馬朝陽

摘要：選擇性剪接是真核生物轉(zhuǎn)錄水平上的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。它是主要通過5種剪接模式，依靠剪接復(fù)合體刪減mRNA前體分子中內(nèi)含子并拼接外顯子，形成成熟mRNA的一個(gè)過程。通過對(duì)不同剪接位點(diǎn)的選擇，產(chǎn)生不同類型的剪接產(chǎn)物，大大增加蛋白質(zhì)的多樣性和基于表達(dá)的復(fù)雜程度。研究表明，植物體內(nèi)的選擇性剪接參與生長(zhǎng)發(fā)育過程，能夠調(diào)節(jié)機(jī)體生理功能的實(shí)現(xiàn)與否。

關(guān)鍵詞：選擇性剪接;剪接復(fù)合體;剪接因子;植物生長(zhǎng)

1.選擇性剪接的發(fā)現(xiàn)

選擇性剪接，又稱可變剪接（alternative splicing），指通過不同的剪接方式從mRNA前體分子（pre-mRNAs）中切除被稱為內(nèi)含子（intron）的非編碼區(qū)，并使基因中被稱為外顯子的（exon）的編碼區(qū)拼接為成熟mRNA的過程[1]。在RNA剪接過程中，機(jī)體如何正確識(shí)別內(nèi)含子的剪切位點(diǎn)并進(jìn)行剪接尤為重要。根據(jù)內(nèi)含子的堿基序列和潛在折疊方式的差異，剪接方式可以分為3種方式：pre-mRNA剪接、Ⅰ類和Ⅱ類自剪接內(nèi)含子。

從1977年，Sambrook 發(fā)現(xiàn)外顯子和內(nèi)含子的間隔排列而成之后，人們認(rèn)識(shí)到一個(gè)真核基因大多是斷裂的，必須去除內(nèi)含子連接外顯子才能發(fā)揮基因的作用[2]。1978年Gilbert[3]明確提出選擇性剪接這一概念后，選擇性剪接成為人們廣泛的研究領(lǐng)域。隨后大量的研究表明，選擇性剪接是一個(gè)存在于多細(xì)胞生物的普遍現(xiàn)象，真核生物的基因中內(nèi)含子所占比例很高，比如在人類萎縮性肌強(qiáng)直因子中超過99%。其中，植物前體mRNA選擇性剪接的研究最早追溯于1989年Wernekeetal.發(fā)現(xiàn)RCA基因在菠菜和擬南芥中均可發(fā)生選擇性剪接，以相同的剪切模式和剪接位點(diǎn)分別形成41、45kd和44、47kd兩個(gè)同源體[4]。

2.RNA可變剪接的模式

隨著人們對(duì)酵母和人類等的深入研究，了解到選擇剪接的模式主要分為以下5種：

①外顯子跳躍（exon skipping）：指的是外顯子遺漏性剪接，即當(dāng)一個(gè)外顯子連同它兩端的內(nèi)含子一起被剪接，而不能在成熟mRNA中出現(xiàn)時(shí)，我們說這個(gè)外顯子被跳過，結(jié)果是機(jī)體最終的成熟mRNA刪除了一個(gè)或幾個(gè)外顯子。

②互斥外顯子（mutually exclusive exons）：即相互排斥剪接，意思是一組外顯子只選擇其中之一剪接為成熟mRNA。

③5’端選擇性剪接（5’ Alternative splicing）：指可變的5’剪接位點(diǎn)與內(nèi)含子保守5’剪接位點(diǎn)相競(jìng)爭(zhēng)，且能與該內(nèi)含子的3’剪接位點(diǎn)相互作用發(fā)生選擇性剪接的過程。

④3’端選擇性剪接（3’ Alternative splicing）：可變的3’剪接位點(diǎn)與內(nèi)含子保守3’剪接位點(diǎn)相競(jìng)爭(zhēng)，且能與該內(nèi)含子的5’剪接位點(diǎn)相互作用發(fā)生選擇性剪接的過程。

⑤內(nèi)含子保留剪接（Intron reserved splicing）：在剪接過程中選擇性保留整個(gè)內(nèi)含子或部分內(nèi)含子序列，使其成為成熟 mRNA 的一部分[5]。

3.選擇性剪接的機(jī)制

3.1RNA序列決定剪接位點(diǎn)

比較不同真核生物基因的核苷酸序列，發(fā)現(xiàn)mRNA前體中內(nèi)含子區(qū)域存在共同序列，意味著這些序列可能是mRNA前體發(fā)生剪接的信號(hào)。內(nèi)含子的5’端剪接位點(diǎn)被稱為供體位點(diǎn)（donor site），3’端剪接位點(diǎn)被稱為受體位點(diǎn)（acceptor site）[6]。研究表明，細(xì)胞核mRNA前體內(nèi)含子的5’端邊界序列為GU，3’端邊界序列為AG，這種保守序列被稱為GU-AG法則（又稱Chambon法則），在所有剪接位點(diǎn)類型中所占比例為99.24%。除此之外，生物體內(nèi)也存在0.7%GC-AG型內(nèi)含子和0.05%[7]GU-AG型內(nèi)含子，兩者可能以相同的剪接機(jī)制參與剪接過程[4]。

