邱 潔,孫 虎,謝 爽,張彩彩,陳 磊

(海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 麻醉科，海南 ?？?，570311)

丙泊酚是常用麻醉藥之一，但會(huì)引起一些不良反應(yīng)[1]。麻醉劑與患者手術(shù)后認(rèn)知障礙(POCD)密切相關(guān)。研究[2-3]表明，丙泊酚可通過磷酸化海馬區(qū)Tau蛋白誘導(dǎo)POCD的發(fā)生。目前，丙泊酚導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙的機(jī)制尚不清楚，有學(xué)者[4]認(rèn)為海馬神經(jīng)元γ-氨基丁酸A(GABA)受體與認(rèn)知功能關(guān)系密切。本研究觀察丙泊酚麻醉對(duì)老齡大鼠認(rèn)知功能和海馬GABA受體的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取50只清潔級(jí)Wista大鼠，鼠齡20～22月齡，體質(zhì)量360～420 g,雌雄不限，由長沙市天勤生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)提供，許可證號(hào)為SCXK(湘)2014-0011,使用許可證號(hào)為SYXK(湘)2014-006。動(dòng)物處理及實(shí)驗(yàn)過程得到海南醫(yī)學(xué)院動(dòng)物關(guān)懷及使用委員會(huì)的許可(IACUC0023)。實(shí)驗(yàn)研究過程中嚴(yán)格遵守3R原則。

1.2 主要儀器及試劑

呼吸麻醉機(jī)(武漢醫(yī)用儀表有限公司)，呼吸監(jiān)護(hù)儀(Datex Engstorm儀器公司，芬蘭)。商用體溫傳感器(Philips公司，德國)，嚙齒動(dòng)物脈搏血氧計(jì)和心率監(jiān)測(cè)儀(Datex Engstorm儀器公司，芬蘭)。

RPMI-1640培養(yǎng)液、胰蛋白酶(Gibco公司，美國)，兔抗鼠GABA單克隆抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的第二抗體(Sigma公司，美國);丙泊酚(批號(hào)090822,河北九派制藥有限公司);酶標(biāo)儀SpectraMax M5P[上海美谷分子儀器(上海)有限公司]，倒置相差顯微鏡(上海蒼茂實(shí)業(yè)有限公司)，低溫高速離心機(jī)(長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司),SDS-PAGE凝膠電泳及轉(zhuǎn)移裝置(上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司),LAS400凝膠成像系統(tǒng)(GE公司，美國)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組及處理:所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在動(dòng)物房進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。50只大鼠隨機(jī)分為丙泊酚組與對(duì)照組，每組25只。丙泊酚組大鼠腹腔注射1%丙泊酚中/長鏈脂肪乳注射液6 mL/kg,對(duì)照組腹腔注射等體積的生理鹽水。所有注射藥物密封信封內(nèi)，操作人員隨機(jī)分配。將大鼠放入麻醉箱，置于37 ℃環(huán)境中連接麻醉機(jī)，以混有30%氧氣的空氧混合氣體作為載體氣體，通氣流速(mL/min)=0.65×體質(zhì)量(g)。

1.3.2 生命體征記錄:記錄每只大鼠直腸溫度、心率、呼吸頻率和血氧飽和度(SpO2)。采用商用體溫傳感器測(cè)定大鼠直腸溫度。使用嚙齒動(dòng)物脈搏血氧計(jì)和心率監(jiān)測(cè)儀評(píng)估心率和SpO2。通過計(jì)數(shù)大鼠的胸部運(yùn)動(dòng)的次數(shù)來記錄呼吸速率。麻醉開始后，大鼠被放置在恒溫毯上以保持各項(xiàng)參數(shù)的穩(wěn)定。

1.3.3 認(rèn)知功能檢測(cè):實(shí)驗(yàn)完畢后選取15只大鼠，清醒后繼續(xù)飼養(yǎng)48 h,實(shí)施Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。迷宮按照順時(shí)針分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ部分。水池和平臺(tái)黑色，平臺(tái)放置于第Ⅱ部分。池水染成黑色，溫度保持在26 ℃,開啟設(shè)備。軟件自動(dòng)記錄大鼠活動(dòng)行跡，逃逸潛伏期定義為下水至找到平臺(tái)的時(shí)間，游泳路程定義為總里程，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行5 d。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后的第2天移除平臺(tái)，大鼠從Ⅰ部分下水，記錄大鼠120 s內(nèi)穿越平臺(tái)區(qū)域次數(shù)和時(shí)間。

1.3.4 蘇木精-伊紅染色(HE)及尼式染色:實(shí)驗(yàn)完畢后，解剖出腦海馬組織，制備石蠟切片(10 μm),脫蠟、脫水，尼氏染色液染色，蒸餾水洗滌，脫水。光學(xué)顯微鏡下觀察神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)及尼氏體。

