劉紅軍，謝愛香，張希杰，葛美層，朱君，孫志明

（河南省濮陽市中醫(yī)院1.檢驗科；2.婦產(chǎn)科；3.病理科，河南 濮陽457000）

卵巢癌屬于一種常見的婦科惡性腫瘤,在女性惡性腫瘤發(fā)病中位居第三,目前關(guān)于卵巢癌的發(fā)病機制尚不明確，大部分學(xué)者認為，卵巢癌發(fā)病與患者的年齡、精神狀況、環(huán)境、遺傳等相關(guān)[1]。卵巢癌患者發(fā)病較為隱匿,早期患者缺乏典型的臨床癥狀,晚期患者表現(xiàn)為腹脹，下腹部出現(xiàn)包塊，患者病程短，死亡率較高。目前手術(shù)聯(lián)合化療治療中晚期卵巢癌，但受化療耐藥性和復(fù)發(fā)的影響，患者預(yù)后差，5年的生存率較低[2]。選擇有效的參與卵巢癌發(fā)生、進展的相關(guān)分子，對患者來說具有重要意義，也是臨床研究的重點。RAGE主要在多種細胞表面進行表達的分子，在多種腫瘤中均有發(fā)現(xiàn)，參與腫瘤細胞增殖、凋亡、等過程[3,4]。研究認為，RAGE基因參與腫瘤生長過程,在腫瘤治療中發(fā)揮著重要作用。本文旨在研究沉默RAGE對人卵巢癌細胞株增殖、凋亡能力及周期分布的影響,為臨床治療卵巢癌尋找有效的靶向治療途徑。

1 材料與方法

1.1 材料 研究細胞及主要試劑：人上皮性卵巢癌SKOV-3細胞主要由（中國典型培養(yǎng)物保藏中心提供）。主要試劑：CCK-8、Transwell試劑盒（碧云天生物公司提供）；Tris-HCl緩沖液（Hyclone公司）；Bcl-2、Bax、CDK4、Cyclin D1一抗（北京中山生物公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 15ml離心管中加入8ml的15%胎牛血清培養(yǎng)基給予備用,取出人上皮性卵巢癌SKOV-3細胞，37℃水浴預(yù)熱培養(yǎng)基,液氮中將細胞取出后快速置入37℃水浴進行解凍,使用鑷子將凍存管夾住后，晃動，管口高于水平面，防止污染。加入5ml的培養(yǎng)基進行細胞重懸，1000rmp離心處理5min，將上清液摒棄后，再次加5ml的培養(yǎng)基進行細胞重懸,置入培養(yǎng)瓶中，輕輕混合均勻，在37℃，5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第二天，更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，觀察其貼壁情況，及時更換培養(yǎng)基。

1.2.2 慢病毒載體構(gòu)建及分組 嚴格按照Gen-Bank最新RAGE基因庫目標序列可能出現(xiàn)的干擾位點,進行設(shè)計shRNARAGE。RAGE序列：5'-GA TCCGGGCCGGACAGAAGCTTGGA和5'-TCCAAG CTTCTGTCCGGCCTTTTTT-3。對照引物序列為5'-CGATACTGAACGAATCGAT-3'。正反鏈混合后將退火緩沖液加入其中，95℃反應(yīng)4min,冷卻至室溫,產(chǎn)生雙鏈。采用Eco31Ⅰ酶切線性化質(zhì)粒pGenesil-1，將退火產(chǎn)物100倍稀釋后，與其連接，22℃下水浴過夜保存，使用大腸桿菌DH5α給予轉(zhuǎn)化，第2d選擇單克隆菌落,在30μg／ml Kana的LB培養(yǎng)液中進行接種，200r／min離心處理，在37℃下振蕩過夜保存。少量抽提質(zhì)粒后使用SacⅠ酶切進行鑒定（廣州復(fù)能基因有限公司），分為空白組、過表達組和沉默組。

1.2.3 細胞增殖 采用CCK-8檢測細胞增殖，將各組胰腺癌在96孔板進行接種，每組為3個復(fù)孔，分別培養(yǎng)24h、48h和72h后給予CCK-8試劑檢測，每孔中加入20μl的CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，通過顯微鏡觀察胰腺癌細胞增殖能力。

1.2.4 細胞凋亡 使用Tunel試劑盒,將采集到的單細胞懸液,使用75%酒精清潔細胞計數(shù)板和蓋玻片后進行晾干備用,在1.5ml EP管中使用移液器加入5u單細胞懸液,之后再加入95u PBS進行混合均勻,取20u蓋玻片和計數(shù)板縫隙一側(cè)勻速緩慢滴下,靜置時間為20s，在顯微鏡下觀察巨噬細胞凋亡狀況。

1.2.5 細胞周期 細胞培養(yǎng)后通過脫氧核糖核酸酶，加入Triton-X100表面活性劑，在37℃環(huán)境下水浴15min，加入碘化丙啶混合均勻后，采用流式細胞儀進行細胞周期檢查，Lysis軟件分析G1期、S期、G2期細胞所占百分比。

