張芬熙，董自梅，陳廣文*，劉德增

(1.河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453007； 2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453003)

渦蟲是動(dòng)物界最早出現(xiàn)的兩側(cè)對(duì)稱、具有三胚層的類群，在動(dòng)物系統(tǒng)演化過程中占有重要地位，日本三角渦蟲Dugesiajaponica是渦蟲綱Turbellaria的代表動(dòng)物(張合彩等，2009)。渦蟲由于具有很強(qiáng)的再生能力，被廣泛地用于再生生物學(xué)研究。Cullin1是泛素連接酶復(fù)合體的重要組成分子，對(duì)復(fù)合體的形成起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用(Chenetal.，2015)。Cullin1可通過調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程從G1期到G0期轉(zhuǎn)變，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的增殖與凋亡(Johnstonetal.，2005)。Strand等(2018)發(fā)現(xiàn)Smedcullin1基因在地中海渦蟲Schmidteamediterranea中陽性表達(dá)，敲減Smedcullin1基因可抑制渦蟲體內(nèi)細(xì)胞分化以及神經(jīng)系統(tǒng)再生，并導(dǎo)致地中海渦蟲再生缺陷。

泛素蛋白酶體途徑對(duì)細(xì)胞內(nèi)錯(cuò)誤折疊蛋白的降解具有重要的調(diào)節(jié)作用，且參與胞內(nèi)關(guān)鍵生理進(jìn)程，Cullin1參與構(gòu)成Skp1-Cullin1-F-box(CF)復(fù)合體，是泛素E3連接酶的重要組成部分，SCF復(fù)合體可以與攜帶泛素分子的E2酶相互識(shí)別，參與泛素化過程中底物的識(shí)別并招募(Skaaretal.，2013；楊楊楊等，2015)。Cullin1是經(jīng)典TGF-β信號(hào)通路中Smad2/3的抑制因子，有可能通過TGF-β信號(hào)通路在渦蟲再生過程中發(fā)揮一定調(diào)控作用。

Chen和Xu(2017)利用二維電泳鑒定三角渦蟲尾部再生過程中蛋白質(zhì)組學(xué)的變化，發(fā)現(xiàn)TGF-β及其下游信號(hào)Smad4在渦蟲尾部再生過程中明顯升高，提示TGF-β信號(hào)通路可能在渦蟲尾部再生過程中發(fā)揮重要作用。Ermakov等(2014)利用藥物抑制劑干預(yù)TGF-β和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MEK)可明顯抑制地中海渦蟲頭部再生以及干細(xì)胞增殖，提示TGF-β信號(hào)通路可能參與渦蟲頭部的再生。

TGF-β誘導(dǎo)核蛋白1基因(TGF-β-inducible nuclear protein 1，tinp1)是近期在研究毛細(xì)胞白血病的抑癌基因過程中被發(fā)現(xiàn)的，因此又被命名為毛細(xì)胞白血病蛋白1基因(hairy cell leukemia protein 1，hclp1)。tinp1基因是酵母nsa2基因的同源物，Nsa2蛋白被證明是核糖體生物發(fā)生的限制因子及細(xì)胞增殖必需因子，亦被認(rèn)為是從酵母到人類最保守的蛋白之一(Lebretonetal.，2006；Zhangetal.，2010)。相關(guān)研究顯示，在白血病病人體內(nèi)或人白血病細(xì)胞中，TGF-β的活化可誘導(dǎo)Tinp1表達(dá)上調(diào)(Evenetal.，2019)。此外，Shahni等(2013)的研究還顯示，給予體外培養(yǎng)的系膜細(xì)胞外源性TGF-β1不僅可以增強(qiáng)Tinp1 mRNA/protein在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平，還可影響其在細(xì)胞內(nèi)的分布與定位，誘導(dǎo)細(xì)胞漿內(nèi)的Tinp1蛋白迅速向細(xì)胞核內(nèi)遷移。Sun等(2019)研究顯示，敲減smad4基因可抑制TGF-β信號(hào)通路，進(jìn)而降低渦蟲體內(nèi)tinp1基因的表達(dá)，抑制渦蟲中樞神經(jīng)系統(tǒng)的再生。上述研究進(jìn)展提示，TGF-β信號(hào)通路可以通過調(diào)控tinp1參與渦蟲再生。