進(jìn)一步研究表明，外顯子與內(nèi)含子的交界處序列，及內(nèi)含子內(nèi)部的部分序列也是保守序列，可能參與剪接位點(diǎn)的選擇。目前已知，3’端剪接位點(diǎn)AG附近有一段富含10—20個(gè)嘧啶核苷酸的區(qū)域（Py rich），5’端剪接位點(diǎn)GU附近有一保守序列（5’-GUPuAGU-3’）。同時(shí)，在距離3’端上游18-50個(gè)核苷酸處也存在一段保守序列，其中的腺嘌呤（A）在不同基因mRNA前體分子中都存在，且含有2’-OH，構(gòu)成了剪接過程中的分支點(diǎn)[8]。

參與剪接過程的裝置識(shí)別mRNA前體分子的剪接位點(diǎn)后，需要經(jīng)過兩步轉(zhuǎn)酯反應(yīng)才能完成整個(gè)過程。第一步：位于分支點(diǎn)的保守腺苷酸殘基的2’-OH對(duì)5’剪接位點(diǎn)的鳥苷酸磷酸基團(tuán)進(jìn)行親核攻擊，使得游離出來的5’磷酸基團(tuán)與2’-OH形成5’-2’磷酸二酯鍵，伴隨套索結(jié)構(gòu)（lariat form）的形成。第二步：外顯子3’端核苷酸的-OH親核攻擊內(nèi)含子3’端的磷酸基團(tuán)，使得內(nèi)含子在3’剪接位點(diǎn)斷裂，釋放套索結(jié)構(gòu)，促使兩個(gè)外顯子成功連接[6]。這兩個(gè)環(huán)節(jié)重復(fù)一次，一個(gè)完整的內(nèi)含子被切除，直至完成mRNA的剪接工作。

3.2剪接復(fù)合體的組分及功能

參與上述轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的裝置是剪接復(fù)合體（spliceosome），它是介導(dǎo)內(nèi)含子剪接位點(diǎn)準(zhǔn)確識(shí)別的保障，主要組分是核小RNA蛋白復(fù)合體（small nuclear ribonucleo-protein particle，snRNP）和其他多種蛋白質(zhì)因子[9]。研究表明，剪接復(fù)合體包含約150種蛋白質(zhì)和5種RNA，核小RNA蛋白復(fù)合體由U1、U2、U4/U6和U5的5種核小RNA（small nuclear RNA，snRNA）和與這些RNA相結(jié)合的蛋白質(zhì)組成，每種snRNA長(zhǎng)度大約100—300bp核苷酸[8]。除U6外，每個(gè)snRNA均含有一個(gè)3’端甲基鳥苷帽子結(jié)構(gòu)，存在特定的保守序列[10]。

snRNP在剪接過程發(fā)揮著重要作用，其作用過程如下：U1snRNA以堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式與5’端剪接位點(diǎn)結(jié)合，U2snRNA與3’端剪接位點(diǎn)上游的分支點(diǎn)結(jié)合，進(jìn)而形成剪接前體（pre-spliceosome）。U2snRNA的結(jié)合需要輔助因子U2AF（U2 auxiliary factor）的引導(dǎo)，U2AF由分子量為65kDa和35kDa的兩個(gè)亞基組成，65kDa亞基結(jié)合在3’端剪接位點(diǎn)AG附近的富嘧啶區(qū)，35kDa亞基結(jié)合在3’端剪接位點(diǎn)AG保守序列處[11]。接著，剪接前體進(jìn)一步與U4、U5、U6-snRNP三聚體相結(jié)合，組裝成60S的剪接復(fù)合體，從而通過兩步轉(zhuǎn)酯反應(yīng)完成整個(gè)pre-mRNA的剪接過程。

3.3剪接因子調(diào)控選擇性剪接

除去核小RNA蛋白復(fù)合體，剪接復(fù)合體中的其他多種蛋白質(zhì)因子都參與剪接因子的形成。這包括富含精氨酸和絲氨酸的蛋白（Ser-Arg rich protein，SR蛋白）、hnRNP、RNA螺旋酶、激酶等。