1.2.6 卵巢癌細胞增殖、凋亡、細胞周期相關(guān)蛋白表達 采用Western Blot，將采集到的標本10000×g離心處理10min，取出上清液，采用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白定量,將50μg蛋白加入到2×SDS凝膠加樣緩沖液中,100℃加熱處理5min促使蛋白變性。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳完成后進行轉(zhuǎn)膜，結(jié)束后取下硝酸纖維素膜，在5%脫脂牛奶中4℃下封閉1h，封閉結(jié)束后，加一抗使用0.05%~0.1% TBST給予稀釋（Bcl-2、Bax、CDK4、Cyclin D1一抗為1:1000），4℃孵育過夜保存,之后使用0.05%~0.1% TBST洗膜，3次，每次為5min，加二抗使用0.05%~0.1% TBST給予稀釋（1:10000），室溫搖動孵育1h,最后使用0.05%~0.1% TBST洗膜,3次，每次為5min。采用DAB染色試劑盒顯色，光密度掃描后進行定量分析。以GAPDH為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析處理。計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）描述，三組數(shù)據(jù)比較采用F值檢驗，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 沉默RAGE對卵巢癌細胞增殖情況的影響沉默組24h、48h、72h細胞增殖率低于空白組和過表達組各時間段的細胞增殖率，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。過表達組24h、48h、72h細胞增殖率高于空白組各時間段細胞增殖率，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。沉默組24h、48h、72h細胞增殖率逐漸降低，空白組和過表達組24h、48h、72h細胞增殖率逐漸升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 沉默RAGE各時間段卵巢癌細胞增殖情況比較（%，±s）

表1 沉默RAGE各時間段卵巢癌細胞增殖情況比較（%，±s）

組別 24h空白組過表達組沉默組F P 18.72±4.62 20.46±4.62 16.95±5.16 3.265 0.002 48h 23.35±5.06 26.26±6.02 13.86±2.62 8.959 0.001 72h 28.35±7.11 31.69±10.85 10.34±1.45 9.252 0.001

2.2 沉默RAGE對卵巢癌細胞凋亡情況的影響沉默組24h、48h、72h細胞凋亡率高于空白組和過表達組各時間段的細胞凋亡率,具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。過表達組24h、48h、72h細胞凋亡率低于空白組各時間段細胞凋亡率,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。沉默組、空白組和過表達組24h、48h、72h細胞凋亡率逐漸升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2、圖1。

表2 沉默RAGE各時間段卵巢癌細胞凋亡情況比較（%，±s）

表2 沉默RAGE各時間段卵巢癌細胞凋亡情況比較（%，±s）

組別空白組過表達組沉默組F P 24h 48h 18.46±4.46 12.28±3.35 20.45±6.62 5.223 0.001 20.44±4.85 16.15±3.56 30.64±10.12 6.407 0.001 72h 25.39±6.05 18.85±5.38 48.95±10.16 12.419 0.001

圖1 各組卵巢癌細胞凋亡情況（DAB染色，200×）

2.3 沉默RAGE對卵巢癌細胞增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達的影響 沉默組Bcl-2蛋白表達高于空白組和過表達組，Bax蛋白表達低于空白組和過表達組，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。過表達組Bcl-2蛋白表達低于空白組，Bax蛋白表達高于空白組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3、圖2。

表3 各組卵巢癌細胞增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達比較（±s）

表3 各組卵巢癌細胞增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達比較（±s）

組別 Bcl-2空白組過表達組沉默組F P 0.38±0.12 0.29±0.09 0.99±0.26 12.068 0.001 Bax 0.55±0.15 0.60±0.19 0.44±0.12 3.377 0.001

圖2 Bcl-2、Bax表達W B圖

2.4 沉默RAGE對卵巢癌細胞周期的影響 沉默組G1期細胞率低于過表達組和空白組，空白組G1期細胞率低于過表達組，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。沉默組S期細胞率低于過表達組和空白組，空白組S期細胞率低于過表達組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。沉默組G2期細胞率高于過表達組和空白組，空白組G2期細胞率高于過表達組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

表4 沉默RAGE對卵巢癌細胞周期的影響（%，±s）

表4 沉默RAGE對卵巢癌細胞周期的影響（%，±s）

組別 G1空白組過表達組沉默組S F P 73.35±20.26 76.62±12.25 68.16±8.15 2.727 0.003 14.48±3.15 20.82±6.15 10.11±3.02 7.415 0.001 G2 10.26±3.13 7.75±2.14 17.72±5.16 8.466 0.001

2.5 沉默RAGE對卵巢癌細胞周卵巢癌細胞周期相關(guān)蛋白表達 沉默組CDK4蛋白表達高于空白組和過表達組,Cyclin D1蛋白表達低于空白組和過表達組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。過表達組CDK4蛋白表達低于空白組，Cyclin D1蛋白表達高于空白組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表5、圖3。