日本三角渦蟲中cullin1基因(Djcullin1)和tinp1基因(Djtinp1)二者之間是否存在關(guān)系，是否可以通過TGF-β信號(hào)通路發(fā)生作用，當(dāng)前仍不清楚。因此，本研究通過敲減日本三角渦蟲體內(nèi)Djcullin1基因，研究TGF-β信號(hào)通路smad2/3(Djsmad2/3)、smad4(Djsmad4)和Djtinp1等基因及蛋白在渦蟲體內(nèi)的表達(dá)，然后又敲減Djtinp1基因，研究Djcullin1基因及蛋白在渦蟲體內(nèi)的表達(dá)，從而推斷Djcullin1和Djtinp1基因在渦蟲中的相互作用關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 日本三角渦蟲的來源與飼養(yǎng)

日本三角渦蟲采自河南省鶴壁市魚泉泉水。采集后利用魚泉泉水于20 ℃恒溫培養(yǎng)箱中避光養(yǎng)殖，第2天換掉一半魚泉泉水，加入一半曝氣的自來水，第3天全部用曝氣的自來水，以后每日于曝氣自來水中培養(yǎng)，每7 d左右喂食新鮮牛肝勻漿 1次，喂食2 h后換曝氣自來水。

1.2 RNAi干擾渦蟲體內(nèi)Djcullin1和Djtinp1基因

將Djcullin1或Djtinp1基因的目的片段通過雙酶切法與L4440載體相連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌HT115感受態(tài)細(xì)胞，通過在培養(yǎng)基中添加IPTG誘導(dǎo)目的基因雙鏈RNA的合成后，將菌種離心沉淀后混合在1 mL牛肝勻漿中，通過喂食達(dá)到干擾目的，對(duì)照組渦蟲喂食未轉(zhuǎn)染目的基因的HT115菌液。每隔1 d干擾喂食1次，共喂食6次，每天更換曝氣自來水，實(shí)驗(yàn)處理前饑餓渦蟲1周。

1.3 總RNA的提取

取干擾后饑餓1周的渦蟲，用滅菌水和DEPC水依次沖洗渦蟲3遍，轉(zhuǎn)入無RNA酶的EP管中，加入1 mL Trizol，-80 ℃冷凍1 h，而后輕柔吹打，待渦蟲完全溶解后，4 ℃ 12 000 r·min-1離心5 min。取上清850 μL，加入200 μL氯仿，混勻后室溫靜置 5 min，4 ℃ 12 000 r·min-1離心15 min。離心后，取上層無色水相(約300 μL)，與等量異丙醇混勻，室溫靜置10 min，而后4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min，棄上清，利用1 mL 75%乙醇洗滌沉淀RNA 2次。離心后，室溫干燥5 min，加入30 μL DEPC水溶解RNA沉淀。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)

利用DNA Synthesis Kit(TaKaRa)試劑盒說明書進(jìn)行cDNA合成，Nanodrop檢測(cè)cDNA濃度，具體步驟參見程方方(2016)。利用ABI PRISM 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀器(Applied Biosystems)、SYBR Green qPCR Master Mix (TaKaRa)和1 μg cDNA進(jìn)行PCR，反應(yīng)體系50 μL。采用2-ΔΔCt法分別計(jì)算Djcullin1和Djtinp1mRNA的相對(duì)表達(dá)量，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次6只渦蟲(表1)。引物見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物Table 1 Primers used in this study

1.5 整體原位雜交實(shí)驗(yàn)

按Cheng等(2015)的方法對(duì)渦蟲進(jìn)行整體原位雜交染色，分別檢測(cè)Djcullin1和Djtinp1的表達(dá)。每組選取6條渦蟲，2%鹽酸處死后，4%多聚甲醛固定，梯度甲醇脫水，H2O2漂白過夜。第2天梯度甲醇復(fù)水，蛋白酶K室溫孵育10 min，然后4%多聚甲醛固定20 min。用含探針的雜交液(1∶400)處理渦蟲16 h。MABT洗滌2次后，馬血清封閉2 h。加入馬血清稀釋的Antibody solution(1∶2 000)4 ℃過夜。MABT洗滌后，NBT/BCTP顯色。

