張冠怡，姚冬婷，王 健，胡曉波

（1.上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院，上海 200032；2.上海市臨床檢驗中心，上海 200126）

一項侵襲性真菌感染調查結果顯示，光滑念珠菌已成為致病率最高的非白念珠菌，常在免疫力低下和腸外營養(yǎng)支持器官移植的患者中檢出[1]。我國臨床感染疾病調查發(fā)現(xiàn)，光滑念珠菌感染居非白念珠菌感染的第3位，且對氟康唑和伏立康唑具有交叉抗性[2]。隨著抗菌藥物的廣泛和長期使用，非白念珠菌對單一藥物的耐藥率和交叉耐藥率逐年增高，曾經(jīng)使用過抗菌藥物和免疫抑制劑的患者對抗真菌藥物更容易產(chǎn)生耐藥。

目前，光滑念珠菌感染的治療藥物主要包括唑類、多烯類（主要是兩性霉素B）、氟胞嘧啶和棘白霉素類（米卡芬凈、卡泊芬凈等）。唑類藥物具有價格低、耐受性好、便于使用等優(yōu)點，是臨床常用的抗真菌藥物，但在單獨使用時，光滑念珠菌常表現(xiàn)為對唑類藥物耐藥[3]，尤其對氟康唑的耐藥性最為普遍[4]。光滑念珠菌對唑類藥物的交叉耐藥也很普遍，特別是氟康唑和伏立康唑聯(lián)合用藥[2]。唑類藥物聯(lián)合他汀類藥物對光滑念珠菌具有抑制作用。但有研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物可以抑制3-羥基-3-甲基戊二酰-輔酶A，但具有肝毒性，不宜與唑類藥物聯(lián)合使用[5]。棘白霉素類藥物對耐唑類藥物菌株具有良好的抑菌效果，光滑念珠菌對棘白霉素類抗菌藥物的耐藥率<1%[6]，常用于治療危重患者，但因成本較高，在臨床治療中的應用相對較少。兩性霉素B和氟胞嘧啶聯(lián)合用藥對光滑念珠菌的治療具有協(xié)同作用，但兩性霉素B對腎功能具有一定的損傷，不建議使用[3]。為解決耐藥問題，臨床聯(lián)合運用中西藥治療光滑念珠菌，為光滑念珠菌感染的臨床治療提供了新的途徑。本文對光滑念珠菌的耐藥機制及中西藥治療光滑念珠菌感染的研究進展進行綜述，以期為臨床治療光滑念珠菌感染提供參考。

1 光滑念珠菌耐藥機制

1.1 藥物外排作用

藥物外排作用是光滑念珠菌耐藥機制之一。已進入細胞內(nèi)的藥物通過外排泵被排出細胞外，使細胞內(nèi)的藥物濃度降低，不能對光滑念珠菌生長起到抑制作用。外排泵相關蛋白主要是ABC轉運蛋白，相關基因包括CYP51A、CYP51B、CDR1、CDR2、MDR1、MDR2、Yapl、shol等。PDR亞家族成員作為半轉運蛋白，是編碼ABC轉運蛋白的主要蛋白，在光滑念珠菌中普遍存在，包括CgCDR1、CgCDR2、CgSNQ2、CgAUS1等7個亞成員[7]。外排基因過表達使得蛋白轉運功能增強，從而使藥物被轉運到細胞外。黃金梅等[8]發(fā)現(xiàn)，大部分的光滑念珠菌為劑量依賴型，將其誘導為耐藥菌株后，藥物外排相關基因（CDR1、CDR2、MDR1、MDR2、Yap1、Shol等）在耐藥株中的表達明顯高于野生株。張朋等[9]運用聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測到氟康唑和他克莫司聯(lián)合使用時，CDR1的表達大大增加，通過熒光定量PCR檢測到二乙?；鶡晒馑赝馀派叩姆茸畹?，具有協(xié)同作用，抑制了氟康唑單獨使用時菌株的耐藥性。劉錦燕等[10]經(jīng)過30輪體外誘導，使敏感菌株成為耐藥菌株，采用逆轉錄PCR檢測到耐藥菌株CDR1、CDR2、PDR1基因表達明顯高于敏感菌株，PDR1基因中W297S、F575L、P822L、P927L的氨基酸置換導致了CDR1、CDR2、PDR1基因表達的增加。SHAHROKHI等[11]運用RT-PCR在大部分劑量依賴型光滑念珠菌中檢測到由CDR1和CDR2基因編碼的質膜蛋白cdr1p、cdr2p，這些蛋白是氟康唑抗性的重要因子，進一步證明了CDR1和CDR2基因的表達水平對氟康唑耐藥的影響。

