唐 鈞，曹紅梅

（上海市金山區(qū)亭林醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 201505）

H1N1是甲型流感病毒的一種亞型，為RNA病毒，屬正黏液病毒科，其“H”指的是血球凝集素（hemagglutinin，H），而“N”指的是神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase，N），2種都是糖蛋白，分布在病毒表面[1]。甲型H1N1流感病毒的宿主主要是犬科動(dòng)物、鳥類和一些哺乳動(dòng)物[2]。2009年3月，墨西哥首次發(fā)現(xiàn)了人感染甲型H1N1流感病毒的病例[3]，然后傳播到全球。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，甲型H1N1流感病毒是一種變異后的新型甲型流感病毒，其基因組內(nèi)存在四源重配，是由人流感、豬流感和禽流感病毒基因混合而成的，該病毒的PBl基因源自人流感H3N2病毒，HA、NA、NP、NS和M基因源自豬流感H1N1病毒，PB2和PA基因源自禽流感H1N1病毒[4-5]。甲型H1N1流感病毒可通過直接或間接接觸、呼吸道等途徑在人群中傳播，臨床癥狀與普通流行性感冒十分相似，僅憑癥狀無法確診，且該病發(fā)展迅速，若不能及時(shí)治療，會(huì)出現(xiàn)肺炎、呼吸衰竭、多器官功能損傷等并發(fā)癥，死亡率極高[6-7]。以往主要通過血清診斷法、特異性抗體檢測(cè)法、細(xì)胞培養(yǎng)或雞胚培養(yǎng)分離病毒檢測(cè)甲型H1N1流感病毒感染，但這些方法較復(fù)雜且耗時(shí)較長(zhǎng)，疫情暴發(fā)初期無法獲得毒株抗體，因此無法滿足臨床診斷需求[8]。所以，建立簡(jiǎn)便、快捷的病毒檢測(cè)方法十分重要。本研究通過對(duì)甲型H1N1流感病毒HA基因和NA基因序列進(jìn)行分析，設(shè)計(jì)引物和TaqMan探針，建立檢測(cè)甲型H1N1流感病毒遺傳物質(zhì)的實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescence quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）方法，以期為防控甲型H1N1流感提供幫助。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器

甲型H1N1流感病毒、H1～H16流感病毒、季節(jié)性流感病毒、豬流感病毒由生工生物工程（上海）股份有限公司惠贈(zèng)，TRIzol試劑購自生工生物工程（上海）股份有限公司，甲型H1N1流感病毒（2009）RNA檢測(cè)試劑盒購自中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司，RNeasy Mini Kit核酸提取盒購自廣州健侖生物科技有限公司，One Step PrimeScript RT-PCR試劑盒和酶、dNTP等試劑購自上海酷樂生物科技有限公司。ABI 7500全自動(dòng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購自美國(guó)ABI公司，T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒購自上海澤葉生物科技有限公司，不同稀釋度的甲型H1N1流感病毒、季節(jié)性流感病毒、禽流感病毒等流感病毒盲樣由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心（Chinese Center for Disease Control and Prevention，CDC）提供。

1.2 檢測(cè)方法建立

1.2.1 引物和探針的合成 采用DNASTAR生物軟件進(jìn)行同源性分析，比較我國(guó)分離的甲型H1N1流感病毒HA基因和NA基因的核苷酸序列和GenBank數(shù)據(jù)庫中存在的核苷酸序列（HA，GenBank：MT186158.1；NA，GenBank：MT138529.1），選擇高度保守且特異的核苷酸區(qū)域設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物和TaqMan探針，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，探針由大連寶生物工程有限公司合成。HA基因上游引物為5'-CCCTCTACCAGAATAATCATAC-3′，下游引物為5'-ATGAATTATTACTGGACAC-3'，探針為5'-（HEX）AGTCAGAGAACAAGCAGGCAGA（ECLIPS）-3'。NA基因上游引物為5'-CCCATATCGAACATTGATG-3'，下游引物為5'-TACAATGGCATAATAACAGAC-3'，探針為5'-（HEX）CTGTCCTATTGGTGAGGTTCCTTCT（ECLIPS）-3'。利用BLAST軟件分析探針序列的特異性。

