呂莎莎，陳祥盛*

(1.貴州大學昆蟲研究所，貴陽550025； 2.貴州大學昆蟲資源開發(fā)利用省級特色重點實驗室，貴陽550025；3.貴州大學貴州山地農業(yè)病蟲害省級重點實驗室，貴陽550025)

水蔥Schoenoplectustabernaemontani為莎草科Cyperaceae水蔥屬Schoenoplectus植物，在我國分布較廣泛，是南方濕地常見的優(yōu)勢水生植物。水蔥具有較高的經濟價值，其所含樟腦、苯乙烯、龍腦、肉豆寇等藥用成分對微生物有廣泛和明顯的抑菌作用；地上部分可入藥，主治水腫脹滿，前列腺增生癥，能明顯改善下尿路癥狀，減少殘余尿量，增加尿流率，小便不利(劉鵬巖，傅承光，1992；范錚等，2013；顧懿寧等，2013)；地下塊莖是濕地越冬候鳥的重要食物來源，也是穩(wěn)定濕地生態(tài)系統(tǒng)的主要物種之一(李鳳山等，1997)；莖稈可做插花的線條材料，也可用做造紙或編織草席的材料。此外，水蔥可通過根系的吸附作用去除水體中的重金屬，從而達到凈化水源的作用(楊倩，2009；任珺等，2010，2011)。2017年作者在貴州省威寧縣草海國家級自然保護區(qū)采集調查時，發(fā)現(xiàn)1種嚴重危害草海濕地優(yōu)勢作物水蔥的蠟蟬，經鑒定為黑粒脈蠟蟬NisiafuliginosaYang & Hu，1985，隸屬于半翅目Hemiptera頭喙亞目Auchenorrhyncha蠟蟬總科Fulgoroidea粒脈蠟蟬科Meenoplidae粒脈蠟蟬屬Nisia(楊蓮芳，胡春林，1985)。粒脈蠟蟬屬NisiaMelichar，1903全世界共記錄22個種，中國已知5種(胡春林，楊蓮芳，1993；Bourgoin，2020)。粒脈蠟蟬屬種類的外部形態(tài)非常相似，主要依據(jù)雄性外生殖器特征進行種類的準確鑒定。目前關于黑粒脈蠟蟬的形態(tài)描述相對簡單，除成蟲以外的其他蟲態(tài)未見詳細報道；而有關粒脈蠟蟬科昆蟲的DNA條形碼研究較少。為此，本文對黑粒脈蠟蟬的卵、若蟲及成蟲的形態(tài)特征進行了詳細描述，并對其線粒體COⅠ基因序列進行了測定與分析，同時對該害蟲的危害狀況進行了初步觀察，旨在為該害蟲的分類鑒定和防控提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

用于研究的形態(tài)學材料和分子材料均來自于研究期間所獲標本(包括Nisiasp.)(表1)，樣品保存于貴州大學昆蟲研究所(IEGU)。

表1 本研究供試昆蟲的采集信息Table 1 Collecting information of insects in this study

1.2 實驗方法

1.2.1 形態(tài)特征觀察卵、若蟲及成蟲外部形態(tài)特征在Leica MZ 12.5體視顯微鏡下觀察，體軀量度在測微尺下進行測量，各蟲態(tài)整體及部分形態(tài)特征圖像通過KEYENCE VHX-1000C數(shù)碼成像系統(tǒng)和NIKON SMZ 25數(shù)碼相機獲得；生殖節(jié)解剖時，在Leica MZ 12.5體視顯微鏡下將昆蟲腹部朝上，用昆蟲解剖針或尖頭解剖鑷子插入胸腹結合處，輕輕撬開，將昆蟲腹部取下，放入10% NaOH溶液中，室溫下放置3～5 h或煮沸1～3 min(時間視標本的骨化程度而定，煮沸時要防止標本隨溶液沸騰飛濺而出)，清水洗凈后用吸水紙吸去水分，置于放有甘油的單凹玻片上(可在甘油內放少量棉絲，便于觀察和固定形態(tài))，在解剖鏡下調整好各部分姿勢后，觀察并繪制草圖，草圖繪制好后，利用硫酸紙對所繪草圖進行覆墨，后用CanoScan LiDE100掃描儀掃描，再利用Adobe Photoshop 8.0處理、排版。

