP 反應(yīng)元件結(jié)合蛋白和p300/CBP 相關(guān)因子等轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子相互作用調(diào)控靶基因表達(dá)[10]。EVI1 可抑制轉(zhuǎn)化生長因子β 信號(hào)并激活Notch 信號(hào)促使造血干細(xì)胞向主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化[11]。EVI1 在髓系白血病、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、幕下室管膜瘤等實(shí)體腫瘤中異常表達(dá)，EVI1 高度表達(dá)與較短生存期、腫瘤藥物耐藥有關(guān)，下調(diào)EVI1 表達(dá)能抑制腫瘤細(xì)胞生長[12-13]。本研究發(fā)現(xiàn)，EVI1 在TNBC 癌組織中陽性表達(dá)率高于癌旁組織和正常乳腺組織，提示EVI1 可能參與TNBC 發(fā)病機(jī)制。文獻(xiàn)[14]指出EVI1 通過調(diào)控乳腺癌干細(xì)胞增殖過程參與乳腺癌細(xì)胞遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等過程，促進(jìn)乳腺癌發(fā)生和惡性進(jìn)展。本研究進(jìn)一步分析不同臨床病理特征的TNBC 患者的EVI1 表達(dá)發(fā)現(xiàn)，不同組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)、Ki-67表達(dá)、脈管內(nèi)癌栓TNBC患者的EVI1陽性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即EVI1 表達(dá)越高，TNBC 組織學(xué)分級(jí)越高，Ki-67表達(dá)越高，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和脈管內(nèi)癌栓的可能性越大，說明EVI1表達(dá)與TNBC惡性程度、侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)，可能與EVI1誘導(dǎo)TNBC癌癥干細(xì)胞過度活化有關(guān)，提示EVI1在TNBC發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮致癌基因作用。Kaplan-Meier 生存曲線分析EVI1 陽性表達(dá)患者PFS生存率、OS生存率均低于EVI1陰性表達(dá)患者，說明EVI1陽性表達(dá)與TNBC不良預(yù)后有關(guān)。一項(xiàng)薈萃分析顯示高EVI1表達(dá)與急性髓系白血病患者較短OS[H^R=1.73，95% CI：（1.43，2.11）]和無事件生存率[H^R=1.17，95% CI：（1.05，1.31）]相關(guān)[15]。本研究結(jié)果提示EVI1可作為TNBC惡性進(jìn)展和不良預(yù)后的輔助診斷指標(biāo)，抑制EVI1表達(dá)可能阻止TNBC惡性進(jìn)展。

KPNA2 位于染色體17q23-q24，由N 端親水性結(jié)構(gòu)域、短C 端和中心區(qū)域組成，中心區(qū)域有2 個(gè)核定位信號(hào)結(jié)合位點(diǎn)，能夠與具有特異性核定位信號(hào)的入核蛋白結(jié)合，對(duì)細(xì)胞功能相關(guān)mRNA 和轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)出細(xì)胞核提供空間定位作用，在細(xì)胞增殖、分化等生理過程中發(fā)揮重要作用[5]。KPNA2 還通過參與細(xì)胞分化、增殖、凋亡、免疫應(yīng)答和病毒感染等促進(jìn)腫瘤的形成和發(fā)展，在肝癌、胰腺癌、大腸癌等腫瘤中高度表達(dá)，與癌細(xì)胞增殖、遷移和不良預(yù)后有關(guān)[4，16-17]。KPNA2 作為miR-26a/b新靶點(diǎn)，通過雌激素/c-Myc/miR-26b 軸介導(dǎo)的雌激素刺激細(xì)胞生長而控制雌激素水平，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖[18]。KPNA2 在TNBC 的表達(dá)和作用機(jī)制尚不十分清楚，本研究發(fā)現(xiàn)KPNA2 在TNBC 癌組織中呈高度表達(dá)，陽性表達(dá)率達(dá)56.16%，高于癌旁組織和正常乳腺組織；淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移的TNBC 患者的KPNA2 陽性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與KPNA2 對(duì)關(guān)鍵核蛋白的異常定位導(dǎo)致癌細(xì)胞侵襲、增殖和轉(zhuǎn)移有關(guān)。ALSHAREEDA[19]檢測(cè)1 494例乳腺癌患者KPNA2 表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)KPNA2 在ER陰性和三陰性表型乳腺癌患者中表達(dá)明顯升高，認(rèn)為高KPNA2 表達(dá)與細(xì)胞質(zhì)定位功能、核蛋白低表達(dá)有關(guān)。近期報(bào)道顯示KPNA2 過度表達(dá)提高乳腺癌MCF-7 細(xì)胞侵襲和遷移能力，KpNa2 缺失可下調(diào)LoxL2、BMP6、ITGA6 等腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表達(dá)，抑制腫瘤進(jìn)展，KPNA2 在乳腺癌轉(zhuǎn)移中具有重要作用[20]。本研究通過Kaplan-Meier 生存曲線分析發(fā)現(xiàn)KPNA2 陽性表達(dá)與TNBC 患者低PFS 生存率、低OS 生存率有關(guān)，ALSHAREEDA[19]在對(duì)乳腺癌患者長期隨訪中發(fā)現(xiàn)，KPNA2 高表達(dá)乳腺癌患者無病生存率偏低，AL-KAABI 等[21]指出KPNA2 高表達(dá)與接受環(huán)磷酰胺、甲氨蝶呤和氟尿嘧啶化療的ER 陰性和TNBC 患者較短生存期有關(guān)。

綜上所述，TNBC 患者EVI1、KPNA2 均呈高表達(dá)，其陽性表達(dá)與TNBC 患者惡性侵襲行為和不良預(yù)后有關(guān)，可以作為TNBC 患者病情評(píng)估和預(yù)后預(yù)測(cè)的輔助指標(biāo)。鑒于EVI1、KPNA2 在TNBC 疾病進(jìn)展中的作用，抑制EVI1、KPNA2 表達(dá)可能成為臨床治療TNBC 新的靶點(diǎn)和方向。