1.3.5 Western Blot檢測(cè)GABA蛋白量表達(dá):實(shí)驗(yàn)完畢后1 d選取6只大鼠，解剖出腦海馬組織，加入2 mL RIPA組織裂解液，勻漿，冰浴30 min,40 ℃下500×g離心5 min,吸去上層液體，超聲波破核，再次離心，取上層液體10 μL待測(cè)。配膠，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，切膜，封閉液封閉1 h,逐次兔抗鼠GABA單克隆抗體、HRP標(biāo)記的二抗。Bio-Rad成像儀曝光成像,Image Lab Software測(cè)定光密度，結(jié)果以目標(biāo)蛋白與參照蛋白條帶比值表示相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 2組生命體征比較

2組麻醉開始時(shí)肛溫、心率、呼吸頻率、SPO2比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。麻醉后,2組大鼠肛溫、心率、呼吸頻率、SPO2均呈現(xiàn)一定程度的下降，而后逐漸恢復(fù)平穩(wěn)，但2組各時(shí)間點(diǎn)上述指標(biāo)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

A:SPO2變化;B:呼吸頻率變化;C:肛溫變化;D:心率變化。

2.2 丙泊酚對(duì)大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)逃逸潛伏期的影響

隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長,2組大鼠逃逸潛伏期、總里程數(shù)逐漸減小，丙泊酚組大鼠各時(shí)間點(diǎn)逃逸潛伏期、總里程均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1、2。

表1 2組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)逃逸潛伏期比較 s

表2 2組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)總里程比較 m

2.3 丙泊酚對(duì)大鼠穿越平臺(tái)區(qū)域次數(shù)和時(shí)間的影響

丙泊酚組大鼠穿越平臺(tái)區(qū)域次數(shù)、時(shí)間分別為(3.09±0.42)次、(17.15±1.36) s,對(duì)照組大鼠穿越平臺(tái)區(qū)域次數(shù)、時(shí)間分別為(8.36±1.03)次、(39.02±4.73) s,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 2組大鼠海馬CAI區(qū)HE染色及尼式染色

對(duì)照組海馬區(qū)Nissl體存在于細(xì)胞漿及樹突，染色較深，神經(jīng)細(xì)胞排列整齊，形態(tài)規(guī)則;丙泊酚組Nissl體消失，神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞核破裂、丟失。見圖2。

A:丙泊酚組大部分Nissl體在神經(jīng)細(xì)胞中消失(箭頭1),神經(jīng)細(xì)胞核丟失(箭頭2);B:對(duì)照組神經(jīng)細(xì)胞胞漿內(nèi)的Nissl體。

2.5 丙泊酚對(duì)大鼠海馬GABA蛋白的影響

丙泊酚組大鼠海馬GABA蛋白表達(dá)量低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

3 討 論

丙泊酚屬于臨床常用的靜脈麻醉劑，具有起效快、蘇醒時(shí)間短、副作用小等優(yōu)勢(shì)[5]。丙泊酚可以抑制海馬CAI區(qū)細(xì)胞突觸的長時(shí)程增強(qiáng)，引發(fā)POCD[6]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)大鼠進(jìn)行了腹腔注射丙泊酚，觀察大鼠的認(rèn)知功能，結(jié)果表明，丙泊酚組大鼠各時(shí)間點(diǎn)逃逸潛伏期、總里程均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長,2組大鼠逃逸潛伏期、總里程數(shù)逐漸減小，丙泊酚組大鼠穿越平臺(tái)區(qū)域次數(shù)、時(shí)間低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),表明丙泊酚對(duì)大鼠認(rèn)知功能具有一定的干擾。

研究[7-8]認(rèn)為，丙泊酚可激活GABA，抑制神經(jīng)細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)，導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙，出現(xiàn)順行性和逆行性遺忘等表現(xiàn)。GABA是海馬區(qū)中重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，研究[9-10]發(fā)現(xiàn)，阿爾茲海默病、帕金森綜合征等疾病海馬區(qū)域存在GABA低表達(dá)或GABA能受損。研究[11]發(fā)現(xiàn)，海馬區(qū)域中的GABA受體與認(rèn)知功能有潛在的聯(lián)系。研究[12]表明，老年癡呆患者及輕度認(rèn)知障礙患者GABA水平明顯降低。本研究觀察丙泊酚麻醉后大鼠海馬區(qū)域GABA受體蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明，丙泊酚組大鼠海馬GABA蛋白表達(dá)量低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),提示GABA受體與丙泊酚誘導(dǎo)的認(rèn)知功能障礙有一定的聯(lián)系。

Nissl體正常存在于神經(jīng)元胞體和樹突中，參與蛋白質(zhì)合成。神經(jīng)元胞體內(nèi)Nissl體大量存在表明神經(jīng)元合成蛋白質(zhì)的功能較強(qiáng);反之，神經(jīng)元功能存在障礙時(shí),Nissl體減少或消失。研究[13]表明，人記憶功能與海馬部分蛋白質(zhì)分泌、突觸間信號(hào)傳遞相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，丙泊酚組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元、Nissl體受損，考慮丙泊酚導(dǎo)致的認(rèn)知障礙可能與Nissl體功能障礙相關(guān)。

綜上所述，丙泊酚麻醉對(duì)大鼠認(rèn)知功能具有一定的影響，可能與海馬區(qū)GABA受體的表達(dá)有關(guān)，其具體機(jī)制仍待進(jìn)一步研究證實(shí)。