1.2.2 基因組DNA提取、PCR擴增及測序取出用75%乙醇浸泡的冷凍(-20 ℃)黑粒脈蠟蟬成蟲、若蟲及卵，并在解剖鏡下用解剖針去掉成蟲腹部，取頭胸部用動物基因組DNA提取試劑盒(通用型)(昆明碩擎生物科技有限公司)提取基因組DNA。線粒體COⅠ基因PCR擴增引物序列F:5’-GTAAAACGACGGCCAGTTCWACWAAYCAYAARGAYAT YGG-3’，R:5’-CAGGAAACAGCTATGACGWARAA TWARAATRTAWACYTCDGG-3’。以總DNA為模板，通用引物參考GenBank上已發(fā)表的粒脈蠟蟬科昆蟲的引物序列設計，T100TMThermal Cycler型PCR擴增儀進行線粒體COⅠ基因片段的擴增，反應總體積為30 μL:上、下游引物各1 μL，DNA模板3 μL，Taq PCR Master Mix 25 μL；94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，53 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR樣品經檢測合格后送上海生工生物科技有限公司雙向測序。

1.2.3COⅠ基因序列處理，遺傳距離的計算及系統(tǒng)發(fā)育樹的構建運用DNA Star 5.0對測序所得序列進行拼接和校對，利用MEGA 6.0計算遺傳距離，并運用鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)構建系統(tǒng)發(fā)育樹(Tamuraetal.，2013；丁永順等，2018)。

1.2.4 危害狀況觀察2017年8月—2019年1月，在貴州省威寧縣草海國家級自然保護區(qū)對黑粒脈蠟蟬的危害狀況進行研究，以晴天觀察為宜，通過目測和掃網的方式進行，記錄危害狀況并拍照。

2 結果與分析

2.1 形態(tài)學特征

2.1.1 卵(圖1：A)卵長0.39～0.42 mm，寬0.23～0.29 mm；長橢圓形，黃色。

2.1.2 若蟲(圖1：B～F;表2)

1齡若蟲(圖1：B)

體長：0.45～0.54 mm，體寬：0.28～0.32 mm。

體色：體灰白色，初孵若蟲身體偏透明，可見蟲體內腹部部分器官，大多外形輪廓明顯，胸、腹部可明顯區(qū)分；復眼較小，卵圓形，血紅色。

頭部：頭頂較小，前、后緣近平直，側脊上具感覺窩，中側脊與基緣相交；額長大于寬，側脊具感覺窩13～14個；唇基三角形，喙長，末端超過腹中部或到達腹部末端。觸角短，第1節(jié)寬大于長，其上具多個感覺器官，鞭節(jié)最后1節(jié)筆尖狀，較其他節(jié)寬大。

胸部：前胸背板具有明顯的輪廓，前胸背板呈“八”字形位于兩側，側脊較模糊，每側具11個感覺窩，其中內緣內側各具1個，后側角各具3個，前緣3個，后緣4個；中胸背板較小，沒有側脊，后緣較平直，沒有明顯的翅芽，兩側各具4個感覺窩，1個距離內緣較近，2個位于中部，相距較遠，1個靠近外緣；后胸背板較中胸背板寬大，兩側分別具3個感覺窩，彼此相距較遠，后足刺式為4-3-1。

腹部：具9個腹節(jié)，第4腹節(jié)最寬，依次向兩側變窄，第1～3、9腹節(jié)不具感覺窩，第4～8腹節(jié)兩側各具2個感覺窩。

2齡若蟲(圖1：C)

體長：0.56～0.76 mm，體寬：0.35～0.41 mm。

體色：體灰黃色，復眼紫紅色。

額側脊具15～16個感覺窩；觸角比1齡若蟲稍長；前胸背板具14個感覺窩，后側角各具4個，前緣5個，側脊明顯存在；中胸背板具7個感覺窩，2個距離內緣較近，4個感覺窩分別以2個相距較近的形式位于中部，側脊較明顯；后胸背板具4個感覺窩，且彼此間都相距較遠，側脊較模糊；后足刺式為4-3-2；第4～7腹節(jié)兩側各具3個感覺窩，第8腹節(jié)具2個感覺窩。

3齡若蟲(圖1：D)

體長：0.92～1.03 mm，體寬：0.51～0.60 mm。

表2 黑粒脈蠟蟬各齡期形態(tài)特征比較Table 2 Comparison of morphological characteristics of Nisia fuliginosa at different stages

體色：體棕黃色，復眼紫紅色。

側脊具17～18個感覺窩；觸角每節(jié)都比2齡若蟲稍寬稍長；前胸背板具17個感覺窩，后側角各具6個，前緣6個；中胸背板具13個感覺窩，3個距離內緣較近，3個感覺窩靠近側脊，前側角分布3個，后側角分布2個，中下部具2個，側脊明顯存在；后胸背板具5個感覺窩，側脊外側具2個，側脊不明顯；前、后翅翅芽開始形成；后足刺式為5-4-3；第4～7腹節(jié)兩側各具5個感覺窩，第8腹節(jié)具 4個感覺窩。

