馬建民 段素云 劉 瑩 郭 彤

北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，北京102400

牛至（Origanum vulgareL.）為唇形科牛至屬多年生草本植物，我國主要分布西北、東北、江西、安徽、湖北、河南等地，本品性涼、味辛、無毒，具有清熱解表、利水消腫的功效，主治中暑、感冒、頭痛身痛、急性胃腸炎、腹痛吐瀉、水腫等癥[1]。藥理研究表明，牛至精油具有抗菌、抗氧化[2]、增強(qiáng)免疫力作用，是牛至產(chǎn)生藥效的主要活性部位，其主要成分為香芹酚和麝香草酚。牛至精油的提取方法主要有有機(jī)溶劑提取、水蒸氣提取和超臨界流體萃取[3]等方法。牛至精油不溶于水、易揮發(fā)，可應(yīng)用環(huán)糊精、羧甲基纖維素、海藻鈉等輔料進(jìn)行包膜制成牛至精油預(yù)混劑進(jìn)行使用[4-6]，通過包膜技術(shù)減少精油的揮發(fā)并增加其溶解性。劉元元等[7]使用5%牛至香酚預(yù)混劑，添加量為15 mg/kg，飼料中牛至香酚含量為0.75 mg/kg，促進(jìn)肉雞生產(chǎn)性能。彭青云等[8]使用至多興牛至油添加劑，其香芹酚和麝香草酚含量分別為2.2%和1.1%，添加量為300 mg/kg，飼料中總酚含量為9.9 mg/kg，能改善肉雞的生產(chǎn)性能和屠宰性能并提高免疫器官指數(shù)。郝丹丹等[9]使用購自美國Sigma-Aldrich 公司牛至油，其中香芹酚7.3%、麝香草酚0.18%，最佳添加量為50 mg/kg，飼料中總酚含量為3.74 mg/kg，提高蛋雞的生產(chǎn)性能和免疫功能。市售牛至精油產(chǎn)品均以香芹酚和麝香草酚作為質(zhì)量控制指標(biāo)，當(dāng)家禽飼料中總酚濃度為0.75~9.90 mg/kg時(shí)，可提高家禽的生產(chǎn)性能。牛至其他部位的藥效也有報(bào)道，早克然·司馬義等[10]發(fā)現(xiàn)牛至水提取物具有抗炎、止咳及抗自由基作用。李定剛等[11]對(duì)不同工藝來源的牛至提取物對(duì)小鼠大腸桿菌的防治作用的研究表明，牛至精油與牛至水提物混合使用防治效果最佳。

由于精油的化學(xué)性質(zhì)，牛至的水提液中精油成分含量極低，而牛至精油的單獨(dú)提取相對(duì)復(fù)雜，提取后需進(jìn)行包膜使用，且損失了牛至水提液中部分抗炎、抗氧化成分。本試驗(yàn)在純化水中添加食品級(jí)助溶劑丙二醇或環(huán)糊精對(duì)牛至進(jìn)行提取，以乙腈提取作為陽性對(duì)比，純化水提取作為陰性對(duì)比，通過高效液相色譜測(cè)定提取液中精油成分香芹酚和麝香草酚含量，評(píng)價(jià)丙二醇、環(huán)糊精對(duì)牛至精油成分輔助提取作用，為牛至產(chǎn)品開發(fā)提供新的提取方法。

1 材料與方法

1.1 試 劑

牛至購自玉林市玉州區(qū)菩提藥源食品經(jīng)營部；丙二醇、β-環(huán)糊精、羥丙基-β-環(huán)糊精（食品級(jí)）購自九州食品配料商城；香芹酚、麝香草酚（＞99.0%）購自macklin 公司；乙腈（為色譜純）購自Fisher Scientific 公司。

1% β-環(huán)糊精溶液：精密稱取β-環(huán)糊精10.00 g，加蒸餾水1 000 mL 溶解；1%羥丙基-β-環(huán)糊精溶液：精密稱取羥丙基-β-環(huán)糊精10.00 g，加蒸餾水1 000 mL 溶解；10%丙二醇溶液：精密稱取丙二醇100 g，加蒸餾水溶解定容至1 000 mL；標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別精密稱取香芹酚和麝香草酚對(duì)照品0.0250 g，用乙腈定容至25 mL，制得終濃度為1 mg/mL 的2種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)工作液：取以上2 種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用乙腈-水（40∶60）稀釋制備1、5、10、20、50 mg/L 5 個(gè)系列質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，存放于4 ℃冰箱。

1.2 儀 器

電子分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司SQP）、昆山KQ-500DV 超聲清洗機(jī)、GT10-1型高速離心機(jī)（北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司）、震蕩器（IKA）、高效液相色譜儀（島津LC-16AT）。