目前研究表明，SR蛋白家族十分龐大。高等生物體內(nèi)參與剪接過程的具有RS結(jié)構(gòu)域的蛋白約有50種，并且依據(jù)它們各自結(jié)構(gòu)域的特征和功能，可以大致分為3類：①7種經(jīng)典SR蛋白——此類蛋白C端為SR結(jié)構(gòu)域，N端為1至2個(gè)RRM （RNA-recognition motif）;②SR類似蛋白：③其他含有RS結(jié)構(gòu)域的蛋白[12]。SR蛋白家族調(diào)控的機(jī)制是改變其在剪接復(fù)合體中的位置，選擇性識(shí)別和結(jié)合5’端和3’端剪接位點(diǎn)，從而調(diào)控選擇性剪接。過程基本如下：SR蛋白家族能夠與外顯子或內(nèi)含子的順式作用元件識(shí)別，如外顯子剪接增強(qiáng)子（ exon splicing enhancer，ESE）、內(nèi)含子剪接增強(qiáng)子（intronic splicing enhancer，ISE）、外顯子剪接沉默子（ exon splicing silencer，ESS）和內(nèi)含子剪接沉默子（intronic splicing silencer，ISS），從而增強(qiáng)或減弱其對(duì)5’端和3’端剪接位點(diǎn)的識(shí)別的作用[13]。比如，SR蛋白結(jié)合到ESE上，不僅能夠促進(jìn)U1snRNP 對(duì)mRNA前體5’端剪接位點(diǎn)的識(shí)別結(jié)合，還能加強(qiáng)與3’端剪接位點(diǎn)的U2AF的35kDa亞基的相互作用，促使U2snRNA的輔助因子U2AF 結(jié)合至3’端剪接位點(diǎn)，從而增強(qiáng)了U2snRNA對(duì)分支點(diǎn)的結(jié)合能力[14]。

核不均一核糖核蛋白（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein，hnRNP）是由分子量為58kD的多聚嘧啶區(qū)域結(jié)合蛋白（PTB）和RNA組成，參與mRNA的剪接過程[15]。由于PTB能夠與U2AF競(jìng)爭(zhēng)3’端剪接位點(diǎn)上游的富核苷酸的區(qū)域，使得hnRNP具有抑制剪接的作用。

4.選擇性剪接參與植物生長(zhǎng)發(fā)育

植物中，選擇性剪接的具體功能涉及抗病及應(yīng)對(duì)非生物環(huán)境壓力、發(fā)育調(diào)節(jié)等多個(gè)方面。以擬南芥為例，選擇性剪接體現(xiàn)在以下幾種生長(zhǎng)發(fā)育的過程中：①參與春化誘導(dǎo)的開花過程和生物鐘調(diào)節(jié)過程;②對(duì)抗植物所處環(huán)境的高鹽、低溫、高溫、干旱、重金屬等非生物因素的脅迫;③防御機(jī)體免受各種病原體（包括病毒，真菌，細(xì)菌，昆蟲等）的生物攻擊;④參與半自主性細(xì)胞器葉綠體、線粒體種基因的選擇項(xiàng)剪接，發(fā)揮其特定功能。

具體來說，當(dāng)外界環(huán)境發(fā)生變化時(shí)，植物由于自身固著生長(zhǎng)的屬性，不能像動(dòng)物那樣可以躲避或遷徙以規(guī)避各種逆境的傷害，所以在其進(jìn)化的過程中形成了適應(yīng)逆境的機(jī)制，選擇性剪接便是極為重要的一種。研究表明，選擇性剪接可以在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子、轉(zhuǎn)錄因子、剪接因子和抗逆功能蛋白等4個(gè)層面相互協(xié)調(diào)，調(diào)控植物抗逆基因的表達(dá)。比如，與鹽脅迫相關(guān)的擬南芥SOS4（salt overly sensitive 4）基因以及水稻OsTM基因編碼的產(chǎn)物分別與調(diào)節(jié)Na+和 K+的動(dòng)態(tài)平衡和清除活性氧有關(guān)，它們都可發(fā)生選擇性剪接產(chǎn)生2個(gè)轉(zhuǎn)錄本，2個(gè)轉(zhuǎn)錄本之間的含量比值受鹽脅迫的調(diào)控[16]。

除此之外，植物的生長(zhǎng)發(fā)育各個(gè)階段都伴隨著選擇性剪接過程的發(fā)生，其中較為典型的是發(fā)揮生物鐘調(diào)節(jié)作用，因此選擇性剪接被又稱為植物體中的溫度計(jì)。比如，擬南芥的生物鐘受到多個(gè)基因的協(xié)同調(diào)控作用，其中CCA1/LHY 和TOC1是重要的三個(gè)調(diào)節(jié)基因[17]。

5.展望

選擇性剪接以剪接復(fù)合體為主要裝置，在剪接因子參與調(diào)控的背景下，通過兩步轉(zhuǎn)酯反應(yīng)，形成5種選擇性剪接的模式，使一個(gè)基因可以產(chǎn)生多個(gè)轉(zhuǎn)錄本和多個(gè)蛋白產(chǎn)物，大大增加蛋白質(zhì)的多樣性和基于表達(dá)的復(fù)雜程度。這是選擇性剪接的基本功能。但總體上看，比起對(duì)動(dòng)物基因的研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，自然界植物中僅有少量基因選擇性剪接功能比較清楚，很多未知的剪接變體尚未發(fā)現(xiàn)，已知剪接變體的具體功能也并不完全了解。隨著轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)水平的提高，越來越多的剪接變體將會(huì)被發(fā)現(xiàn)，認(rèn)識(shí)到這些不同剪接變體的具體功能有助于理解基因功能多樣性，也是今后研究選擇性剪接參與植物生長(zhǎng)發(fā)育過程功能的一個(gè)重要方向。

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指導(dǎo)老師：金燕