4齡若蟲(圖1：E)。

體長：1.02～1.47 mm，體寬：0.64～0.87 mm。

體色：體黑棕色，復眼紫紅色。

側脊具19～20個感覺窩；觸角每節(jié)都比3齡若蟲稍寬稍長；前胸背板具20個感覺窩，后側角各具8個，前緣7個；中胸背板具16個感覺窩，4個距離內緣較近，4個靠近側脊，前側角分布3個，后側角分布3個，中下部具2個；后胸背板具6個感覺窩，側脊外側具3個，側脊明顯存在；前翅翅芽比3齡若蟲長1.16倍，后翅翅芽比3齡若蟲長 1.08倍；后足刺式為8-6-5；第4～7腹節(jié)兩側各具7個感覺窩，第8腹節(jié)具4個感覺窩。

5齡若蟲(圖1：F)。

體長：1.55～2.03 mm，體寬：0.93～1.26 mm。

體色：體黑棕紫色，復眼內層紫色，外層銀白色。

側脊具19～20個感覺窩；觸角每節(jié)都比4齡若蟲稍寬稍長；前胸背板具22個感覺窩，后側角各具9個，前緣8個；中胸背板具19個感覺窩，5個距離內緣較近，5個靠近側脊，前側角分布3個，后側角分布3個，中上部具3個；后胸背板具7個感覺窩，側脊外側具4個，側脊明顯存在；前翅翅芽比3齡若蟲長1.31倍，后翅翅芽比3齡若蟲長 1.59倍；后足刺式為10-7-6；第4～7腹節(jié)兩側各具7個感覺窩，第8腹節(jié)具4個感覺窩。

2.1.2 成蟲(圖2：A～E,圖3：A～G,圖4：A～F)體長(頭頂端部至前翅末端)：♂3.1～4.95 mm(n=21)，♀ 3.6～5.12 mm(n=12)。

體色：體黑褐色(活體狀態(tài)偏藍紫色)，被有稀薄白色蠟粉。頭頂、額、唇基黑褐色；復眼邊緣部分黃色，中部黑褐色；單眼棕黃色；前翅栗褐色，翅脈黑褐色；后翅污白色，翅脈褐色；足棕褐色；腹部黑色，側膜黃色。

頭、胸部：頭部(圖2：A，D)明顯窄于前胸背板，頭頂基寬約為中長的2倍，端緣深凹呈“U”字形，側脊高度隆起，兩側分離，其上密布感覺窩，中側脊與基緣會合于中部，形成2個小三角室。額(圖2：C)長約為基寬的2倍，側脊高聳，具大量感覺窩，無中脊，中單眼位于近端部中央，側單眼(圖2：E)位于觸角偏右上方；唇基三角形，無側脊，中脊明顯，到達端部，基部寬；喙長，末端伸達或超過腹部中部，端節(jié)長大于寬。觸角第1節(jié)較寬短，圓柱形，寬約為長的2倍，第2節(jié)長為寬的1.2倍，約為第1節(jié)的3.5倍。前胸背板(圖2：D)寬為長的4.8倍，前緣至近中部略拱，后緣凹入，中脊較模糊，側脊較中脊長且呈粗隆起。中胸背板長為前胸背板的3.2倍，中脊明顯，側脊消失或較模糊。前翅(圖3：A)長條形，前緣弧形，長為寬的2.2倍，Sc+R脈下部具約20個顆粒，爪脈兩側分別排列12～15個顆粒，翅面見缺脈現(xiàn)象。后翅(圖3：C)翅脈較簡單，A2沒有伸達翅緣；后足刺式為10-8-6。

雄性外生殖器：尾節(jié)側面觀(圖3：E)棕黑色，腹緣約為背緣的2.3倍，前緣向后凹成弧形，后緣中部具一圓弧形突起，該突起下部顏色較上部深，上部具大量感覺窩，且具些許剛毛；肛節(jié)側面觀(圖3：E)端部向下形成2個齒狀突起，肛刺突細長，端部較基部稍寬；背面觀(圖3：B)兩側緣近乎平行，兩側基部具大量感覺窩和剛毛，彎成勺狀并相互連接，連接處肛刺突形成一舌狀突起。生殖刺突腹面觀(圖3：F，G)粗大，外緣1/4處開始膨大，端部外緣骨化，內緣1/4處彎成鈍角狀，約2/3處有一指狀突起，后向外緣彎曲，透明狀，但輪廓較清楚，具許多感覺窩和些許剛毛。陽莖(圖3：D)黃褐色，中部由一長條結構圍成圓圈狀，上部由2個片狀結構組成，外側結構外緣1/4處有一刺狀突起，3/4處突然向前彎曲，彎曲處有3、4個小刺狀突起，背側結構中部顏色深，腹側透明狀；下部具 3個連接結構，第2個連接結構頂端具一管狀結構，第3個連接結構較其他2個結構都長，且末端具一膜狀結構。