1.6 Western Blotting

干擾喂食渦蟲結(jié)束后再饑餓7 d，將渦蟲組織研磨碎，并提取蛋白。采用蛋白提取試劑盒，其中含有20 mL 5×裂解緩沖液、0.5 mL蛋白酶抑制劑、0.5 mL磷酸酶抑制劑和0.5 mL苯甲基磺酰氟[寶生物工程(大連)有限公司]。用標(biāo)準(zhǔn)的Bradford蛋白測(cè)定法測(cè)定蛋白濃度。后續(xù)試驗(yàn)參考Zhang等(2019)進(jìn)行Western Blotting分析。電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在TBS-T中，用5%BSA或5%脫脂奶(生產(chǎn)商說明)將膜封住，然后4 ℃環(huán)境樣本與Smad2/3(CST，8685s)、Smad4(BIOSS，bs-23966r)、Cullin1(Servicebio，PA1557)；Tinp1(Signalway，29601)及β-actin(Servicebio，GB12001)抗體(1∶100)孵育過夜后在室溫下用酶標(biāo)二抗(1∶3 000)對(duì)印跡孵育1 h。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)免疫反應(yīng)條帶。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Djcullin1和Djtinp1基因干擾效果

喂食未轉(zhuǎn)染目的基因HT115菌液的渦蟲為對(duì)照組。喂食含Djcullin1基因或Djtinp1基因的目的片段的TH115菌液的渦蟲為干擾組。在基因干擾結(jié)束后，利用qPCR及整體原位雜交技術(shù)檢測(cè)Djcullin1基因干擾組和對(duì)照組渦蟲體內(nèi)Djcullin1基因的表達(dá)，檢測(cè)Djtinp1基因干擾組和對(duì)照組渦蟲體內(nèi)Djtinp1基因的表達(dá)，驗(yàn)證2個(gè)基因的干擾效果。與對(duì)照組比較，Djcullin1基因干擾組渦蟲體內(nèi)Djcullin1基因的mRNA表達(dá)明顯降低(圖1：A，C)，Djtinp1基因干擾組渦蟲體內(nèi)Djtinp1基因的mRNA表達(dá)也顯著降低(圖1：B，D)，這說明2個(gè)基因敲減成功。

2.2 敲減Djcullin1基因后渦蟲體內(nèi)Djsmad2/3、Djsmad4及Djtinp1基因的mRNA表達(dá)

qPCR發(fā)現(xiàn)，Djcullin1基因敲減后TGF-β信號(hào)通路相關(guān)分子Djsmad2/3、Djsmad4和Djtinp1基因的mRNA表達(dá)量明顯增高(圖2)。

2.3 敲減Djcullin1基因后整體原位雜交檢測(cè)渦蟲TGF-β通路相關(guān)基因的表達(dá)

結(jié)果顯示，Djcullin1基因干擾后,Djsmad2/3、Djsmad4和Djtinp1基因的表達(dá)與qPCR結(jié)果一致，表達(dá)明顯增高(圖3)。

2.4 敲減Djcullin1基因后渦蟲體內(nèi)Smad2/3、Smad4及Tinp1蛋白的表達(dá)

Western Blotting結(jié)果顯示，Djcullin1基因干擾后，渦蟲體內(nèi)與TGF-β通路相關(guān)的Smad2/3、Smad4和Tinp1蛋白的表達(dá)與熒光定量結(jié)果及原位雜交一樣，均明顯增高(圖4)。

2.5 敲減Djtinp1基因后qPCR檢測(cè)渦蟲Djcullin1基因的表達(dá)

qPCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，Djtinp1基因干擾組渦蟲體內(nèi)Djcullin1基因的mRNA表達(dá)量明顯升高(圖5)。

2.6 敲減Djtinp1基因后原位雜交檢測(cè)渦蟲Djcullin1基因的表達(dá)

原位雜交檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，Djtinp1基因干擾組渦蟲體內(nèi)Djcullin1基因的mRNA表達(dá)量明顯升高(圖6)。

2.7 敲減Djtinp1基因后Western Blotting檢測(cè)渦蟲Cullin1蛋白的表達(dá)