1.3 提取方法

牛至粉碎后，過0.15 mm 篩，精確稱取3 份牛至粉末0.200 0 g，置10 mL 離心管中，分別加入5 mL提取液，密封，40 ℃超聲40 min，6 000 r/min 離心10 min，上清液即為牛至提取液。

1.4 色譜方法

色譜柱InertSustain C18（150 mm×2.1 mm，3 μm）；紫外檢測(cè)波長276 nm；流動(dòng)相為乙腈-水（40∶60）；柱溫：50 ℃；流速0.4 mL/min；混合標(biāo)準(zhǔn)工作液依次進(jìn)樣10 μL。將測(cè)得香芹酚和麝香草酚的色譜峰面積（A）和相對(duì)應(yīng)的濃度（C）做直線回歸，求得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程的線性范圍和相關(guān)系數(shù)。

1.5 提取液中香芹酚和麝香草酚檢測(cè)

取1.3 上清液過微孔濾膜，量取濾液0.6 mL，加入乙腈0.4 mL，渦動(dòng)5 min，10 000 r/min 離心10 min，取上清液過微孔濾膜，濾液上機(jī)檢測(cè)，進(jìn)樣10 μL。按峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算提取液中香芹酚和麝香草酚含量。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，極顯著水平為P＜0.01。試驗(yàn)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和液相色譜圖

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液和牛至樣品色譜圖見圖1和圖2，香芹酚和麝香草酚基本完全分離，色譜峰形對(duì)稱。香芹酚和麝香草酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和相關(guān)系數(shù)見表1。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液色譜圖

圖2 牛至樣品色譜圖

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和相關(guān)系數(shù)

2.2 提取液中香芹酚和麝香草酚含量

由表2可知，不同提取液中香芹酚和麝香草酚含量均差異極顯著（P＜0.01）。

表2 不同提取液中香芹酚和麝香草酚含量

3 討 論

3.1 液相色譜檢測(cè)

香芹酚與麝香草酚為同分異構(gòu)體，分離較為困難，其化學(xué)名稱分別為2-甲基-5-異丙基苯酚和5-甲基-2-異丙基酚，竇茂鑫等[12]使用甲醇-水-冰醋酸（60∶40∶2）為流動(dòng)相對(duì)飼料添加劑中的香芹酚與麝香草酚進(jìn)行檢測(cè)分析。孫麗娟等[13]使用乙腈-水（50∶50）為流動(dòng)相對(duì)牛至藥材中的香芹酚與麝香草酚進(jìn)行分析。在文獻(xiàn)基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)采用乙腈-水（40∶60）的流動(dòng)相對(duì)提取液進(jìn)行分析檢測(cè)，色譜峰分離完全，出峰時(shí)間適宜，相關(guān)系數(shù)符合要求?？梢酝ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算提取液中香芹酚和麝香草酚含量，進(jìn)行比較分析。

3.2 不同提取液比較

牛至中揮發(fā)油類成分香芹酚和麝香草酚是其抗菌、抗氧化的主要成分，因此用提取液中香芹酚和麝香草酚含量高低評(píng)價(jià)提取液的提取效果。香芹酚和麝香草酚結(jié)構(gòu)決定其不易溶于水，易溶于有機(jī)溶劑，因此乙腈提取液含量最高分別為15.54 mg/L 和24.61 mg/L，蒸餾水提取液含量最低分別是0.29 mg/L和2.36 mg/L，牛至中香芹酚和麝香草酚含量測(cè)定一般使用乙腈進(jìn)行提取[13]。純化水中添加環(huán)糊精和丙二醇提高香芹酚和麝香草酚的含量，其中1% β-環(huán)糊精提取液含量最高分別為13.62 mg/L 和17.10 mg/L，達(dá)到乙腈的87.64%和69.45%。環(huán)糊精具有“內(nèi)親油、外親水”的空腔結(jié)構(gòu)，提高了牛至精油成分溶解度和溶出速率，進(jìn)而提高提取率[14]。

牛至粉在蒸餾水中香芹酚和麝香草酚溶出率極低，飼料中直接添加牛至粉的報(bào)道較少。1% β-環(huán)糊精牛至提取液與飼料進(jìn)行1∶（3~10）比例拌料使用，飼料中總酚含量可達(dá)到3.07~10.24 mg/kg，與市售牛至油預(yù)混劑的濃度相當(dāng)[7-9]。牛至1% β-環(huán)糊精提取液制備與提取牛至揮發(fā)油再制成牛至油預(yù)混劑的工藝相比，具有操作簡單、成本低的優(yōu)點(diǎn)。

4 結(jié) 論

牛至β-環(huán)糊精提取液顯著提高了牛至中香芹酚和麝香草酚溶出度，可直接進(jìn)行拌料使用，應(yīng)用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)。