雌性生殖器：生殖節(jié)側面觀(圖4：A)棕黑色，內外緣彎曲；生殖節(jié)后面觀(圖4：B)上面部分呈三角形，下部分兩側緣分別向內彎成弧形，第一產卵瓣被第三產卵瓣包裹住，頂端具一鉤狀突起，第二產卵瓣和肛刺突位于近中部。肛節(jié)背面觀(圖4：F)端部較基部窄，肛刺突端部較粗；第三產卵瓣(圖4：A，E)不規(guī)則葉狀，基部向內彎曲形成一個鈍角狀突起，其上具大量感覺窩和剛毛；第一產卵瓣(圖4：A，D)扇形，末端具一小鉤突起，其上具大量感覺窩和剛毛；第二產卵瓣(圖4：B，C)結構較復雜，后面觀可見下部分近中部凹入，端部向外彎成鉤狀；上部分端部形成3個突起，中部較寬大，鈍圓形，外側形成2個細指狀突起，基部向下形成2個指狀突起。

檢視標本：共計296頭黑粒脈蠟蟬成蟲標本，若蟲標本82頭。23♂♂37♀♀，貴州威寧草海，2016-Ⅵ-20，姚亞林，李洪星采；43♂♂45♀♀，貴州威寧草海，2017-Ⅷ-1～2，陳祥盛，王英鑒采；1♂3♀♀，貴州威寧草海，2017-Ⅸ-4～5，趙正學，黃秀東采；32♂♂44♀♀，貴州威寧草海，2018-Ⅷ-13～17，隋永金，李洪星采；26♂♂42♀♀，若蟲22頭，貴州威寧草海，2018-Ⅸ-21，呂莎莎，汪潔采；若蟲37頭，貴州威寧草海，2018-Ⅹ-20，呂莎莎，鄧敏采；若蟲23頭，貴州威寧草海，2019-Ⅰ-19，呂莎莎，周治成采(地理坐標：104°10′16″～104°20′40″E，26°47′32″～26°52′52″N)。12頭Nisiasp.成蟲標本，5♂♂7♀♀，貴州荔波茂蘭，2018-Ⅹ-20，陳祥盛，周治成采(地理坐標：107°37′～108°18′E，25°7′～25°9′N)。

2.2 COⅠ序列分析結果

2.2.1 堿基組成分析利用MEGA 6.0對本研究所獲COⅠ基因序列及NCBI中下載序列(KF227255)共8條COⅠ基因序列的堿基組成進行分析。結果顯示，該COⅠ基因序列長度為587 bp，共檢測到保守位點(C) 456個、變異位點(V)131個、簡約信息點(PI)33個、自裔位點(S)98個，保守位點約占總序列的77.68%，變異位點約占總序列的22.32%；其中，A、T、G、C堿基平均含量分別為34.4%、35.1%、11.9%、18.6%，A+T含量約為G+C含量的2.3倍，表現(xiàn)出明顯的A+T堿基偏倚，且A與T含量大致相當，堿基組成符合昆蟲線粒體COⅠ基因的特征(Liu & Beckenbach，1992)。

2.2.2 遺傳距離利用MEGA 6.0對黑粒脈蠟蟬卵、若蟲及成蟲和其他2種粒脈蠟蟬昆蟲共8個序列進行遺傳距離分析，結果顯示(表3)，黑粒脈蠟蟬種內遺傳距離為0，3種粒脈蠟蟬科昆蟲種間遺傳距離為0.166 8～0.236 1，種間平均遺傳距離為0.201 5，種間遺傳距離顯著大于種內遺傳距離且相互間不存在重疊現(xiàn)象。