3 討論

晚期卵巢癌患者的5年生存率不足30%[5]，梁偉晨[6]研究指出,尋找有效的抑制作用因子，為研究卵巢癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移具有重要作用，能提高患者生存率。RAGE是免疫球蛋白家族中重要成員,是多配體跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體,與細胞表面不同配體結(jié)合發(fā)揮重要作用,在血管內(nèi)皮細胞、巨噬細胞、成纖維細胞等細胞表面廣泛存在[7,8]。蘇才麗[9]研究指出,RA GE在腫瘤組織中表達異常,參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，通過阻斷RAGE能有效的抑制腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移。

表5 各組卵巢癌細胞周期相關(guān)蛋白表達比較（±s）

表5 各組卵巢癌細胞周期相關(guān)蛋白表達比較（±s）

組別 CDK4空白組過表達組沉默組F P 1.51±0.36 0.75±0.14 1.82±0.54 9.098 0.001 Cyclin D1 0.62±0.10 0.78±0.16 0.51±0.09 6.976 0.001

圖3 CDK4、Cyclin D1表達W B圖

RAGE在正常細胞中也有表達,發(fā)揮重要功能。齊紅[10]研究指出，RAGE主要存在于患者卵巢表面上皮以及次級卵泡膜細胞中，有輕度表達。也有研究認為，在間質(zhì)細胞、初級以及次級卵母細胞中RAGE顯示中度表達，在成熟卵巢顆粒細胞中，RAGE顯示強陽性表達[11,12]。RAGE在前列腺癌患者中發(fā)現(xiàn)RAGE基因過度表達,對前列腺癌細胞增殖和侵襲有促進作用[13]。RAGE在正常胃組織中顯示為低表達，在胃癌患者中顯示高表達，并且與其侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)[14]。因此通過沉默卵巢癌細胞中R AGE表達，能有效的抑制癌細胞增殖，對臨床治療卵巢癌具有重要意義。本文研究顯示,沉默組24h、48h、72h細胞增殖率逐漸降低，并且低于空白組和過表達組各時間段的細胞增殖率，說明沉默RAGE表達，能抑制卵巢癌細胞增殖。

本文研究結(jié)果指出,沉默組24h、48h、72h細胞凋亡率逐漸升高,并且高于空白組和過表達組各時間段的細胞凋亡率。說明沉默RAGE能促進卵巢癌細胞凋亡。相關(guān)研究指出，RAGE基因能將細胞周期蛋白Cyclin D1激活,從而促進細胞增殖,RA GE基因?qū)kt磷酸化有顯著的促進作用，并且能促進抗凋亡蛋白Bcl-2表達，在細胞增殖、凋亡中發(fā)揮重要的參與作用[15,16]。研究認為RAGE基因能通過激活Cyclin D1、自噬相關(guān)蛋白等，從而抑制癌癥細胞凋亡,對腫瘤細胞存活率有提高作用[17]。Bcl-2參與細胞增殖也參與細胞凋亡。本文研究結(jié)果顯示，沉默組Bcl-2蛋白表達較高，Bax蛋白表達降低，說明沉默RAGE能調(diào)控Bcl-2、Bax蛋白表達，從而抑制卵巢癌細胞增殖，促進其凋亡。

細胞周期能有效的調(diào)節(jié)信號通路傳導(dǎo)異常,參與卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展。G2/M檢驗點是細胞周期中重要的細胞檢測點,在細胞一分為二過程中發(fā)揮著重要調(diào)控作用,細胞在進入有絲分裂前G2/M檢驗點能有效的修復(fù)DNA損傷[18,19]。本文研究證實,沉默組G1期和S期細胞率較低，G2期細胞率顯著升高,說明G2到M期的轉(zhuǎn)化過程受到導(dǎo)致抑制。過表達組和空白組S期和G2期相反，說明細胞周期失衡。細胞周期受多種因素的影響，CDK4屬于細胞周期調(diào)節(jié)蛋白,具有重要調(diào)節(jié)作用，與CyclinD1結(jié)合有助于復(fù)合物活化，促進細胞從G1期向S期轉(zhuǎn)化[20]。CDK4細胞周期一旦出現(xiàn)調(diào)控異常，會導(dǎo)致腫瘤發(fā)生，得到廣泛關(guān)注。本文研究指出，沉默組CDK4蛋白表達顯著升高，Cyclin D1蛋白表達降低，說明沉默RAGE能調(diào)控CDK4、Cyclin D1蛋白表達，調(diào)控細胞周期轉(zhuǎn)化。目前卵巢癌患者一旦確診已經(jīng)處于中晚期,手術(shù)聯(lián)合化療雖然取得了一定的治療效果，但是患者5年的存活率較低，患者容易出現(xiàn)耐藥和轉(zhuǎn)移,研究卵巢癌細胞的發(fā)病機制,為卵巢癌的靶向治療提供理論依據(jù)，目前關(guān)于RAGE在卵巢癌細胞發(fā)病中作用的研究較少。

綜上所述,沉默RAGE通過調(diào)控Bcl-2、Bax、CDK4、Cyclin D1相關(guān)蛋白表達，能抑制卵巢癌細胞增殖，促進其凋亡，阻礙G2至M期轉(zhuǎn)化，為臨床治療卵巢癌尋找有效的靶向治療途徑。