劉京，李仕澤，程彥林，陳龍，張霞，魏剛

(1.茅臺(tái)學(xué)院資源環(huán)境系，貴州仁懷564500； 2.貴陽(yáng)學(xué)院生物多樣性保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng)550002)

掌突蟾屬Leptobrachella廣泛分布于亞洲大陸東南部，包括中國(guó)南部及印度東北部及東南亞群島等，目前該屬已報(bào)道82種(Frost, 2020)，其中，中國(guó)記錄分布26種，貴州省記錄分布8種，分別為峨山掌突蟾L.oshanensis、蟼掌突蟾L.pelodytoides、福建掌突蟾L.liui、腹斑掌突蟾L.ventripunctata、畢節(jié)掌突蟾L.bijie、紫腹掌突蟾L.purpuraventra、綏陽(yáng)掌突蟾L.suiyangensis和赤水掌突蟾L.chishuiensis(中國(guó)兩棲類，2020)。峨山掌突蟾主要分布在貴州印江、雷山、羅甸、江口等地(伍律等，1986；魏剛等，2017)，蟼掌突蟾主要分布在貴州安龍和雷山等地(伍律等，1986)，福建掌突蟾分布在貴州東南部雷山等地(費(fèi)梁等，2012)，腹斑掌突蟾分布在貴州西北部習(xí)水等地(李光榮等，2016)，畢節(jié)掌突蟾和紫腹掌突蟾分布在貴州畢節(jié)等地(Wangetal.，2019)，綏陽(yáng)掌突蟾分布在貴州綏陽(yáng)(Luoetal.，2020)，赤水掌突蟾分布在貴州赤水(Lietal.，2020)。

2016年4月4日在江口縣梵凈山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)(108°46′8.07″E，27°50′56.77″N，海拔539 m)進(jìn)行兩棲動(dòng)物調(diào)查時(shí)，采集到掌突蟾屬成體標(biāo)本1號(hào)(表1)。2016年6月6日，在雷山縣雷公山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)(108°11′47.2″E，26°22′42.24″N，海拔1 687 m)進(jìn)行兩棲動(dòng)物調(diào)查時(shí)，采集到掌突蟾屬成體標(biāo)本1號(hào)(表1)。經(jīng)形態(tài)學(xué)比較和系統(tǒng)發(fā)育分析，鑒定為武陵掌突蟾Leptobrachellawulingensis，為貴州省兩棲動(dòng)物分布新記錄種。本文對(duì)其形態(tài)特征及生態(tài)習(xí)性進(jìn)行描述，并初步探討其形態(tài)特征的地理變異，為掌突蟾屬物種的系統(tǒng)學(xué)和譜系地理學(xué)研究提供了新信息。

表1 樣品信息表Table 1 Samples used in this study and GenBank accession numbers for sequences

1 材料與方法

1.1 材料

2號(hào)標(biāo)本取肌肉組織存于95%乙醇中，標(biāo)本浸泡于10%福爾馬林溶液中，保存于茅臺(tái)學(xué)院生物學(xué)標(biāo)本室。

1.2 形態(tài)鑒定與測(cè)量

對(duì)2號(hào)標(biāo)本使用游標(biāo)卡尺(無(wú)錫錫工量具有限公司；量程200 mm，精度0.1 mm)進(jìn)行測(cè)量，測(cè)量依據(jù)《中國(guó)兩棲動(dòng)物檢索及圖鑒》(費(fèi)梁等，2005)，并參照《中國(guó)兩棲動(dòng)物及其分布彩色圖鑒》(費(fèi)梁等，2012)進(jìn)行形態(tài)鑒定。

1.3 分子鑒定

以高鹽法提取保存于乙醇中的肌肉組織的DNA。利用引物P7和P8(Simonetal.，1994)擴(kuò)增16SrRNA基因部分片段并測(cè)序。PCR擴(kuò)增條件和步驟參照Chen等(2017)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后，大小符合要求的產(chǎn)物交上海生工生物公司測(cè)序。所得序列上傳到GenBank。

在GenBank中下載掌突蟾屬部分物種16SrRNA基因，結(jié)合本次采集標(biāo)本所測(cè)序列，進(jìn)行分子系統(tǒng)發(fā)育分析。以騰沖擬髭蟾Leptobrachiumtengchongense、華深擬髭蟾Leptobrachiumhuashen和大角蟾Megophrysmajor為外群(Lietal.，2020)。所有序列在Clustal X v1.8(Thompsonetal.，1997)中進(jìn)行比對(duì)，采用貝葉斯法(Bayesian-Inference，BI)重建系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。建樹(shù)之前，利用jModeltest v2(David，2008)基于AIC標(biāo)準(zhǔn)選擇最適核苷酸替代模型。貝葉斯法運(yùn)算中馬爾科夫鏈的蒙特卡羅方法(Markov chain Monte Carlo process)設(shè)置為4條鏈(3條冷鏈1條熱鏈)同時(shí)運(yùn)行，共運(yùn)行10 000 000代，每100代抽樣一次，共得到100 001個(gè)樣本及其相對(duì)的似然值和模型參數(shù)。在運(yùn)行500 000代后，似然值趨于穩(wěn)定，舍棄最初的500 000代(5 000個(gè)樣本)，剩余的樣本構(gòu)建一致樹(shù)，并獲得系統(tǒng)樹(shù)的支系結(jié)構(gòu)和各支系的后驗(yàn)概率。用MEGA v6.0(Tamuraetal.，2013)中的Kimura雙參數(shù)模型計(jì)算表1中所列掌突蟾屬物種間的遺傳距離。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)描述