2.2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析根據(jù)測序結果及NCBI中下載序列(KF227255)，以Nisiasp.和Phaconeurasp.為外群，運用NJ法構建分子系統(tǒng)發(fā)育樹。結果顯示，黑粒脈蠟蟬卵、若蟲和成蟲6個樣品的COⅠ序列能較好地聚為一支，而后與Nisiasp.相聚，Phaconeurasp.位于樹的基部。從系統(tǒng)發(fā)育樹中可以看出，黑粒脈蠟蟬不同齡期COⅠ基因序列差異較小，驗證了黑粒脈蠟蟬各蟲態(tài)的對應關系，且可以較好地與其他種類區(qū)分(圖5)。

表3 3種粒脈蠟蟬科昆蟲COⅠ基因序列的遺傳距離Table 3 Genetic distances of the COⅠ gene of 3 meenoplid species

2.3 危害狀況

黑粒脈蠟蟬在水蔥所有生長發(fā)育期都能造成危害，主要是成蟲及若蟲群集在水蔥莖稈中下部刺吸汁液(圖6：A)，掠奪植株營養(yǎng)，使植株缺失養(yǎng)分，且表面留下傷痕；雌成蟲(圖6：B)用產卵器刺破植物組織在其內產卵，并分泌蠟絲將卵包裹起來，外觀只見蠟絲；成蟲和若蟲會分泌大量蜜露(圖6：C)和蠟絲(圖6：D)，嚴重阻礙植株光合作用，影響植株長勢，致使植株黃化，甚至引起植株的死亡，并為真菌和細菌的大量繁殖提供了有利條件。

3 討論

粒脈蠟蟬科昆蟲除了取食多種雜草外，還危害多種經濟作物。四合木Tetraenamongolica是國家Ⅱ級重點保護植物且為單屬種，粒脈蠟蟬被報道是其葉片上的重要吸食類害蟲(趙偉，劉強，2010，2011)；粉白粒脈蠟蟬N.atrovenosaLethierry是雜草地生境中危害水稻Oryzasativa的優(yōu)勢種害蟲(李志勝，2002)；澳洲粒脈蠟蟬N.australiensisWoodward危害香附子Cyperusrotundus和竹節(jié)花Dianthuschinensis，加羅林粒脈蠟蟬N.carolinensisFennah危害香附子和水稻(胡春林，楊蓮芳，1993)。本文報道的黑粒脈蠟蟬在其模式標本產地云南思茅地區(qū)主要在雜草上取食，而本研究調查發(fā)現(xiàn)黑粒脈蠟蟬在貴州威寧草海地區(qū)只在水蔥上危害，成蟲喜在近水面潮濕的水蔥中下部危害，若蟲聚集在近根部危害，一般較難被發(fā)現(xiàn)，當受到驚嚇時，會跳離水蔥植株，停留在水面些許時間。成、若蟲都能分泌蠟絲和蜜露，雌成蟲在莖稈上產卵后會分泌蠟絲將卵包裹在其中，以保護卵不受到外界環(huán)境影響。

比較形態(tài)學研究發(fā)現(xiàn)，采自貴州威寧草海的黑粒脈蠟蟬，其雄性生殖器結構陽莖外側外緣彎曲處有2～4個小刺狀突起，而采自云南思茅地區(qū)的黑粒脈蠟蟬則沒有該刺狀突起，其余形態(tài)結構無明顯區(qū)別。據(jù)統(tǒng)計，目前粒脈蠟蟬屬全世界共記錄22種，中國記錄5種，其中，粉白粒脈蠟蟬分布于陜西、貴州、云南、四川、浙江、福建、湖南等多地，澳洲粒脈蠟蟬和加羅林粒脈蠟蟬目前僅臺灣有記錄，黑粒脈蠟蟬目前只在云南、貴州有分布記錄，條紋小粒脈蠟蟬N.striataYang & Hu目前只在云南有記錄。由此判斷，通過深入的調查采集，應該還有新種待發(fā)現(xiàn)和描記。

本研究中，黑粒脈蠟蟬的卵、若蟲及成蟲基于線粒體COⅠ基因序列的種內遺傳距離為0，遠小于3種粒脈蠟蟬科昆蟲種間遺傳距離0.201 5，驗證了卵、若蟲與成蟲三者之間的一一對應關系?；贑OⅠ條形碼序列系統(tǒng)發(fā)育分析，可明顯看到黑粒脈蠟蟬6個樣品很好地聚為一支，后與Nisiasp.相遇，Phaconeurasp.位于樹的根部。證實線粒體COⅠ基因片段可作為黑粒脈蠟蟬及其近緣類群物種的DNA條形碼，能較好地實現(xiàn)對水蔥害蟲黑粒脈蠟蟬各蟲態(tài)(尤其是卵和若蟲)準確、快捷的分子鑒定。