1.2.2 病毒RNA的提取 采用TRIzol試劑提取季節(jié)性流感病毒、豬流感病毒RNA，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。?yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。將提取到的RNA作為RT-PCR模板，用于逆轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)。

1.2.3 反應(yīng)體系的建立 反應(yīng)體系為25 μL，常規(guī)配置，包括RNA 2.0 μL，One Step RT-PCR 緩沖液12.5 μL（1×），Ex Taq HS 0.5 μL（1×），酶混合液0.5 μL（1×），PrimeScript RT enzyme MixⅡ 2 μL（1×），上游引物（10 μmol/L）1 μL，下游引物（10 μmol/L）1 μL，TaqMan探針0.5 μL（10 μmol/L），RNase Free dH2O 5 μL。反應(yīng)條件：50 ℃ 15 min；95 ℃ 15 s；95 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，共40個(gè)循環(huán)，退火結(jié)束后讀取5-六氯熒光素氨基磷酸酯（5-hexachlorofluorescein phosphoramidite，HEX）實(shí)時(shí)熒光信號(hào)。根據(jù)收集的實(shí)時(shí)熒光曲線和擴(kuò)增循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct）判定結(jié)果。

1.2.4 RNA標(biāo)準(zhǔn)品制備 采用TRIzol試劑提取甲型H1N1流感病毒RNA，用HA探針及引物擴(kuò)增后，用帶T7啟動(dòng)子的引物進(jìn)行二次擴(kuò)增，用酚-氯仿溶液（V∶V=25∶24）純化。純化產(chǎn)物在體外按T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，采用SPT53-ZF7-B紫外分析儀（南京威美特科學(xué)儀器有限公司）測(cè)定濃度后分裝，于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 反應(yīng)體系優(yōu)化 對(duì)反應(yīng)體系中的不同引物與探針濃度組合、反應(yīng)體積、擴(kuò)增反應(yīng)參數(shù)等條件進(jìn)行優(yōu)化，以達(dá)到最優(yōu)組合。利用優(yōu)化后的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件建立實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法，然后檢測(cè)甲型H1N1流感病毒、H1～H16流感病毒、季節(jié)性流感病毒、豬流感病毒的RNA。

1.2.6 敏感性試驗(yàn)及定量分析 用焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）水將RNA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍倍比稀釋，利用建立的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法對(duì)不同濃度的RNA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行敏感性試驗(yàn)，RNA標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次為107、106、105、104、103拷貝/μL，同時(shí)采用通過標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)樣本進(jìn)行定量分析。

1.3 重復(fù)性試驗(yàn)

以DEPC水為陰性對(duì)照，對(duì)106拷貝/μL RNA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)，批間檢測(cè)重復(fù)3次，批內(nèi)檢測(cè)重復(fù)5次，根據(jù)Ct值結(jié)果計(jì)算批間、批內(nèi)變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）。

1.4 樣本檢測(cè)

收集2019年5月—2020年10月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院傳染病科流行性感冒患者的鼻咽拭子樣本21份。采用柱提法提取RNA，取2 μL RNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)，同時(shí)采用雞胚培養(yǎng)法分離甲型 H1N1流感病毒。比較2種方法的符合率。

2 結(jié)果

2.1 特異性試驗(yàn)

同源性分析結(jié)果顯示，設(shè)計(jì)的HA探針序列與甲型H1N1流感病毒H1基因序列的同源性達(dá)100%。

采用基于HA和NA探針及引物建立的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法對(duì)構(gòu)建的陽性質(zhì)粒和甲型H1N1流感病毒、H1～H16流感病毒、季節(jié)性流感病毒、豬流感病毒的RNA進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，HA探針的特異性好，甲型H1N1流感病毒核酸檢測(cè)結(jié)果為陽性時(shí)，其他病毒檢測(cè)結(jié)果均為陰性；NA探針對(duì)季節(jié)性流感病毒、豬流感病毒的檢測(cè)結(jié)果為弱陽性，因此選用HA探針進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見圖1。

圖1 基于HA和NA探針及引物的擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線

2.2 敏感性試驗(yàn)

實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)RNA標(biāo)準(zhǔn)品的敏感性為103拷貝/μL RNA分子，標(biāo)準(zhǔn)曲線r2=0.998。見圖 2。