線粒體基因組的狀態(tài)喪失、唑類藥物的攻擊和轉錄調節(jié)子（RPN4和HAP1）的調控，都可以影響PDR1蛋白的表達[12]。GOHAR等[13]發(fā)現(xiàn)耐藥光滑念珠菌PDR1基因中含有6個功能獲得性突變（有6個氨基酸被取代），其中W279R和T588A氨基酸代替與CDR1和CDR2過表達有關；他們還發(fā)現(xiàn)了3個新的氨基酸突變，其中P915R與SNQ2過表達有關。但CDR1、CDR2和SNQ2不會同時表達，且SNQ2表達的變異最高。CgPDR1蛋白表達會改變外排泵功能，CgPDR16基因的缺失會使光滑念珠菌產(chǎn)生應激反應。CgPDR16基因缺失菌株中PDR1、CDR1、CDR2基因表達降低，從而使菌株多藥耐藥性減弱，并增強了對唑類藥物的敏感性，即使刪除所有與外排泵相關的基因，PDR16基因的缺失還是會使菌株對唑類藥物的敏感性增強[14]，使CgPDR16p成為降低菌株多藥耐藥最有希望的靶標，而且可由氟康唑誘導表達，反映了光滑念珠菌基因的可塑性。

1.2 生物膜的形成

光滑念珠菌生物膜的形成是其致病和耐藥的主要因素。生物膜表面的黏附性使菌株可定植于生物表面或導管等物品表面，形成菌膜，導致機體感染。唑類藥物可誘導生物膜相關基因表達，生物膜相關基因過表達和突變可使生物膜的黏附性或疏水性增強，從而增加感染的概率[15]。生物膜形成的單層致密結構，包括蛋白質、麥角甾醇等結構，阻礙了唑類藥物進入細胞基質，從而導致耐藥[16]。

麥角甾醇是真菌生物膜的主要成分，ERG11編碼的14α-去甲基酶（細胞色素p450酶）是麥角甾醇合成的關鍵酶，唑類藥物通過抑制ERG11基因來影響麥角甾醇的合成。UPC2是ERG11的轉錄調節(jié)因子，受ERG11基因的調控，包括UPC2a和UPC2p[17]。有學者[18]發(fā)現(xiàn)Upc2a作為啟動子，既可與PDR1、CDR1結合，又可轉錄調節(jié)與ERG11結合，耐唑類藥物的光滑念珠菌存在Upc2a的缺失，PDR1表達下調，從而導致菌株耐藥。江岑等[19]發(fā)現(xiàn)耐藥念珠菌中ERG11過表達是由轉錄調控因子Upc2p的獲得性功能突變引起的；WHALEY等[17]發(fā)現(xiàn)Upc2A可以調節(jié)Erg11的甾醇生物合成途徑酶的表達，影響ERG11基因的表達，從而產(chǎn)生耐藥。

ERG3基因（C-5甾醇去飽和酶）編碼參與麥角甾醇生物合成的蛋白，基因中特別的突變點可以改變唑類藥物的抗真菌有效性[20]。有學者[21]從糖尿病患者、腎移植患者和對照者中分離出光滑念珠菌，通過ERG3基因的點突變可以阻礙唑類藥物的藥效，ERG3基因突變屬于功能喪失性突變，包括純合子（A138T、P181A）和雜合子（P267S），而且純合子突變比雜合子突變會使最小抑菌濃度值增高更加明顯。

甘露聚糖和β-葡聚糖是光滑念珠菌細胞壁的主要成分，存在于生物膜外的基質中，細胞外基質（甘露聚糖和葡聚糖復合物）對抗真菌藥物具有隔離作用，可以增強光滑念珠菌耐藥性。DOMINGUEZ等[22]檢測了氟康唑對10株菌株的抑菌情況，發(fā)現(xiàn)氟康唑抑菌率均未達到50%，通過追蹤放射性標記，發(fā)現(xiàn)氟康唑大部分停留在細胞外基質中；使用甘露聚糖酶和葡聚糖酶裂解細胞，再用氟康唑檢測菌株敏感性，發(fā)現(xiàn)生物膜負荷顯著下降，且使用甘露聚糖比使用葡聚糖效果更加明顯，證明了甘露聚糖和β-葡聚糖對真菌耐藥性的影響。