Western Blotting結(jié)果顯示，Djtinp1基因干擾后，Cullin1蛋白的表達(dá)明顯增高(圖7)。

3 討論

日本三角渦蟲由于其強(qiáng)大的再生能力，已被廣泛地應(yīng)用于再生生物學(xué)研究。Cullin1為細(xì)胞周期重要調(diào)控分子，與細(xì)胞增殖、凋亡和分化均有密切關(guān)系(Johnstonetal.，2005；Chenetal.，2015)。Tinp1為TGF-β信號(hào)通路的下游信號(hào)分子，也與細(xì)胞增殖和凋亡有一定的關(guān)系(Chen & Xu，2017)。cullin1基因和tinp1基因均在渦蟲體內(nèi)呈陽性表達(dá)，且參與渦蟲多種組織和器官的再生(Strandetal.，2018；Sunetal.，2019)。但渦蟲體內(nèi)兩者之間的關(guān)系仍不清楚。

Cullin1蛋白是Cullins家族中最早發(fā)現(xiàn)的成員，也是構(gòu)成E3泛素連接酶復(fù)合體的關(guān)鍵分子(Jiangetal.，2015；Strandetal.，2018)。在復(fù)合體中，Cullin1蛋白可通過skp1調(diào)控f-box蛋白，由f-box蛋白與特定底物接觸，并以特異的方式降解底物蛋白，進(jìn)而發(fā)揮其對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞生理功能的調(diào)控作用(Chenetal.，2012)。E3泛素連接酶復(fù)合體是TGF-β信號(hào)通路活化的重要調(diào)控因素(Imamuraetal.，2013；Huangetal.，2016)，提示作為TGF-β信號(hào)通路的下游分子tinp1基因也可能受到E3泛素連接酶復(fù)合體(包括cullin1基因)的影響，因此兩基因之間有可能通過TGF-β信號(hào)通路發(fā)生相互作用。

本研究利用RNAi技術(shù)敲減Djcullin1基因表達(dá)，運(yùn)用qPCR、整體原位雜交技術(shù)及Western Blotting技術(shù)檢測(cè)了Djsmad2/3、Djsmad4及Djtinp1基因及其翻譯后蛋白水平的表達(dá)。敲減Djcullin1基因后qPCR結(jié)果顯示,TGF-β信號(hào)通路相關(guān)分子Djsmad2/3、Djsmad4及Djtinp1基因的mRNA水平明顯增高，整體原位雜交結(jié)果顯示，渦蟲體內(nèi)Djsmad2/3、Djsmad4及Djtinp1基因表達(dá)較對(duì)照組渦蟲明顯增高，Western Blotting數(shù)據(jù)表明，Djcullin1基因干擾后渦蟲體內(nèi)Smad2/3、Smad4及Tinp1蛋白的表達(dá)明顯調(diào)高。說明敲減Djcullin1基因可以增強(qiáng)TGF-β信號(hào)通路相關(guān)基因及蛋白的表達(dá)。利用RNAi技術(shù)敲減Djtinp1基因后，qPCR及整體原位雜交結(jié)果顯示渦蟲體內(nèi)Djcullin1基因表達(dá)明顯增高，qPCR結(jié)果表明敲減Djtinp1基因后Djcullin1基因的表達(dá)水平增加了4.7倍，Western Blotting數(shù)據(jù)也表明,Cullin1蛋白水平明顯增高。

綜上所述，作為TGF-β信號(hào)通路Smad2/3的抑制因子，Djcullin1基因在日本三角渦蟲體內(nèi)可通過TGF-β信號(hào)通路增強(qiáng)Djtinp1基因的表達(dá)，Djtinp1基因也可影響Djcullin1基因表達(dá)，兩者之間為負(fù)性調(diào)節(jié)機(jī)制，具體Djtinp1基因如何反向影響Djcullin1基因表達(dá)，目前原因還不清楚。由于目前未見任何有關(guān)cullin1基因、TGF-β信號(hào)通路及tinp1基因相關(guān)互作的報(bào)道，所以上述創(chuàng)新性發(fā)現(xiàn)可為研究三角渦蟲的再生機(jī)制提供新的理論視角。但本課題僅研究了Djcullin1和Djtinp1基因在日本三角渦蟲體內(nèi)的相互作用，并未涉及哺乳動(dòng)物和人類，因此2個(gè)基因的互相調(diào)節(jié)作用是否普遍存在于其他生物體內(nèi)還不清楚，仍有待深入研究。