圖2 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)RNA標(biāo)準(zhǔn)品的敏感性試驗(yàn)結(jié)果及標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 重復(fù)性試驗(yàn)

陽性RNA標(biāo)準(zhǔn)品Ct值的批內(nèi)、批間CV均<10%，陰性標(biāo)準(zhǔn)品（DEPC水）重復(fù)檢測(cè)的Ct值均<0，重復(fù)性良好。見圖3。

圖3 RNA陽性標(biāo)準(zhǔn)品及陰性標(biāo)準(zhǔn)品批內(nèi)重復(fù)檢測(cè)的擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線

2.4 樣本檢測(cè)結(jié)果

21份鼻咽拭子樣本中有2份檢測(cè)結(jié)果為陽性，Ct值分別為20.41、24.93；其他樣本均為陰性，與雞胚培養(yǎng)法的符合率為100%。

3 討論

甲型H1N1流感是一種由甲型H1N1流感病毒引起的急性呼吸道傳染病，可通過飛沫傳染、接觸傳染在人群中傳播[9]。2009年3月，甲型H1N1流感病毒在墨西哥被發(fā)現(xiàn)后，世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）把全球甲型H1N1流感大流行警告級(jí)別提高至5級(jí)；同時(shí)，我國(guó)也將其納入《中華人民共和國(guó)傳染病防治法》[10]規(guī)定的乙類傳染病和《中華人民共和國(guó)國(guó)境衛(wèi)生檢疫法》[11]規(guī)定的檢疫傳染病管理，并對(duì)其采取甲類傳染病的預(yù)防、控制措施。2009年6月11日，WHO將全球甲型H1N1流感大流行警告級(jí)別提高至6級(jí)，即警戒級(jí)別的最高級(jí)狀態(tài)[12]。2010年8月10日，WHO宣布甲型H1N1流感大流行已經(jīng)結(jié)束，甲型H1N1流感病毒的傳播基本接近尾聲，正步入后流感大流行階段；但該階段并不意味著甲型H1N1流感病毒已徹底消失；甲型H1N1流感病毒在未來幾年內(nèi)會(huì)繼續(xù)存在，由于此時(shí)該病毒的動(dòng)向具有非常高的不可預(yù)測(cè)性，因此仍需對(duì)其保持警惕[13]。臨床上通常使用病毒培養(yǎng)法對(duì)流感病毒感染進(jìn)行診斷，雖然有較高的診斷準(zhǔn)確率，但受實(shí)驗(yàn)室條件和人員條件的限制，且耗時(shí)久，無法滿足疫情暴發(fā)時(shí)的診斷需求[14]。因此，對(duì)病毒核酸進(jìn)行檢測(cè)，有助于疾病的早期診斷。

實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR能用少量的RNA識(shí)別出在某個(gè)特定時(shí)間細(xì)胞組織內(nèi)的特定基因，特異性、敏感性、自動(dòng)化程度均較高，操作簡(jiǎn)單、快捷，防污染效果較好，是檢測(cè)甲型H1N1流感病毒RNA的有效方法[12，15-16]。

本研究根據(jù)甲型H1N1流感病毒HA基因和NA基因的核苷酸序列和GenBank數(shù)據(jù)庫中的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物和TaqMan探針，結(jié)果顯示，HA探針僅與甲型 H1N1流感病毒RNA反應(yīng)，與H1～H16流感病毒、季節(jié)性流感病毒、豬流感病毒的RNA無交叉反應(yīng)，特異性好；而NA探針與季節(jié)性流感病毒、豬流感病毒呈弱陽性反應(yīng)，特異性較差；因此，本研究采用HA基因的引物和探針建立反應(yīng)體系并進(jìn)一步優(yōu)化，根據(jù)優(yōu)化后的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件建立檢測(cè)甲型H1N1流感病毒的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法。該方法的敏感性為103拷貝/μL RNA分子，陽性RNA標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值批內(nèi)、批間CV均<10%，陰性標(biāo)準(zhǔn)品（DEPC水）重復(fù)檢測(cè)的Ct值均<0，重復(fù)性良好，與雞胚培養(yǎng)法的符合率為100%。

綜上所述，本研究建立了檢測(cè)甲型H1N1流感病毒RNA的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法。該方法操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)較短、特異性較強(qiáng)、敏感性較高，可用于臨床檢測(cè)。