FKS基因與β-葡聚糖合成有關，F(xiàn)KS基因突變會調節(jié)葡聚糖的合成，使得細胞膜穩(wěn)定性增強；FKS基因的過表達可使生物膜的黏附性增強，從而產(chǎn)生耐藥。耐藥光滑念珠菌中存在FKS基因的改變，光滑念珠菌FKS基因包括FKS1和FKS2。有研究采用新的測序方法發(fā)現(xiàn)多重耐藥光滑念珠菌FKS1、FKS2和GSC1熱點區(qū)域存在54個錯義突變，包括K1323E和F625S突變點[23]。BOURGEOIS等[24]發(fā)現(xiàn)FKS2基因突變與光滑念珠菌的耐藥有關，且不同突變位點導致的耐藥水平不同

1.3 其他耐藥機制

學者們對光滑念珠菌耐藥機制的研究還涉及呼吸缺陷、宿主免疫反應等方面。有研究通過觀察線粒體的膜電位發(fā)現(xiàn)耐藥光滑念珠菌存在線粒體呼吸缺陷，加入呼吸抑制劑NaN3可以抑制經(jīng)典呼吸復合物Ⅳ，使敏感菌株的平均熒光強度略強于耐藥菌株，證明了耐藥菌株存在呼吸缺陷[19]。

免疫逃逸是真菌耐藥的另一個途徑，可使真菌逃避藥物治療的宿主免疫應答反應。光滑念珠菌侵入人體時可以激發(fā)身體的固有免疫和適應性免疫途徑，先天免疫識別可以使抗原呈遞細胞具有觸發(fā)T細胞分化的能力，從而驅動輔助性T細胞依賴的適應性免疫應答。宿主先天免疫細胞在遇到病原體時可以分泌幾種細胞因子，從而導致輔助性T細胞分化。炎癥細胞因子包括腫瘤細胞因子α、白細胞介素6、白細胞介素1b和白細胞介素12p40等。Dectin-1和Dectin-2為C型凝集素受體，介導輔助性T細胞1和輔助性T細胞17的適應性免疫應答途徑。有研究采用免疫印跡法對缺乏Dectin-1和Dectin-2，且腹膜感染光滑念珠菌的雌鼠的巨噬細胞和中性粒細胞蛋白進行提取、測定和分析，發(fā)現(xiàn)Dectin-1使宿主對光滑念珠菌入侵具有更高的敏感性；且Dectin-1缺陷型中性粒細胞的殺傷能力明顯受損，而Dectin-2缺陷型中性粒細胞的殺傷能力與野生型中性粒細胞相似[25]。提示Dectin-1是檢測光滑念珠菌感染的宿主巨噬細胞所必需的，而Dectin-2對感染光滑念珠菌的影響屬于劑量依賴型。

2 中藥在光滑念珠菌感染治療中的應用

中藥與唑類藥物相比，具有不良反應少、耐藥性弱及預后良好的優(yōu)點，在臨床抗真菌治療中多與唑類藥物聯(lián)合使用。中西藥聯(lián)用對耐藥念珠菌感染提供了有效的治療途徑。中藥對治療真菌深部感染具有顯著的效果，常被用于治療呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、血液系統(tǒng)等[26]的真菌感染。

有研究結果表明，牡丹皮、地骨皮、胡黃連、番瀉葉、白頭翁、大蒜、輕粉和細辛等中藥材可對真菌感染起到不同程度的抑制作用；牡丹皮、地骨皮、胡黃連和白頭翁具有不同程度的清熱、祛濕的功效，大蒜和輕粉具有解毒、殺蟲的功效，細辛具有解表散寒、祛風止痛的功效；中醫(yī)臨床治療中，上述中藥常被用于治療有濕熱下注、痰熱壅肺等證型的念珠菌病，可達到辨證治療和抑菌的效果[27]。

在臨床治療中，中藥或中藥中的單體成分均對光滑念珠菌具有抑菌作用。龔倩玉等[28]發(fā)現(xiàn)，杜仲中提取的異色酮對光滑念珠菌具有中等抑菌作用。有學者[5]通過動力學抑制反應發(fā)現(xiàn)，從中藥材中提取的α-細辛醚衍生物對CgHMGR合成的抑制作用最為顯著，α-細辛醚衍生物的硝基、甲氧基和乙酸酯部分與酶活性區(qū)域的殘基相互作用，是潛在的藥效團；他們通過測試毛狀線蟲的生長狀況，發(fā)現(xiàn)α-細辛醚衍生物參與了麥角甾醇的合成，主要是通過抑制麥角甾醇的合成發(fā)揮其抑菌作用；體外藥物敏感性試驗結果也證明了對氟康唑耐藥的光滑念珠菌對α-細辛醚衍生物同樣具有敏感性。張夢翔等[29]通過觀察姜黃素對光滑念珠菌菌絲和生物膜形成的影響，發(fā)現(xiàn)姜黃素可抑制光滑念珠菌的生長，從而發(fā)揮抑菌作用。汪天明等[30]通過觀察黃連解毒湯的乙酸乙酯提取物對光滑念珠菌黏附的影響，發(fā)現(xiàn)黃連解毒湯乙酸乙酯提取物可下調黏附相關基因的表達，從而影響光滑念珠菌的黏附作用，進而達到抑菌效果。