本次采集的2號(hào)標(biāo)本(JK20160404001♂、LS20160610007♀)均為成體，體型中等，雄性體長(zhǎng)31.0 mm，雌性體長(zhǎng)32.2 mm，其他部位量度見(jiàn)表2。頭長(zhǎng)小于頭寬，吻端略凸出于下唇。鼓膜清晰可見(jiàn)，圓形，稍凹陷；無(wú)犁骨齒，舌后有缺刻；鼻間距長(zhǎng)于眼間距。眼角圓潤(rùn)，瞳孔縱置，上半部分有明亮的金色虹膜，下半部虹膜呈銀色。指端圓且稍膨大，手指無(wú)蹼和指?jìng)?cè)緣膜，指長(zhǎng)序?yàn)?<2≈4<3，掌突2，橢圓形，內(nèi)掌突大，外掌突略小。趾端圓形略膨大，趾間有蹼跡，趾側(cè)緣膜狹窄，趾長(zhǎng)序?yàn)?<2<5<3<4。后肢纖細(xì)，左右跟部輕微重疊，后肢貼體前伸時(shí)跗關(guān)節(jié)到達(dá)眼中部。無(wú)婚墊和關(guān)節(jié)下瘤。

表2 貴州省采集的武陵掌突蟾成體標(biāo)本形態(tài)量度Table 2 Morphometric measurements of adult Leptobrachella wulingensis from Guizhou Province

體背部灰褐色，有明顯的暗褐色斑點(diǎn)，散布有不規(guī)則的淺橙色色斑。背部皮膚粗糙，有稀疏的大疣粒。吻背部有不明顯的“Y”形斑紋。四肢背面為深棕色橫條紋，腹股溝至腋窩兩側(cè)為明顯的深棕色斑點(diǎn)，縱向排列成2列；肘部和上臂有深棕色條紋和明顯的銅黃色；手指和腳趾有明顯的深棕色條紋。四肢腹面呈灰紫色，腋上腺、股、胸、腹側(cè)腺清晰可見(jiàn)，呈乳白色(圖1)。

比較此次所采集的掌突蟾標(biāo)本和其他掌突蟾屬物種的形態(tài)鑒定特征，發(fā)現(xiàn)本次采集的標(biāo)本形態(tài)特征與武陵掌突蟾模式產(chǎn)地標(biāo)本相符。

2.2 系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和遺傳距離

PCR擴(kuò)增獲得的掌突蟾線粒體16SrRNA基因片段長(zhǎng)度為495 bp，T、C、A、G含量分別是24.6%、24.6%、30.2%、20.6%，A+T含量高于G+C。本文所用最適核苷酸替代模型為GTR+G+I。

基于貝葉斯構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示，來(lái)自貴州梵凈山和雷公山的掌突蟾標(biāo)本與武陵掌突蟾模式產(chǎn)地(湖南省張家界天全山森林公園)的標(biāo)本聚為一支，且有較高的支持率(0.94)(圖2)?；贙imura雙參數(shù)模型估算本研究中所采用的掌突蟾屬部分物種的遺傳距離(表3)為3.3%～13.2%，平均遺傳距離為6.94%。梵凈山和雷公山所采的掌突蟾標(biāo)本與武陵掌突蟾模式產(chǎn)地標(biāo)本間的遺傳距離均為1.6%，遠(yuǎn)小于掌突蟾屬物種間的遺傳距離。通過(guò)形態(tài)比較，在梵凈山和雷公山采集的掌突蟾標(biāo)本與武陵掌突蟾原始描述(Qianetal.，2020)吻合，系統(tǒng)發(fā)育分析也支持采自貴州梵凈山和雷公山的掌突蟾標(biāo)本與武陵掌突蟾關(guān)系較近。

因此，結(jié)合形態(tài)比較與分子系統(tǒng)學(xué)分析結(jié)果，鑒定采集于貴州梵凈山和雷公山的掌突蟾標(biāo)本為武陵掌突蟾，為貴州省兩棲動(dòng)物分布新記錄。