中藥治療念珠菌感染的效果顯著，且中藥種類繁多，主要以清熱燥濕、殺蟲止癢為主，佐以補虛中藥，在辨證論治的同時可以達到抑菌的效果。

3 中藥聯(lián)合唑類藥物對光滑念珠菌的抑菌作用

中藥聯(lián)合唑類藥物治療念珠菌感染效果更好，且安全性更高，為解決念珠菌耐藥問題提供了新的途徑。譚妙群等[31]通過對陰道念珠菌反復感染患者的臨床觀察發(fā)現(xiàn)，伊曲康唑和苦參湯外洗聯(lián)合使用比單獨使用伊曲康唑的治療有效率更高，恢復時間更短，不良反應發(fā)生率更低，并可減少疾病復發(fā)。王福君[32]、劉寧[33]和林喜娟[34]使用含有苦參等成分的中藥洗劑聯(lián)合唑類藥物治療陰道念珠菌感染，也得到相同的治療效果。楊坤等[35]通過對老年口腔念珠菌病患者的臨床觀察發(fā)現(xiàn)，氟康唑聯(lián)合黃芩等清熱燥濕的中藥，比單獨使用氟康唑的治療效果更好，且治療過程中不適反應較少，老年人更易接受。

有研究發(fā)現(xiàn)，八角茴香油、丁香揮發(fā)油、大蒜素、黃芩苷、小檗堿、類黃酮等中藥單體與氟康唑聯(lián)合使用對光滑念珠菌的抑制作用顯著[36]。王維欣等[37-38]發(fā)現(xiàn)黃連素和沒食子酸對光滑念珠菌的抑菌效果也很顯著，黃連素單獨使用抑菌效果最明顯，與氟康唑聯(lián)用表現(xiàn)為無關作用；而沒食子酸與氟康唑聯(lián)用具有協(xié)同作用，且沒食子酸濃度越高，兩藥的協(xié)同效果越顯著；他們通過繪制時間-殺菌曲線發(fā)現(xiàn)，沒食子酸單獨用藥不能起到抑菌作用，氟康唑單獨用藥可以抑菌，但效果弱于聯(lián)合用藥，證實了沒食子酸和氟康唑聯(lián)用具有協(xié)同效果；他們在不同時間段通過測定492 mm波長下不同菌株的吸光度值以判斷菌株的黏附性，發(fā)現(xiàn)100 mg/mL沒食子酸和氟康唑聯(lián)用，可在2 h內(nèi)對光滑念珠菌的早期黏附性起顯著抑制作用，提示沒食子酸抑菌的主要機制是抑制生物膜形成的早期黏附性。吳盤紅[39]發(fā)現(xiàn)黃連煎劑聯(lián)合唑類藥物對光滑念珠菌具有一定的抑菌作用，聯(lián)合用藥的FICI<1，黃連素與唑類藥物聯(lián)合使用對抑制光滑念珠菌感染具有協(xié)同作用。

中藥單體與唑類藥物聯(lián)合使用對抑制光滑念珠菌感染具有一定的協(xié)同和加強作用，中西藥聯(lián)用可降低光滑念珠菌獲得性耐藥，使免疫功能低下的患者更耐受，且副作用小，為臨床治療提供了有效的途徑。

4 總結

唑類藥物是目前臨床治療真菌感染的主要藥物，光滑念珠菌對氟康唑的耐藥率最高，主要機制是光滑念珠菌對藥物的外排作用。氟康唑可誘導外排泵基因的表達，主要由ABC轉運蛋白及相關基因調節(jié)。功能性突變是導致光滑念珠菌對唑類藥物耐藥的主要機制，但也不能排除非功能性突變的影響。UPC2、ERG3等新的耐藥基因的發(fā)現(xiàn)可幫助學者們深入研究生物膜對耐藥機制的影響。臨床抗真菌治療中，中藥具有副作用和耐藥率低的優(yōu)點，與唑類藥物聯(lián)用可以減少耐藥，加強抑菌作用，具有較好的輔助作用。中西藥聯(lián)用治療念珠菌感染為臨床解決耐藥問題提供了新的途徑。