2.3 生境描述

本次采集的武陵掌突蟾1號(hào)標(biāo)本來(lái)自梵凈山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)森林內(nèi)的溪溝旁(圖3：a)，與其同域分布的兩棲類有棘腹蛙Quasipaaboulengeri、棘指角蟾Megophrysspinata、華西雨蛙Hylaannectans、中華湍蛙Amolopssinensis、中華蟾蜍Bufogargarizans、武陵瘰螈Paramesotritonwulingensis等。另1號(hào)標(biāo)本采集于雷公山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)的溪溝旁(圖3：b)，與其同域分布的兩棲類有棘腹蛙、雷山角蟾Megophrysleishanensis、雷山髭蟾Vibrissaphoraleishanensis、中華湍蛙、中華蟾蜍和大樹(shù)蛙Zhangixalusdennysi等。

3 討論

掌突蟾屬物種在中國(guó)廣泛分布，大多數(shù)物種間形態(tài)較為相似，因此在野外很難對(duì)其進(jìn)行鑒定(費(fèi)梁等，2012)。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，采用形態(tài)比較結(jié)合分子系統(tǒng)學(xué)分析對(duì)物種進(jìn)行鑒定的方法已廣泛應(yīng)用。

目前貴州省記錄的掌突蟾屬物種有8種(中國(guó)兩棲類，2020)。本文通過(guò)GenBank下載貴州已有報(bào)道的掌突蟾及其近緣種的16SrRNA序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，計(jì)算遺傳距離，發(fā)現(xiàn)本文采集的標(biāo)本和貴州省有記載分布的紫腹掌突蟾、綏陽(yáng)掌突蟾、赤水掌突蟾、畢節(jié)掌突蟾、峨山掌突蟾、蟼掌突蟾、福建掌突蟾和腹斑掌突蟾的遺傳距離分別為4.4%、5.3%、5.5%、6.0%、6.7%、11.9%、12.6%和13.2%，和武陵掌突蟾模式產(chǎn)地標(biāo)本的遺傳距離僅為1.6%，且小于其他掌突蟾屬物種的遺傳距離。

表3 基于16S rRNA基因序列估算的掌突蟾屬物種間Kimura雙參數(shù)遺傳距離Table 3 Genetic distance under Kimura 2-parameter model on 16S rRNA gene of Leptobrachella species examined in the study

采自貴州梵凈山和雷公山的掌突蟾標(biāo)本與目前貴州記載的8種掌突蟾屬物種在形態(tài)上存在明顯的差異(表4)。趾基部有蹼跡和狹窄的趾側(cè)緣膜，區(qū)別于腹斑掌突蟾和峨山掌突蟾(無(wú)趾側(cè)緣膜)、福建掌突蟾(側(cè)緣膜較寬)和蟼掌突蟾(具1/4～1/3蹼，側(cè)緣膜寬)；后肢貼體前伸跗關(guān)節(jié)達(dá)眼中部，區(qū)別于赤水掌突蟾(跗關(guān)節(jié)達(dá)鼓膜)和腹斑掌突蟾(跗關(guān)節(jié)達(dá)鼓膜至眼后角)；體腹部白色，胸部和腹部前方有疣粒狀白色斑點(diǎn)，區(qū)別于紫腹掌突蟾(腹部灰紫色，有灰色斑點(diǎn))、腹斑掌突蟾(腹部有深褐色斑點(diǎn))和畢節(jié)掌突蟾(腹部有灰白色斑點(diǎn))；背部皮膚粗糙，有稀疏的大疣粒，區(qū)別于綏陽(yáng)掌突蟾、腹斑掌突蟾、峨山掌突蟾背部無(wú)大疣粒。背側(cè)有明顯標(biāo)記，區(qū)分于貴州分布所有掌突蟾。側(cè)腹部有黑點(diǎn)，區(qū)分于峨山掌突蟾和蟼掌突蟾的大的黑點(diǎn)。本次采集的掌突蟾標(biāo)本與武陵掌突蟾模式產(chǎn)地的形態(tài)上也存在一些差異，如頭寬大于頭長(zhǎng)，不同于模式產(chǎn)地的頭長(zhǎng)大于頭寬或幾乎相等的情況；皮膚呈灰棕色，不同于模式產(chǎn)地的體背部皮膚棕色或紅棕色。由于本次采集的武陵掌突蟾標(biāo)本數(shù)有限，上述差異是否為適應(yīng)不同環(huán)境而導(dǎo)致的形態(tài)變異，有待進(jìn)一步采集標(biāo)本進(jìn)行論證。

表4 貴州分布的掌突蟾屬物種形態(tài)特征比較Table 4 Morphological comparisons between the Leptobrachella species occurring from Guizhou Province

武陵掌突蟾為中國(guó)特有種，此前報(bào)道在我國(guó)的分布僅限于湖南省武陵山脈，包括張家界市天全山森林公園和天子山自然保護(hù)區(qū)，海拔為414～979 m的山區(qū)(Qianetal.，2020)。此次在貴州省江口縣梵凈山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)(采集地海拔539 m)和雷山縣雷公山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)(采集地海拔1 687 m)發(fā)現(xiàn)武陵掌突蟾，豐富了其分布信息，并拓寬了對(duì)該物種分布海拔的認(rèn)識(shí)。